TheC. elegans肠道作为细胞间管腔形态发生的模型体内极化膜在单细胞水平上的生物发生：抗体标记、RNAi功能缺失分析与成像

摘要

透明的 C. elegans 肠道可作为“在体内 用于在多细胞管状结构形成过程中，在单细胞和亚细胞水平上研究顶-基底膜及管腔生物发生的组织腔室。本方案描述了如何结合标准标记、基因功能缺失/RNAi以及显微镜技术，在分子水平上解析这些过程。

摘要

多细胞管状结构是所有内脏器官的基本单位，由极化的上皮或内皮细胞构成，其顶端膜衬于管腔内侧，而基底外侧膜则相互接触和/或与细胞外基质相连。在器官形态发生过程中，这种独特的膜不对称性如何建立并维持，仍是细胞生物学中尚未解决的问题。本实验方案以秀丽隐杆线虫（C. elegans）肠道为模型，研究管状结构形态发生过程中极性膜的生物生成，重点聚焦于顶端膜与管腔的形成。秀丽隐杆线虫的肠道由二十个单层排列的上皮细胞组成，形成一个简单的两侧对称管状结构，便于在单细胞水平上进行分析。膜的极性化在胚胎早期伴随极性细胞分裂和细胞迁移同步发生，但全新的极性膜生物生成过程在整个幼虫生长期持续进行，此时细胞已停止增殖和移动。后一情形使得研究者能够将介导不同极性化过程的亚细胞变化分离开来，而这些过程在大多数极性模型中难以区分。在整个发育过程中，可通过绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白标记或原位抗体染色，对顶端膜、基底外侧膜、细胞连接、细胞骨架及内膜系统的组分进行标记与追踪。结合该生物体丰富的遗传可操作性，秀丽隐杆线虫肠道因而为极性膜与管状结构生物生成的可视化、发育学及分子遗传学分析提供了独特的体内模型。本文所述具体方法（均为常规技术）包括：通过抗体染色标记肠道亚细胞组分；利用适用于通常为必需的管状结构形成基因的基因功能缺失研究方法，分析参与极性膜生物生成的基因；评估不同发育阶段的极性缺陷；通过落射荧光、微分干涉相差（DIC）及共聚焦显微镜观察解析表型；对视觉缺陷进行量化分析。本实验方案可适用于分析参与上皮极性、膜生物生成、管腔与管状结构形态发生过程中常高度保守的各类分子。 C. elegans 肠道作为 用于研究管状结构形态发生过程中极化膜生物合成的模型，重点在于顶膜和管腔的生物合成。该 C. elegans 由二十个细胞组成的单层肠上皮排列成一个简单的两侧对称管状结构，允许在单细胞水平上进行分析。膜极化的建立与早期胚胎发生过程中的极性细胞分裂和细胞迁移同时发生，但在幼虫生长期中，当细胞停止增殖和移动后，从头开始的极性膜生成仍持续进行。 从头 极化膜的生物合成在幼虫生长期持续进行，此时细胞已不再增殖和迁移。这一特性使得研究者能够将同时介导不同极化过程的亚细胞变化分离开来，而在大多数极性模型中，这些过程往往难以区分。顶膜、基底外侧膜、细胞连接、细胞骨架以及内膜系统的组分均可通过GFP融合蛋白在发育过程中进行标记和追踪，或通过 原位 抗体染色。结合该生物体的遗传多样性， C. elegans 肠道因此提供了一个独特的 在体内 用于极化膜和管状结构发生的可视化、发育及分子遗传学分析的模型。本文所述的具体方法（均为常规方法）包括：通过抗体染色标记肠道亚细胞组分；利用针对通常为必需的管状结构形成基因而优化的基因功能缺失研究，分析参与极化膜生物合成的基因；评估不同发育阶段的极性缺陷；通过落射荧光、微分干涉差（DIC）和共聚焦显微镜解析表型；量化视觉缺陷。本实验方案可适用于分析参与上皮细胞极性、膜生物合成、管状结构及管腔形态发生的众多高度保守分子中的任意一种。

引言

细胞和亚细胞不对称性的形成，例如极化膜结构域的建立，对于细胞、组织和器官的形态发生及其功能至关重要¹上皮细胞中极化膜的生物发生研究仍面临技术挑战，因为亚细胞组分定位的方向性变化依赖于多个连续且同时发生的胞外和胞内信号，这些信号在大多数模型中难以分离，并高度依赖于特定的模型系统。本文介绍的模型——单层 秀丽隐杆线虫 肠道——是一种结构极为简单的组织。与单细胞 C. elegans 排泄管（参见随附的关于极化膜生物发生的论文） 秀丽隐杆线虫 排泄管²，它为鉴定和表征极化膜生物合成所需分子提供了若干独特优势。从酵母到人类，分子极性信号的高度保守性使得这一简单的无脊椎动物器官成为研究极化膜生物发生的理想模型 "在体内 组织培养腔室" 以解决与人类系统直接相关但目前仍过于复杂而无法在单细胞水平上进行可视化解析的上皮细胞极性问题 在体内.

