透明的 C. elegans 肠道可作为“在体内 用于在多细胞管状结构形成过程中，在单细胞和亚细胞水平上研究顶-基底膜及管腔生物发生的组织腔室。本方案描述了如何结合标准标记、基因功能缺失/RNAi以及显微镜技术，在分子水平上解析这些过程。
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方法文章
TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像
本文内容
摘要
摘要
多细胞管状结构是所有内脏器官的基本单位，由极化的上皮或内皮细胞构成，其顶端膜衬于管腔内侧，而基底外侧膜则相互接触和/或与细胞外基质相连。在器官形态发生过程中，这种独特的膜不对称性如何建立并维持，仍是细胞生物学中尚未解决的问题。本实验方案以秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道为模型，研究管状结构形态发生过程中极性膜的生物生成，重点聚焦于顶端膜与管腔的形成。秀丽隐杆线虫的肠道由二十个单层排列的上皮细胞组成，形成一个简单的两侧对称管状结构，便于在单细胞水平上进行分析。膜的极性化在胚胎早期伴随极性细胞分裂和细胞迁移同步发生，但全新的极性膜生物生成过程在整个幼虫生长期持续进行，此时细胞已停止增殖和移动。后一情形使得研究者能够将介导不同极性化过程的亚细胞变化分离开来，而这些过程在大多数极性模型中难以区分。在整个发育过程中，可通过绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白标记或原位抗体染色，对顶端膜、基底外侧膜、细胞连接、细胞骨架及内膜系统的组分进行标记与追踪。结合该生物体丰富的遗传可操作性，秀丽隐杆线虫肠道因而为极性膜与管状结构生物生成的可视化、发育学及分子遗传学分析提供了独特的体内模型。本文所述具体方法（均为常规技术）包括：通过抗体染色标记肠道亚细胞组分；利用适用于通常为必需的管状结构形成基因的基因功能缺失研究方法，分析参与极性膜生物生成的基因；评估不同发育阶段的极性缺陷；通过落射荧光、微分干涉相差（DIC）及共聚焦显微镜观察解析表型；对视觉缺陷进行量化分析。本实验方案可适用于分析参与上皮极性、膜生物生成、管腔与管状结构形态发生过程中常高度保守的各类分子。 C. elegans 肠道作为 用于研究管状结构形态发生过程中极化膜生物合成的模型，重点在于顶膜和管腔的生物合成。该 C. elegans 由二十个细胞组成的单层肠上皮排列成一个简单的两侧对称管状结构，允许在单细胞水平上进行分析。膜极化的建立与早期胚胎发生过程中的极性细胞分裂和细胞迁移同时发生，但在幼虫生长期中，当细胞停止增殖和移动后，从头开始的极性膜生成仍持续进行。 从头 极化膜的生物合成在幼虫生长期持续进行，此时细胞已不再增殖和迁移。这一特性使得研究者能够将同时介导不同极化过程的亚细胞变化分离开来，而在大多数极性模型中，这些过程往往难以区分。顶膜、基底外侧膜、细胞连接、细胞骨架以及内膜系统的组分均可通过GFP融合蛋白在发育过程中进行标记和追踪，或通过 原位 抗体染色。结合该生物体的遗传多样性， C. elegans 肠道因此提供了一个独特的 在体内 用于极化膜和管状结构发生的可视化、发育及分子遗传学分析的模型。本文所述的具体方法（均为常规方法）包括：通过抗体染色标记肠道亚细胞组分；利用针对通常为必需的管状结构形成基因而优化的基因功能缺失研究，分析参与极化膜生物合成的基因；评估不同发育阶段的极性缺陷；通过落射荧光、微分干涉差（DIC）和共聚焦显微镜解析表型；量化视觉缺陷。本实验方案可适用于分析参与上皮细胞极性、膜生物合成、管状结构及管腔形态发生的众多高度保守分子中的任意一种。
引言
细胞和亚细胞不对称性的形成，例如极化膜结构域的建立，对于细胞、组织和器官的形态发生及其功能至关重要1上皮细胞中极化膜的生物发生研究仍面临技术挑战，因为亚细胞组分定位的方向性变化依赖于多个连续且同时发生的胞外和胞内信号，这些信号在大多数模型中难以分离，并高度依赖于特定的模型系统。本文介绍的模型——单层 秀丽隐杆线虫 肠道——是一种结构极为简单的组织。与单细胞 C. elegans 排泄管（参见随附的关于极化膜生物发生的论文） 秀丽隐杆线虫 排泄管2，它为鉴定和表征极化膜生物合成所需分子提供了若干独特优势。从酵母到人类，分子极性信号的高度保守性使得这一简单的无脊椎动物器官成为研究极化膜生物发生的理想模型 "在体内 组织培养腔室" 以解决与人类系统直接相关但目前仍过于复杂而无法在单细胞水平上进行可视化解析的上皮细胞极性问题 在体内.
