在三维环境中表征细胞迁移 体外 伤口环境

摘要

本实验方案的目的是评估促迁移和抗迁移因子对细胞在三维纤维蛋白基质中迁移的影响。

摘要

目前，大多数 体外 伤口愈合模型，例如已广泛建立的划痕实验，涉及在二维表面上研究细胞迁移和伤口闭合。然而，其生理环境 体内 伤口愈合发生在三维而非二维环境中。越来越多的研究表明，细胞在二维与三维环境中的行为存在显著差异；因此，迫切需要更符合生理实际情况的 体外 用于研究细胞迁移行为在伤口闭合中的模型。本文所述方法可实现对三维模型中细胞迁移的研究，相较于传统的二维划痕实验，该模型更接近生理条件。本模型旨在通过检测细胞从嵌入纤维蛋白基质中的球状体向外迁移的情况，评估促迁移或抗迁移因素存在下的细胞外向生长。利用该方法，可在三维基质中观察球状体的细胞外向生长，并通过明场显微镜观察及对球状体面积的分析，实现随时间变化的简便定量。该系统还可用于评估促迁移和/或抑制性因素对细胞迁移的影响。该方法为研究人员提供了一种简单有效的手段，用于分析细胞在三维伤口相关基质中的迁移行为 体外，从而提高其相关性 体外 使用前的细胞研究 体内 动物模型

引言

伤口愈合是一个复杂的过程，可在组织受损后恢复其完整性。该过程分为四个相互重叠的阶段：止血、炎症、增殖和重塑，每个阶段均由可溶性信号分子、细胞-基质相互作用和细胞间通讯的复杂组合所调控。^1,2 这些信号的协调控制着伤口愈合过程中的多种细胞反应，其中尤为重要的是细胞迁移。^3,4 细胞迁移是一个高度动态的过程，依赖于细胞表型以及细胞外基质微环境的生物化学和生物物理特性。⁵ 细胞通过整合素介导的通路持续探测其细胞外基质环境，该过程使细胞能够感知多种基质特性，包括拓扑结构、刚度和空间限制。对细胞迁移的二维（2D）分析表明，迁移由前缘处片状伪足的形成所驱动，该过程依赖于肌动蛋白丝束的生成。随后在前缘形成局灶性黏附，结合肌动蛋白-肌球蛋白介导的收缩以及尾端回缩，共同推动细胞向前运动。⁶ 三维（3D）细胞迁移目前尚不被充分理解，然而，最近的研究表明，3D迁移与前述的二维（2D）迁移机制存在显著差异，可能由不同的机制驱动。例如，Petrie等人的近期研究显示 等研究表明，根据细胞外基质（ECM）的特性，三维基质中的细胞可在片状伪足和叶状伪足驱动的迁移机制之间转换。⁷

方案

1. 第1天：细胞与试剂准备

注意：所有细胞和试剂的准备均应在生物安全柜中进行，以防止样本污染。

1. 将过滤后的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素置于 37 °C 水浴中预热。
2. 通过向预热的 DMEM 中添加 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺，配制新生人真皮成纤维细胞（HDFn）培养基。
3. 解冻一管冻存的 HDFn 细胞，在 200 × g 条件下离心 8 分钟以去除冷冻保存液。将细胞重悬于已配制的 HDFn 培养基中，细胞密度为 1 × 10⁶ 个细胞/mL，并接种至 T-75 培养瓶中。
4. 将培养瓶放入培养箱（37 °C，5% CO₂）中，使细胞增殖。
5. 将 HDFn 培养基储存在 4 °C。
6. 根据需要配制促迁移和抗迁移试剂。

2. 第3天：类球体准备

1. 在超净工作台中进行以下操作，以防止样品污染。
2. 当细胞达到80%融合度时，吸除培养基，并加入5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育5分钟，使细胞完全从培养瓶表面脱落。
3. 向培养瓶中加入5 mL预热的培养基以中和胰蛋白酶。
....

结果

类球体培养可用于在体外有效评估促迁移和抗迁移因子对成纤维细胞迁移的影响
3D成纤维细胞球体可通过悬滴培养法在72小时内形成（图1）。培养一段时间后，将球状体包埋于凝块基质中，并采用明场显微镜进行成像（图2）。使用 ImageJ 确定类球体的初始面积（图中以白色边框包围的区域表示），并以此作为参考点，用于评估类球体后续的细胞外延生长程度。经测量，类球体的初始平均面积为 4.3 x 10⁴ μm² ± 1.1 × 10⁴ μm² 对于对照类球体，4.4 × 10⁴ μm² ± 1.1 × 10⁴ μm² 用于促迁移类球体，以及 4.5 x 10⁴ ± 7.7 × 10³ μm² .......

讨论

该方案可用于通过伤口愈合相关细胞外基质研究细胞迁移 体外 三维模型。正确实施该操作的关键步骤是成纤维细胞球体的充分发育；在制备过程中，细胞浓度经过优化，使每滴初始浓度为2,500个细胞，从而在72小时的培养期内稳定形成球体。若使用的细胞数量不足，球体可能无法有效聚集，在转移并嵌入纤维蛋白层时易发生解体。若使用不同类型的细胞，可能需要调整初始细胞浓度和/或球体成熟时间，以实现一致且稳定的球体形成。对于增殖速度较成纤维细胞更慢的细胞类型，可能需要更高的初始细胞浓度，以确保在72小时内形成适当的球体。由于在培养过程中无法更换培养基，细胞在悬滴培养中的时间不应超过72小时。由于固有的生物学变异性，初始球体大小存在差异是正常现象；为应对这一变异性，我们通过以一致的细胞数量启动球体形成，尽可能减小大小差异，并通过随时间归一化生长数据，实现结果间的可比性。

该方法实施过程中的主要挑战是将类球体从悬滴培养体系转移至凝块基质中。本方案采用针头和注射器从倒置的培养皿盖中吸取含有类球体的液滴，但也可使用其他方法，例如镊子或连接修整过枪头的微量移液器，有效实现类球体从悬滴到基质的转移。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料
含4.5 g/L葡萄糖、含丙酮酸钠、不含L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基	VWR	VWRL0148-0500	含有L-谷氨酰胺的DMEM也可使用
100毫米组织培养皿，未处理，无菌，无热原	VWR	10861-594	任何尺寸的培养皿均可用于悬滴培养
来自美国农业部批准国家的胎牛血清，经热灭活、无菌过滤，并通过细胞培养测试	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	ICN1680149	若使用已含 L-谷氨酰胺的 DMEM，则无需添加
青霉素-链霉素溶液，稳定化，经无菌过滤，含10,000单位青霉素和10 mg链霉素/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
新生儿人真皮成纤维细胞	赛默飞世尔科技	C0045C	可用其他感兴趣的细胞类型替代
21 G × 1 1/2 英寸针头	BD	305167	22 G × 1 1/2 的针头也可使用
1 mL 注射器	VWR	89174-491	任何体积的注射器均可使用
细胞培养多孔板，聚苯乙烯，Greiner Bio-One（单独包装）（48孔）	VWR	82051-004
人纤维蛋白原——纤溶酶原、血管性血友病因子和纤维连接蛋白耗竭型	酶学研究实验室	FIB 3	可用感兴趣的基质蛋白替代
人α凝血酶	酶学研究实验室	HT 1002a	根据所研究的基质蛋白，可能并非必要
<强>仪器设备
BSL2 细胞培养罩
细胞培养箱
配备10倍物镜的倒置显微镜
可兼容15 mL离心管的离心机