尽管已鉴定出多个保守的极性信号，这些信号来源于（1）细胞外基质，（2）质膜及其连接结构，以及（3）细胞内囊泡运输³，但这些组分在极化上皮膜和组织发生过程中的整合机制仍不清楚⁴. 经典的单细胞 在体 模型（例如：S. cerevisiae 以及 C. elegans 合子）在阐明极化细胞分裂和前-后极性的基本原理方面发挥了关键作用，并鉴定了重要的膜相关极性决定因子（小GTP酶/CDC-42、分裂缺陷蛋白PAR家族）。^5,6，但它们依赖于独特的对称性破缺信号（芽痕、精子进入点），且缺乏由细胞连接固定的顶-基底侧膜区室，以及可能相应的细胞内顶-基底侧分选机制。然而，目前我们对上皮细胞中极化膜运输组织机制的认识主要依赖于哺乳动物的二维单层培养细胞模型⁷，缺乏能够改变膜结构域位置和膜 trafficking 路径方向的生理性和细胞外环境及发育信号（从二维到三维的转变） 体外 仅培养系统就足以逆转MDCK（Madin-Darby犬肾）细胞的膜极性）⁸. 在体 在无脊椎动物模型生物中，上皮细胞极性的发育研究最初是在扁平上皮中进行的，例如在 黑腹果蝇 表皮，他们在其中确定了连接结构动态对极化细胞迁移和细胞层运动的关键作用⁹以及内吞运输在极性维持中的作用¹⁰三维 体外 和 在体内 在 MDCK 细胞及管状上皮中对管腔形态发生进行分析 C. elegans 肠和肠分别最近已鉴定出细胞内运输对 从头 （顶膜）结构域与管腔的生成及定位^11,12,13管状（相对于扁平）上皮细胞的厚度有利于对细胞内不对称结构进行三维分析，因为它能更清晰地区分顶膜-管腔膜、顶侧连接、侧膜以及细胞器的定位。除了这些视觉优势外， C. elegans 模型增加了 在体内 环境，发育轴，透明性，体型结构的简洁性，不变且明确的细胞谱系，分析（遗传）及其他下述优势。

C. elegans 其本身是一种具有管状结构的线虫，其透明性和简单的解剖结构使得其同样呈管状的内部器官可直接用于管腔和腔室形态发生的可视化分析。其肠道由二十个细胞组成（偶尔为21或22个细胞）¹⁴ 源自一个单一的前体细胞（E），并通过一次嵌合过程由双层上皮发育为由九个肠环（INT环）组成的双侧对称管状结构（第一个环包含四个细胞）； 图1 示意图^14,15,16. 通过微分干涉差显微镜（DIC）根据细胞核特征确定的肠道谱系与组织分析¹⁷并通过标记膜进行荧光显微镜观察，为理解其形态发生过程提供了关键见解，特别是揭示了细胞自主性和非自主性在定向细胞分裂与迁移中的作用需求（例如，嵌合，左右不对称性，前后管旋转^14,18早期内胚层细胞命运决定及其调控该克隆模式器官发育的基因调控网络已得到充分表征^19,20但本文的重点在于单个管状细胞中极化膜和管腔的生物发生过程，以及伴随该过程的内膜系统、细胞骨架结构和细胞器的细胞内不对称性的分析。这种管状结构的简单性为分析提供了便利：在超微结构水平上，所有具有微绒毛的顶膜均朝向管腔，所有基底膜均朝向外侧管壁表面，侧膜彼此接触，并通过连接结构与顶膜分隔开来图1 示意图；参见参考文献^16,21）用于 C. elegans紧密连接和黏附连接组分的特异性排列）。因此，顶膜的生物合成与管腔形态发生同时进行。此外，成年肠道细胞的大小——除排泄细胞外，这种小型动物中最大的细胞——接近哺乳动物细胞的大小，便于 在体内 亚细胞组分的可视化追踪 例如 囊泡轨迹，即通常尝试的 体外 在培养皿中。

对于本项细胞和亚细胞分析而言，适当的标记至关重要。通过标记特定的分子组分，可对肠道内膜或质膜区域、细胞连接、细胞骨架结构、细胞核及其他亚细胞器进行可视化观察。许多此类组分已被鉴定，并且仍在持续发现中。Table 1 列举了一些实例并提到了相关资源。例如，已鉴定出多种分子，这些分子可区分肠内膜系统中从内质网到高尔基体、再经由高尔基后囊泡至质膜的管状和/或囊泡区室。²²特定蛋白质（以及脂质和糖类）可通过直接标记或通过结合蛋白进行间接标记。本方案重点介绍 原位 固定样本的抗体染色，是两种标准标记技术之一（另一种技术的描述参见关于排泄管管状发生的相关论文）² - 在体内 通过荧光蛋白融合进行标记——可直接应用于肠道； Table 2 提供了可用于驱动此类融合蛋白在肠道中特异性表达的肠道特异性启动子示例）。采用上述任一方法进行双重或多重标记，或结合两种方法并辅以其他化学染色，可实现更深入的可视化分辨率，并可用于分析特定分子或亚细胞组分在空间和时间上的共定位及招募变化。图2）。本方案中所述的固定和染色程序可在免疫染色过程中有效保存绿色荧光蛋白（GFP）标记。在成像方面，描述了通过标准显微技术（荧光体视显微镜和共聚焦显微镜）检测和表征管状结构形成表型的关键步骤。 (图3, 4这些方法可扩展至更高分辨率的成像技术，例如超分辨率显微镜和透射电子显微镜（本文未作描述）。