尽管已鉴定出多个保守的极性信号，这些信号来源于（1）细胞外基质，（2）质膜及其连接结构，以及（3）细胞内囊泡运输3，但这些组分在极化上皮膜和组织发生过程中的整合机制仍不清楚4. 经典的单细胞 在体 模型（例如：S. cerevisia....
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方案
1. 标记 C. elegans 肠道
注意：有关组织特异性荧光标记质粒的构建以及转基因动物的制备（包括转录融合与翻译融合蛋白的讨论，后者对于目标分子的亚细胞定位至关重要），请参见作者关于排泄管管状结构形成的配套论文2。这些方法可通过使用特定启动子，将目标分子靶向表达于肠道。有关成功用于可视化 C. elegans 肠道内膜、质膜及其连接结构的分子示例，请参见表1；有关驱动肠道表达的启动子示例，请参见表2；有关更全面的肠道标记物和启动子资源，请参见表3。
- 抗体染色 C. elegans 肠道27,28
- 固定
- 取一块洁净的载玻片，用聚-L-赖氨酸制成一层薄膜，以便线虫附着。放置30 µL 0.1-0.2% 聚-L-赖氨酸 在载玻片上放置一滴多聚-L-赖氨酸，并将另一张载玻片覆盖在液滴上以形成 "三明治"然后轻轻摩擦载玻片数次，以润湿两面的整个表面，并使其在空气中....
- 固定
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结果
本实验方案描述了如何在分子水平上分析和可视化极化膜生物合成及管腔形态发生过程 C. elegans 肠道，单细胞及亚细胞水平。二十细胞单层 秀丽隐杆线虫 肠道在胚胎中期通过定向的细胞分裂和迁移形成。此时，极化的膜结构域逐渐建立，然而 从头合成 极化膜生物发生过程在成熟但持续扩展的上皮组织中持续进行，贯穿四个幼虫阶段直至成体，从而可将分析重点集中于极化膜的生物发生图1A).
为了可视化 秀丽隐杆线虫 细胞和亚细胞组分，通常采用两种策略：免疫荧光（本方案第1部分详述）； 图2, 图 4D- F）以及荧光融合蛋白的表达（详见随附论文中关于排泄管.......
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讨论
本方案描述了如何结合标准的基因功能缺失/RNAi与成像（标记与显微镜）技术，以充分利用 C. elegans 肠上皮作为可视化与分子解析的模型 在体内 极化膜与管腔发生
标记
本方案重点介绍抗体染色。原位抗体标记是荧光融合蛋白标记的一种高特异性替代方法（荧光融合蛋白标记方法详见配套论文中关于排泄管膜生物合成的部分）2。尽管抗体染色无法实现活体成像，但它可用于验证目标蛋白的定位（两种标记方法均可能存在局限性）。此外，有关形态发生和/或蛋白亚细胞定位的问题通常可在固定后的动物样本中进行评估。免疫染色适用于双重及多重标记，若荧光融合蛋白在所需的固定和通透处理过程中得以保留，则可与荧光融合蛋白标记联合使用。本文所述方案通常允许实现这种联合标记（图2）。对固定样本使用抗体或化学染料进行原位标记，也可能有利于超分辨率显微技术（如.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Mario 去 Bono（英国剑桥，MRC分子生物学实验室），Kenneth J. Kemphues（美国伊萨卡，康奈尔大学），Michel Labouesse（法国斯特拉斯堡， Institut de 巴黎西学生物学，Université 皮埃尔和玛丽·居里大学，法国巴黎，Grégoire Michaux（斯特拉斯堡大学） 去感谢 Rennes 1（法国雷恩）、由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助的秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）提供菌株和抗体。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH GM078653）、麻省总医院（MGH IS 224570）以及 SAA（223809）向 V.G. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体染色 | |||
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A452-4 | |
| 丙酮 | Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Tween | Fisher Scientific | 50-213-612 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| 脱脂奶粉 | Sigma | MT409-1BTL | |
| 一抗 | |||
| MH27（小鼠） | 浓度：1:20 资源：发育研究杂交瘤库 | ||
| MH33（小鼠） | 浓度：1:10 资源：发育研究杂交瘤库 | ||
| 抗-ICB4（兔） | 浓度：1:5 资源：由 Mario 惠赠 去 Bono（英国医学研究理事会） | ||
| 抗PAR-3（兔） | 浓度：1:50 资源：由康奈尔大学 Kenneth J. Kemphues 惠赠 | ||
| 二抗 | |||
| Alexa Floor 568（抗兔） | ABCam | AB175471 | 浓度：1:200 |
| Cy5（抗小鼠） | Life technologies | A10524 | 浓度：1:200 |
| TRITC（抗兔） | Invitrogen | T2769 | 浓度：1:200 |