该系统的一个关键优势在于能够从胚胎发育期到成体期的不同发育阶段，在单个细胞水平上分析细胞极性。例如，可通过标记Ezrin-Radixin-Moesin家族中高度保守的膜-肌动蛋白连接蛋白ERM-1，在整个发育过程中于单细胞水平追踪顶膜结构域和管腔的形成过程。^23,24ERM-1 可用于观察胚胎管状结构形态发生过程中的顶膜生物合成（1），此时顶膜生物合成与极化细胞分裂和迁移同时发生（细胞在嵌合过程中围绕管腔向顶侧移动）。¹⁵；（2）在细胞不分裂也不迁移的晚期胚胎和幼虫期管腔延伸过程中；以及（3）在成体肠道中，极化膜结构域得以维持（图1在不断扩增的有丝分裂后幼虫上皮中， 从头 因此，极化膜的生物发生可以与极化组织形态发生相分离，而这一点在大多数模型中是无法实现的 在体内 和 体外 上皮细胞极性模型，包括具有单细胞分辨率的模型（例如 3D MDCK 囊肿模型⁸）。通过标记其他组分，该体系在L1幼虫阶段（此时细胞的胞质/细胞核比例较高）尤其有助于区分那些特异性参与极化膜生物合成的细胞内变化。例如 从那些与极化细胞分裂和迁移同时所需的机制中，分离出膜运输轨迹重定向的过程。

C. elegans 的遗传多样性广为人知²⁵，使其成为对任何生物学问题进行分子分析的有力模型系统。例如，一项关于形态发生的研究可以从野生型菌株、转基因菌株（其中感兴趣的结构（例如 细胞膜）被荧光标记）或该结构存在缺陷的失活或获得功能突变体开始。典型的反向遗传学研究可能产生一种突变体，其中目标基因在生殖系中被删除（例如 通过靶向缺失）、通过诱变被修饰（通常产生点突变，导致基因功能的丧失、减弱或获得），或其转录本通过 RNAi 被降低。通过喂食方式进行 RNAi 在 C. elegans 中操作简便²⁶，也适用于设计靶向筛选，以检测一组较大的目标基因。遗传模式生物最显著的优势之一是能够进行 体内 正向筛选（例如 诱变、系统性或全基因组范围的 RNAi 筛选），从而无偏倚地探究特定表型的分子成因。例如，一项始于表达 ERM-1 标记顶膜的转基因动物的无偏倚视觉 C. elegans RNAi 管状结构形成筛选，发现了一种引人注目的可逆性肠道极性转换和异位管腔表型，本文即以此为例说明此类分析。该筛选确定了糖鞘脂（GSLs；必需的膜脂，通过其 GSL 生物合成酶鉴定）以及包被小泡的网格蛋白及其 AP-1 衔接蛋白组分的耗竭是导致该极性转换表型的特定分子缺陷，从而将这些运输分子定义为 体内 顶膜极性和管腔定位的信号分子^12,13。当从特定的遗传突变/形态发生表型出发时，此类筛选（或单个遗传/RNAi 相互作用实验）也可用于研究两个或多个目标基因之间的功能相互作用（参见关于排泄管的配套论文以了解此类分析的示例）²。本方案聚焦于 RNAi，除了其在正向筛选中可直接鉴定导致表型的基因外，还为形态发生分析提供了特定优势。由于指导形态发生的基因产物通常以剂量依赖方式发挥作用，RNAi 通常能够产生一系列表型。能够产生具有信息量的部分功能缺失表型也有助于解决一个重要问题：大多数关键的管状结构形成基因是必需的，其完全缺失会导致不育和早期胚胎致死。本方案包括条件性 RNAi 策略以克服这一困难，并建议优化方法以产生更广泛的表型谱，例如通过诱变产生的等位基因系列。

方案

1. 标记 C. elegans 肠道

注意：有关组织特异性荧光标记质粒的构建以及转基因动物的制备（包括转录融合与翻译融合蛋白的讨论，后者对于目标分子的亚细胞定位至关重要），请参见作者关于排泄管管状结构形成的配套论文²。这些方法可通过使用特定启动子，将目标分子靶向表达于肠道。有关成功用于可视化 C. elegans 肠道内膜、质膜及其连接结构的分子示例，请参见表1；有关驱动肠道表达的启动子示例，请参见表2；有关更全面的肠道标记物和启动子资源，请参见表3。

1. 抗体染色 C. elegans 肠道^27,28
   1. 固定
      1. 取一块洁净的载玻片，用聚-L-赖氨酸制成一层薄膜，以便线虫附着。放置30 µL 0.1-0.2% 聚-L-赖氨酸 在载玻片上放置一滴多聚-L-赖氨酸，并将另一张载玻片覆盖在液滴上以形成 "三明治"然后轻轻摩擦载玻片数次，以润湿两面的整个表面，并使其在空气中干燥30分钟。用铅笔在载玻片的磨砂面上做标记。
         注意：200 μL 的 0.2% 多聚-L-赖氨酸分装液 µL 通过将粉末溶解于 dH₂O 中制备₂O；可于 -20 保存 °C. 使用高分子量的聚-L-赖氨酸以增强线虫的黏附效果。聚-L-赖氨酸的浓度也至关重要：浓度过低将无法使线虫有效黏附，而浓度过高则可能产生荧光背景信号。涂层过厚时，膜可能整体脱落。
      2. 将一块平的金属块牢固地放置于容器底部（例如 一个装有液氮的聚苯乙烯容器。
         注意：可以改用干冰，但液氮能使金属块更稳定地置于容器底部，并具有良好的冷却效果。
      3. 用液体冲洗培养板收集线虫 M9²⁹ 或挑选不同发育阶段的线虫（卵、L1、L2、L3 或 L4 幼虫期）至每张载玻片上。通常挑选约 100 条幼虫 以及每个载玻片上放置约20个成虫或10个胚胎。 µL 将蠕虫冲洗到载玻片中央，或用挑针转移卵/蠕虫至 10 µL M9 或 10 µL 1x PBS²⁷ （磷酸盐缓冲液）
         1. 使用移液器分散大量线虫，以避免成团。
            注意：由于拥挤以及不同发育阶段的虫体厚度差异，洗脱下来的混合虫群附着效果较差，且冷冻裂解效率较低（见下文），因此挑选特定发育阶段的虫体（或同步化群体）可获得更优结果。幼虫比成虫更易附着，且每张载玻片可放置更多个体。
         2. 在将线虫挑取到载玻片之前，先将其转移至一个 线虫生长培养基（NGM）平板²⁹ 无 OP50 细菌。黏附在蠕虫上的过量细菌也可能干扰附着。注意防止蠕虫干燥。
      4. 轻轻放置（滴落）一个 22 mm × 将22 mm盖玻片横向置于收集的线虫上方，使其边缘至少在一侧悬垂于载玻片之外。用一或两个手指轻轻但稳固地垂直向下按压盖玻片。避免产生剪切力，以免破坏组织完整性。
      5. 立即将载玻片轻轻转移至液氮中的金属块上，静置约5分钟以充分冷冻。然后 "轻弹" 利用盖玻片的悬垂边缘，迅速将其取下。
         注意：此步骤必须在载玻片处于冷冻状态时果断完成，以实现 "裂解" 角质层。注意：使用液氮时，请遵循个人防护装备（PPE）的使用指南。
      6. 将冻裂的载玻片浸入 甲醇-20℃下在装满玻璃的科铂林罐中孵育5分钟 °C. 然后转移至一个 丙酮-20℃下在装满玻璃的考普林罐中再孵育5分钟 °C.
         注意：甲醇和丙酮应保存在 -20 °使用前于 C 下至少放置 30 分钟。固定后，载玻片可于 -20 °C. 注意：甲醇和丙酮具有毒性。
      7. 从染色缸中取出载玻片，室温下自然晾干后使用。
   2. 染色
      1. 在载玻片上用薄层凡士林包围固定后的线虫区域。在载玻片背面围绕该区域画一个圆圈以标记位置。
         注意：在整个染色过程中，必须保持胶状圆圈的完整性，以防止染色液泄漏。
      2. 制备一个 "湿盒" 将湿的纸巾放入带盖的塑料盒中，然后将载玻片置于其中的支架上 "湿盒" 以防止染色过程中玻片干燥。
         注意：载玻片不应接触水或彼此接触。
      3. 轻轻吹打约 50 µ加入1×PBS至胶圈内，用量以覆盖整个区域为宜。封闭 "湿盒" 盖上盖子，室温孵育5分钟。
         注意：为避免在此步骤中丢失线虫，切勿将 PBS 直接吹打到线虫上。应将移液器枪头轻轻置于圆圈边缘，使液体缓慢扩散覆盖线虫。
      4. 将载玻片倾斜，用移液器缓慢吸去 PBS。将载玻片放回支架上并加 50 µL（或覆盖该区域所需的量） 封闭液 小心操作。将样本在室温下的湿盒中孵育15分钟。在孵育期间，用封闭液稀释一抗（见 材料表 有关一抗及浓度的示例）。
         注意： 使用1x PBS（10 mL）和10%吐温（50 μL） freshly 配制封闭液 µL）和脱脂奶粉（0.2 g）。去垢剂的用量和牛奶的浓度可能因所用抗体的不同而有所变化，需通过实验经验确定。从载玻片上吸除液体是容易丢失线虫的另一个步骤。可通过体视显微镜观察载玻片上的样本以检查操作进展，但需注意避免载玻片干燥。
      5. 倾斜载玻片，用上述相同方法小心吸去封闭液。将载玻片放回支架上并保持水平，缓慢加入50 µL 稀释一抗，使用相同的预防措施。关闭 "湿盒" 并在 4 ℃ 孵育 °C 在4°C下过夜或在室温下较短时间孵育。
         注意：针对特定抗体，孵育时间可能需要通过实验经验确定。
      6. 吸出 一抗溶液 如其他溶液的操作一样。然后用封闭液洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤3次，添加和移除溶液的方式同上所述。
      7. 添加 二抗（荧光标记） 用封闭液稀释，室温孵育1小时。参见 材料表 有关二抗及浓度的示例。
      8. 移除二抗，用封闭液同上洗涤2次，每次10分钟；再用1×PBS洗涤以去除封闭液，每次10分钟。
      9. 吸除尽可能多的 PBS，注意不要让样本干燥，并小心去除样本周围的琼脂。
      10. 加入一滴 封片剂 将样品置于载玻片上，轻轻盖上盖玻片。用指甲油密封盖玻片边缘。将载玻片放入避光的玻片盒中以保护染色效果，并于4℃保存 °C.
          注意：由于荧光对光敏感（荧光可能随时间减弱），应将载玻片避光保存，并为防止空气暴露而保持密封。载玻片可在4℃长期保存。 °C 或 -20 °C.