| FITC（抗小鼠） | Sigma | F9006 | 浓度：1:100 |
| 标记的化学品 | |||
| Texas Red-Phalloidin | 浓度：1:100 资源：Molecular Probes-T7471 | ||
| 材料 | |||
| 真空润滑脂 硅酮 | Beckman | 335148 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 4448 | |
| 显微镜盖玻片（22×22-1） | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| C. elegans 相关 | 参见参考文献29 用于标准 C. elegans 培养与保种方法。 | ||
| LB 培养基与平板 | 参见参考文献29 用于实验方案。 | ||
| 胰蛋白胨 | Acros Organics | 611845000 | |
| 酵母提取物 | BD Biosciences | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Bacto 琼脂 | BD Biosciences | 214040 | |
| 氨苄青霉素 | Sigma | A0116 | |
| 四环素 | Fisher Scientific | BP912 | |
| M9 培养基 | 参见参考文献29 用于实验方案。 | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| MgSO₄4 | Sigma | M2773 | |
| NGM 平板 | 参见参考文献29 用于实验方案。 | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| 蛋白胨 | BD Biosciences | 211677 | |
| 胰蛋白胨 | 阿克罗斯有机 | 611845000 | |
| Bacto 琼脂 | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO₄4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| 胆固醇 | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| RNAi 平板 | 参见参考文献30 用于实验方案。 | ||
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| 蛋白胨 | BD Biosciences | 211677 | |
| 胰蛋白胨 | 阿克罗斯有机 | 611845000 | |
| Bacto 琼脂 | BD Biosciences | 214040 | |
| MgSO₄4 | Sigma | M2773 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| 胆固醇 | Sigma | C8667 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| IPTG | US Biological | I8500 | |
| 羧苄青霉素 | Fisher Scientific | BP2648 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 次氯酸钠 | Fisher Scientific | 50371500 | |
| 细菌 | |||
| OP50 细菌 | CGC | ||
| HT115 细菌 | CGC | ||
| 全基因组RNAi文库 Ahringer全基因组RNAi饲喂文库（参考文献 30,49,50) | Source BioScience | ||
| C. elegans ORF-RNAi 饲喂文库（参考文献51) | Source BioScience | ||
| 成像相关 | |||
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | BP9221-500 | |
| 设备 | |||
| 解剖显微镜 | 尼康 | SMZ-U | |
| 配备高倍体视荧光附件（Kramer Scientific）、CCD 相机与 Q capture 软件以及 X-Cite 荧光灯（Photonic Solutions）的解剖显微镜 | Olympus | SZX12 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | 徕卡显微系统 | TCS SL | |
| 搭载于ECLIPSE Ti-E倒置显微镜的激光扫描共聚焦显微镜 | 尼康 | C2 |
参考文献
- Bryant, D. M., Mostov, K. E. From cells to organs: building polarized tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (11), 887-901 (2008).
- Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans excretory canal as a model for intracellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis in a single cell. JoVE
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