2. 干扰 C. elegans 肠道中管状器官形成关键基因的功能。示例：RNAi。

注意：C. elegans 品系在接种了OP50细菌的NGM平板上培养，操作遵循标准方案²⁹。进行RNAi实验时，C. elegans 在含有25 µg/mL羧苄青霉素和2 mM IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的RNAi平板上摄取HT115RNAi细菌，以诱导细菌启动子表达，从而由导入的C. elegans基因产生双链RNA（dsRNA）。抗生素和IPTG的浓度可根据RNAi克隆/文库及所需的RNAi强度进行调整。特异性RNAi克隆可从商业化的全基因组RNAi饲喂文库中获得（有关C. elegans饲喂RNAi的背景信息，请参见(^26,30,31)；材料/试剂及RNAi文库详见材料表)。

1. 标准RNAi喂养法^26,31
   1. 从 -80 取出 RNAi 文库板 °C 并置于干冰上。移除封口膜，使用无菌移液器吸头将目标克隆的贴壁细菌转移至 LB（Luria Broth）琼脂平板²⁹ 补充 100 µg/mL 氨苄青霉素和 15 µg/mL 四环素。将细菌划线接种至琼脂平板。用新的封板膜密封RNAi文库平板。37℃过夜培养细菌 °C.
      注意：这些琼脂平板可在 4℃ 保存 °可在数周内保持稳定。可直接从中培养新的细菌，以保护原始的RNAi文库。
   2. 次日，从LB琼脂平板接种RNAi细菌至1 mL LB 液体培养基²⁹ 含有 50 µg/mL 氨苄青霉素，37℃振荡培养14（8–18）小时或过夜 °C.
      注意：为了获得最佳结果，每次均应使用新鲜的细菌。参见参考文献（³⁰）用于不同培养条件的比较（例如 培养的时间点
   3. 第二天，接种200 µ在不同的RNAi平板上，每克隆加入适量的培养RNAi细菌。让平板晾干，并在室温下放置过夜以诱导细菌启动子。
   4. 将4-6条L4期幼虫转移至每块RNAi平板上。将接种有RNAi细菌的平板在室温或22℃下孵育。 °C，3-5 天。
      注意： 首先将L4幼虫挑至不含细菌的NGM平板上，以去除会干扰RNAi的附着OP50，或将其连续转移至三个不含OP50的新NGM平板上。确保菌株未受污染，因为污染细菌（如线虫偏好的食物OP50）也会干扰RNAi效果。根据需要调整温度： 例如 发育随温度升高而加快；品系可能具有温度敏感性。
   5. 对于发育研究，从第2天开始检查F1代子代的表型。
      注意：必须频繁检查动物，以避免遗漏表型的出现或进展例如 标记物错位）以评估发育过程中极化膜的生物发生。在F2代群体中富集强表型（例如 通过在第2天将亲本雌雄同体挑至新的RNAi平板以筛选其子代中表型最明显的中段个体）通常没有必要，因为从轻微到严重的表型谱系更有助于分析。
2. 条件性RNAi
   注意：RNAi 条件可根据需要进行调整，以减弱严重表型、增强轻微表型，或实现特定发育阶段的干扰；此类调整有助于全面评估通常具有致死效应的管腔形成基因的表型结果。
   1. 幼虫期RNAi——同代中RNAi效应的评估（温和、阶段特异性RNAi）
      注意：为了克服不育性或胚胎致死性，或在胚胎发育后的特定阶段干扰基因功能，可在幼虫期进行胚胎后RNAi诱导。可将未经处理的卵（2.2.1.1）、成 gravid 成虫（2.2.1.2）或同步化的L1期（或根据需要，更晚期）幼虫（2.2.1.3）放置于RNAi平板上；在同一代中评估RNAi效应。 例如 两天后及之后的幼虫和/或成虫阶段。
      1. 挑选30-50只怀卵成虫至一滴液滴中 漂白液 （将10 M NaOH与家用次氯酸钠按1:4比例配制的溶液）置于RNAi平板边缘。待其干燥后，让L1幼虫孵化并移入细菌菌苔中。
         注意：漂白液通常用于去污染，会杀死除卵壳内胚胎以外的所有物质。因此，切勿将漂白液接触或靠近RNAi细菌。
      2. 挑选约20只年轻的产卵期成虫接种到RNAi平板上，让其产卵2–3小时，或直至平板上出现约300颗卵，随后移除成虫。
         注意：该方法可能导致RNAi细菌被OP50污染。为降低此风险，首先将成虫转移至无菌NGM平板上，以去除黏附在蠕虫上的OP50。注意成虫在RNAi平板上停留时间不宜过长，以避免RNAi对胚胎产生效应。
      3. 挑选或放置L1期线虫直接到RNAi平板上（参见参考文献(²⁹）- 用于同步化实验方案。
         注意：可以使用简化的同步化实验方案（例如 通过用M9缓冲液多次冲洗高密度培养板上的线虫，直至仅剩卵，即可为中等规模实验体系收集样本。孵化2-3小时后，可从这些培养板中收集L1幼虫至M9缓冲液中，再经额外洗涤（M9缓冲液洗涤3次）以去除细菌，随后接种至RNAi培养板上。
   2. 空载体RNAi细菌稀释RNAi细菌（温和RNAi）
      注意：通过稀释RNAi细菌的用量来减少dsRNA的量，可能足以产生较温和的效应，同时可在不完全消除所有胚胎效应的情况下降低胚胎致死率。RNAi细菌的稀释也常用于双RNAi实验，以及对遗传互作实验的条件进行滴定。例如 以产生轻微效应用于增强作用的评估，以及强效效应用于抑制作用的评估。
      1. 在1 mL LB培养基中加入50 μg/mL氨苄青霉素，培养RNAi细菌和空载体HT115 RNAi细菌 µg/mL 氨苄青霉素，操作同标准 RNAi 条件。
      2. 将表达空载体的RNAi细菌与目标RNAi细菌混合，稀释成不同浓度梯度，例如5%、15%、30%、50%、70%。通过反复吹打充分混匀细菌悬液。吸取200 μL µ将L型混合细菌接种至RNAi平板上。
      3. 每块RNAi平板上挑选4-6只L4幼虫。从第2天开始检查表型。
   3. RNAi 敏感型菌株（强 RNAi）
      1. 使用现有的RNAi敏感菌株，例如 eri-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) 或 eri-1 (mg366) lin-15B (n744) （后者为超敏感型），并按照2.1中所述的标准RNAi操作步骤进行^31,32,33.
         注意：RNAi 敏感菌株（例如 rrf-3和 eri-1）的子代数量可能少于野生型动物，并在25℃时出现不育 °C. 它们也可能具有较低的自身表型背景， 例如 低外显率的胚胎致死性，在评估特定RNAi效应时必须予以考虑。

3. 在体 成像 C. elegans 通过荧光解剖显微镜观察肠道

1. 在荧光光下观察动物之前，先在解剖显微镜的明场光下检查RNAi平板。评估（并可能记录）在明场光下可见的表型，这些表型可能影响分析结果，例如致死性、不育性（子代数量减少）、发育异常（例如 幼虫停滞）以及其他有助于表征参与极化膜生物发生和管腔形态发生基因功能的可见表型。
   注意：仅对具有足够子代用于评估的平板进行评分（至少50个），否则尝试其他RNAi条件。进行定量评估时，确保平板未受污染或未生长OP50（会干扰RNAi）。
2. 为在荧光光下观察动物，取下盖子，将RNAi平板直接置于解剖荧光显微镜下。
   注意：为检测细微的肠道表型，需要使用配备高倍立体荧光附件的解剖显微镜，以提供足够的放大范围。本方案描述的显微镜配备1.5倍和10倍物镜，变焦范围为3.5至45倍。
3. 首先在明场光下找到动物并调焦。然后使用适当的滤光片，在低倍荧光光下（例如使用1.5倍物镜）检查动物。系统地从左上到右下扫描整个平板，以发现表型。
4. 选择感兴趣的动物，切换至10倍物镜。聚焦于肠道，并使用变焦功能评估管状结构形成/管腔形态发生表型。表型评分详见第5节。首先在低倍镜下拍摄图像，然后切换至高倍镜。
   注意：由于健康动物移动迅速，操作应迅速，一手操作计算机鼠标进行图像采集，另一手调节显微镜焦距。当研究主要表现为胚胎停滞和早期幼虫的管状结构形成表型时，可能无需减缓动物活动（例如通过将平板短暂置于4 °C）。图像可通过显微镜附带的CCD相机及图像采集软件获取。

4. 利用激光扫描共聚焦显微镜对C. elegans肠道进行高分辨率成像^34,35

1. 封片与固定
   1. 用指尖在玻璃载玻片上以画圈方式均匀涂抹少量润滑脂或凡士林，形成直径约6-8 mm的薄层。
      注意：封片用润滑脂圆圈的厚度至关重要。为获得最佳成像效果，每次仅固定一个或数个幼虫，并使用极薄的润滑脂圆圈，尽量减少液体量，使样品直接紧贴在载玻片与盖玻片之间（若操作得当，动物可被固定而无需麻醉剂）。对于卵及较老的样本，需使用稍厚的润滑脂圆圈，以避免加盖盖玻片时损坏样品。
   2. 加入一滴通常为 3.5 µL 10 mM 叠氮化钠溶液 将线虫在解剖显微镜下挑取至圆圈中央。
      注意： 将 65.01 mg NaN3 溶于 1 mL 超纯水中，配制 1 M 叠氮化钠储存液 毫升去离子水₂O；加入200 µ1 M 的 L 将溶液加入20 mL M9缓冲液中。迅速将线虫挑入叠氮化钠溶液液滴中，以避免溶液干燥。为获得最佳封片效果，应分开挑选不同发育阶段的样本，每张载玻片约放置50个胚胎或约20条幼虫（当检测较大群体时）。挑取胚胎时可使用M9缓冲液代替叠氮化钠溶液。若使用叠氮化钠，必须在30分钟内完成成像，以避免该有毒化学物质对组织造成损伤。
      警告：叠氮化钠具有毒性。
   3. 轻轻放置一个 22 mm × 将22 mm盖玻片置于载玻片上。注意不要压碎线虫。施加轻微压力，并在解剖显微镜下检查，确保线虫牢固固定于载玻片与盖玻片之间。标记载玻片。
      注意：施加适当的压力至关重要，压力过大可能损坏样本，压力过小则无法有效固定样本（动物会漂浮而不附着在载玻片上）。样本漂浮会严重影响成像效果。
2. 成像
   1. 将载玻片置于共聚焦显微镜下，使用10倍物镜寻找线虫并调焦。
      注意：尽可能使用明场光照进行聚焦，以避免光漂白。
   2. 切换至60倍或100倍物镜，聚焦肠道。
      注意：在明场光线下，可通过观察从咽部延伸至尾部末端附近肛门的肠腔，轻松识别肠道。使用60倍或100倍油镜时需小心。混合不同类型的镜油可能会影响后续成像。使用正置显微镜时，将少量镜油滴加在载玻片上；使用倒置显微镜时，将镜油滴加在物镜上，注意避免污染其他物镜或显微镜部件。
   3. 为用于扫描的物镜建立科勒微分干涉（DIC）/诺马尔斯基照明³⁶在荧光光源下使用适当的荧光通道检查动物，以确认肠道标记情况和/或表型，从而选择适合成像的样本。操作应迅速，以避免荧光漂白。
   4. 切换至激光扫描，通过在肠道背侧和腹侧设置扫描边界，将预期成像范围限定于肠道。
      注意：如果荧光染料同时标记了肠外结构，则以这种方式限定肠道范围至关重要。在初步扫描期间，应使用快速扫描条件以避免光漂白。
   5. 停止扫描以选择实验的扫描参数。沿 z 轴设置 6–20 个光学切片用于肠道扫描， 例如 0.2 µm 间隔，具体取决于研究需求、动物发育阶段和/或技术因素。根据标记的复杂程度和所需分辨率，为每幅图像设置帧平均值以降低噪声。
      注意：设置细节根据显微镜和实验的不同而有所变化。若对三种不同荧光染料进行连续扫描，可能需要减少扫描层数以避免光漂白。帧数应根据扫描层数进行调整（应少于扫描层数，以避免图像失真；同时需权衡光漂白加剧的影响）。通常4至6帧已足够。
   6. 返回至使用确定性（慢速）激光扫描条件进行扫描，并调整：亮度（使用最低增益以降低背景）；激光功率（在满足需求的前提下尽可能调低，过高会增加光漂白；通常最低设置已足够）；针孔（如无必要避免开大，以保持分辨率）。
      注意：扫描条件取决于样本，需在扫描会话开始时通过实验确定。确保亮度不超过饱和度（否则将限制后续通过成像软件对图像进行修改的能力）。设置扫描条件时还需注意，在比较实验组动物与对照组的实验中，所有成像必须采用相同的条件。
   7. 采集图像序列。将图像合并为单个投影图像。
      注意：根据显微镜型号不同，可能需要分别保存投影图像和/或叠加图像。
   8. 进行多通道成像时，应采用逐帧扫描以避免通道间串色（对于共定位研究至关重要）。
      注意：由于扫描时间延长会导致光漂白加剧，可能需要调整图像设置。
   9. 始终获取相应动物扫描区域的微分干涉差（DIC）/诺马尔斯基图像（切片），以作为形态学特征和整体形态状态的参照。

5极化膜生物合成缺陷的定量分析 C. elegans 肠道

注意：示例：由 let-767 和 aps-1 RNAi 诱导的顶端 ERM-1::GFP 的基底外侧错位以及异位侧向管腔形成。

1. 在解剖显微镜下对表型进行评分（图5 A，D，E）
   1. 定义评分分类。示例：（i）野生型（WT），（ii）ERM-1::GFP 的基底外侧错位（极性缺陷），以及（iii）异位管腔形成（继基底外侧错位之后出现）。
      注意：低倍镜下的可视化分析适用于统计具有或不具有特定表型的动物数量。此处，我们选取了三个定性上不同的表型类别作为示例，这些类别同时反映了所分析的细胞极性表型的逐渐恶化。然而，还可对多种其他定性与定量表型进行评分，例如管腔形态发生缺陷、细胞质内GFP阳性空泡的有无（或数量）、管腔直径、管腔内囊肿的大小或数量（参见 图3 （例如）。
   2. 根据预期差异的大小，在解剖显微镜下对重复或三重复实验中的琼脂平板上的约100条活体线虫进行评分。
      注意：在系统性扫描培养板时，必须对视野中出现的每只动物进行评分， 例如 从平板的左上角到右下角（确保线虫在平板上分布均匀）。
   3. 对3组独立实验重复此操作。生成柱状图并评估结果的显著性。
2. 在共聚焦显微镜下对表型进行评分图5 B)
   1. 定义评分类别， 例如 每只动物的异位腔室数量
      注意：更高倍数的显微观察可用于对每只动物中的可量化标志物或表型进行评分，并可检测在解剖显微镜下难以分辨的亚细胞标志物。本示例中，针对同一实验中先前已通过解剖显微镜评估过（5.1.1，类别3）的部分线虫，统计每只动物中异位管腔的数量，从而更精确地评估此处研究的极性表型恶化程度。然而，也可对多种其他表型或参数进行评分， 例如 囊泡数量、共定位的亚细胞组分的存在与否或数量、荧光强度（后者通过 ImageJ 进行量化；参见关于排泄管的配套论文）².
   2. 根据预期差异的大小，在共聚焦显微镜下对大约20只动物进行表型标志物（此处为异位管腔）的定量分析，实验应设置重复或三重复。
   3. 重复实验3次，每次独立进行。生成柱状图并评估结果的显著性。

结果

本方案描述了如何在单细胞和亚细胞水平上，对 C. elegans 肠道中的极性膜生物发生及管腔形态建成进行分子分析与可视化。由二十个细胞组成的单层 C. elegans 肠道在胚胎中期通过定向细胞分裂和迁移形成。在此期间，细胞极性膜结构域逐步建立，然而在成熟但持续扩展的上皮组织中，从头极性膜生物发生过程在整个四个幼虫阶段直至成虫期仍持续进行，从而可将研究重点集中于极性膜的生物发生过程（图1A）。

可视化 C. elegans 细胞和亚细胞组分的研究通常采用两种策略：免疫荧光（本方案第1部分详述）； 图2, 图4D- F）以及荧光融合蛋白的...

讨论

本方案描述了如何结合标准的基因功能缺失/RNAi与成像（标记与显微镜）技术，以充分利用 C. elegans 肠上皮作为可视化与分子解析的模型 在体内 极化膜与管腔发生

标记

本方案重点介绍抗体染色。原位抗体标记是荧光融合蛋白标记的一种高特异性替代方法（荧光融合蛋白标记方法详见配套论文中关于排泄管膜生物合成的部分）²。尽管抗体染色无法实现活体成像，但它可用于验证目标蛋白的定位（两种标记方法均可能存在局限性）。此外，有关形态发生和/或蛋白亚细胞定位的问题通常可在固定后的动物样本中进行评估。免疫染色适用于双重及多重标记，若荧光融合蛋白在所需的固定和通透处理过程中得以保留，则可与荧光融合蛋白标记联合使用。本文所述方案通常允许实现这种联合标记（图2）。对固定样本使用抗体或化学染料进行原位标记，也可能有利于超分辨率显微技术（如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体染色
poly-L-lysine	Sigma	P5899
甲醇	Fisher Scientific	A452-4
丙酮	Fisher Scientific	A949SK-4
Tween	Fisher Scientific	50-213-612
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
脱脂奶粉	Sigma	MT409-1BTL
一抗
MH27（小鼠）			浓度：1:20 资源：发育研究杂交瘤库
MH33（小鼠）			浓度：1:10 资源：发育研究杂交瘤库
抗-ICB4（兔）			浓度：1:5 资源：由 Mario 惠赠 去 Bono（英国医学研究理事会）
抗PAR-3（兔）			浓度：1:50 资源：由康奈尔大学 Kenneth J. Kemphues 惠赠
二抗
Alexa Floor 568（抗兔）	ABCam	AB175471	浓度：1:200
Cy5（抗小鼠）	Life technologies	A10524	浓度：1:200
TRITC（抗兔）	Invitrogen	T2769	浓度：1:200
FITC（抗小鼠）	Sigma	F9006	浓度：1:100
标记的化学品
Texas Red-Phalloidin			浓度：1:100 资源：Molecular Probes-T7471
材料
真空润滑脂 硅酮	Beckman	335148
显微镜载玻片	Fisher Scientific	4448
显微镜盖玻片（22×22-1）	Fisher Scientific	12-542-B
C. elegans 相关			参见参考文献29 用于标准 C. elegans 培养与保种方法。
LB 培养基与平板			参见参考文献29 用于实验方案。
胰蛋白胨	Acros Organics	611845000
酵母提取物	BD Biosciences	212750
NaCl	Sigma	S7653
Bacto 琼脂	BD Biosciences	214040
氨苄青霉素	Sigma	A0116
四环素	Fisher Scientific	BP912
M9 培养基			参见参考文献29 用于实验方案。
NaCl	Sigma	S7653
KH2PO4	Sigma	P0662
Na2HPO4	Sigma	S7907
MgSO₄4	Sigma	M2773
NGM 平板			参见参考文献29 用于实验方案。
NaCl	Sigma	S7653
蛋白胨	BD Biosciences	211677
胰蛋白胨	阿克罗斯有机	611845000
Bacto 琼脂	BD Biosciences	214040
MgSO₄4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
胆固醇	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
RNAi 平板			参见参考文献30 用于实验方案。
NaCl	Sigma	S7653
蛋白胨	BD Biosciences	211677
胰蛋白胨	阿克罗斯有机	611845000
Bacto 琼脂	BD Biosciences	214040
MgSO₄4	Sigma	M2773
CaCl2	Sigma	C3881
胆固醇	Sigma	C8667
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
IPTG	US Biological	I8500
羧苄青霉素	Fisher Scientific	BP2648
NaOH	Fisher Scientific	SS266-1
次氯酸钠	Fisher Scientific	50371500
细菌
OP50 细菌	CGC
HT115 细菌	CGC
全基因组RNAi文库 Ahringer全基因组RNAi饲喂文库（参考文献 30,49,50)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi 饲喂文库（参考文献51)	Source BioScience
成像相关
叠氮化钠	Fisher Scientific	BP9221-500
设备
解剖显微镜	尼康	SMZ-U
配备高倍体视荧光附件（Kramer Scientific）、CCD 相机与 Q capture 软件以及 X-Cite 荧光灯（Photonic Solutions）的解剖显微镜	Olympus	SZX12
激光扫描共聚焦显微镜	徕卡显微系统	TCS SL
搭载于ECLIPSE Ti-E倒置显微镜的激光扫描共聚焦显微镜	尼康	C2