轴突兴奋性技术为研究不可逆变性事件发生前的病理生理学和生物物理变化提供了强有力的工具。本文展示了在麻醉大鼠尺神经上应用这些技术的方法。
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本文内容
摘要
摘要
电生理学能够对周围神经功能进行客观的活体评估。in vivo传统的神经传导检测指标（如波幅和潜伏期）分别反映慢性轴突丢失和脱髓鞘情况。轴突兴奋性检测技术"通过阈值追踪"，进一步扩展了这些指标，提供了有关离子通道、泵和交换体活性的信息，这些信息与神经的急性功能相关，并可能早于退行性病变的发生。因此，在神经系统疾病动物模型中应用轴突兴奋性检测，可为评估新型治疗干预提供一种有效的in vivo指标。本文中，我们描述了一种用于大鼠尺神经运动轴突兴奋性多种检测指标的实验装置。
动物使用异氟烷进行麻醉，并密切监测以确保麻醉深度恒定且充分。持续监测体温、呼吸频率、心率以及血液中的血氧饱和度。通过经皮刺激尺神经并从前肢掌侧小鱼际肌记录信号，进行轴突兴奋性研究。在电极位置正确的情况下，可记录到随着刺激强度增加而幅值增大的清晰复合肌肉动作电位。随后使用自动化程序施加一系列电脉冲，依次产生5种特定的兴奋性指标：刺激-反应特性、强度-时间常数、阈值电紧张、电流-阈值关系以及恢复周期。
本文展示的数据表明，这些测量方法具有可重复性，在同一天评估时，左右两侧尺神经的结果具有一致性。在本实验条件下，这些技术的一个局限性在于麻醉剂量和麻醉时间的影响。在分析时应仔细监测并记录这些变量，以便加以考虑。
引言
电生理技术是研究神经系统疾病中外周神经功能的必要工具。in vivo（在体）研究中，传统的神经传导检测方法采用超最大刺激来记录运动动作电位的幅度和潜伏期。因此，这些技术可提供有关传导纤维数量以及最快传导纤维传导速度的有用信息。轴突兴奋性检测是一种有价值的补充工具。该技术利用复杂的电生理刺激模式，间接评估外周神经的生物物理特性，例如离子通道活性、能量依赖性泵、离子交换过程以及膜电位1。
轴突兴奋性检测在临床中常用于研究各种神经系统疾病的病理生理过程，以及治疗干预对这些疾病的影响。重要的是，轴突兴奋性指标对影响周围神经功能的治疗干预措施具有敏感性，例如静脉注射免疫球蛋白（IVIg）治疗2、化疗3以及钙调磷酸酶抑制剂（CNI）治疗4。尽管这些研究已提供了重要的见解，但临床研究往往难以探究疾病的早期特征和新的治疗方案5。因此，近年来这些方法在神经系统疾病动物模型中的应用逐渐受到关注6,7,8,9。事实上，这些方法有助于深入了解与这些疾病相关的特定神经兴奋性变化，从而推动转化医学研究的发展。
本文所述方法是一种在完整大鼠尺神经上记录轴突兴奋性指标的简单且可靠的技术。
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方案
本研究所描述的所有实验程序均符合新南威尔士大学悉尼分校动物护理与伦理委员会的要求，并依照澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）关于动物实验的法规进行。
1. 实验设置
注意：本实验使用12周龄的雌性Long-Evans大鼠。
- 使用4%异氟烷和1 L/min的O2流速，在诱导室中对大鼠进行麻醉。通过测试翻正反射确认麻醉充分，并在将动物移出诱导室前确保该反射消失。注意，不同的麻醉剂对神经兴奋性具有不同的影响10。
- 将动物的鼻部牢固地置于鼻罩接头上，给予2.5%异氟烷作为维持剂量，并保持1 L/min的O2流速。
- 通过轻捏动物的脚趾和轻轻触碰其眼睛，检查肢体回缩反射和角膜反射，以确认麻醉程度充分。
注意：建议在眼睛上涂抹兽医用眼膏以防止麻醉期间眼睛干燥，但由于该操作通常每只动物仅需30分钟，因此并非必需。 - 使用反馈控制的加热垫和直肠温度探头，将大鼠体温维持在37 °C。将加热垫及集成体温传感器设定为40 °C，以避免因温度过高而导致皮肤损伤。
注意：建议使用动物生理监测系统每10秒监测并记录一次生理指标（心率、血氧饱和度、体温和呼吸频率）。最佳记录程序应包括对肢体温度的局部测量，因为外周温度可能低于核心温度11（图1）。 - 佩戴抗菌手套，并始终使用经70%乙醇清洁过的器械，以在整个操作过程中维持无病原体的环境。
2. 电生理实验装置
- 本实验应使用低阻抗铂金脑电图（EEG）针状电极。
- 准备记录用针状电极时，将记录电极（图1；紫色标记）插入小鱼际肌，参考电极插入第4指背侧（图1；橙色标记），用于记录复合肌肉动作电位（CMAPs）。
- 将接地电极插入前臂近端皮肤，位置位于刺激电极与记录电极之间（图1；绿色标记）。插入电极时需注意避开肌肉组织。
- 准备经皮刺激针状电极时，将阴极（图1；蓝色标记）插入肘部肘管远端约4 mm处，阳极（图1；红色标记）通过腋区皮肤插入近端约1 cm处。
图1：大鼠前肢针电极放置位置示意图 阴极（蓝色）插入肘部肘管远端约 4 mm 处，阳极（红色）通过腋区皮肤插入近端约 1 cm 处。接地针电极（绿色）通过前臂上部皮肤插入刺激电极与记录电极之间。记录针电极（紫色）和参考针电极（橙色）分别插入小鱼际肌以及第4指背侧th 手指。温度探针（灰色）置于拇短展肌的上方。 请点击此处查看该图的放大版本。
3. 轴突兴奋性实验步骤
- 使用与恒流刺激器和放大器相连的半自动计算机控制的轴突兴奋性程序（参见材料表），执行啮齿类动物运动神经 TRONDNF 协议。使用 50/60 Hz 噪声消除器去除多余的 50 Hz 电噪声。
- 通过同时观察复合肌肉动作电位（CMAP）形态，并对尺神经施加 1 ms 方波脉冲（阴极针电极），记录来自小鱼际肌的 CMAP。
- 为获得最佳记录，仔细调整阴极的角度和/或位置，直至获得幅值稳定的双相反应曲线（图 2A）。确定最佳位置后，使用可调节电极固定器稳定阴极。
注意：所使用的软件会自动施加下述测试刺激，并根据需要增加或减少达到阈值所需的电流。
- 为获得最佳记录，仔细调整阴极的角度和/或位置，直至获得幅值稳定的双相反应曲线（图 2A）。确定最佳位置后，使用可调节电极固定器稳定阴极。
- 通过以 1 mA 为步长逐步增加 1 ms 脉冲的刺激强度，直至达到最大反应，记录刺激-反应曲线。
注意：图 2B 和 2C 中的紫色线和绿色线分别表示刺激强度的逐步增加和自动化系统。阈值追踪的目标振幅自动设定为最大振幅的 40%，对应于刺激-反应曲线最陡斜率区域。由各种测试刺激引起的“阈值”变化（即引发 40% CMAP 所需的刺激）是本协议后续过程中获取的主要变量。 - 记录多个轴突兴奋性参数，包括阈值电紧张（TE）、电流-阈值（I/V）关系和恢复周期（RC），具体方法见参考文献12。
注意：计算机控制的轴突兴奋性程序通过 100 ms 的亚阈值去极化和超极化电流评估阈值（TE），该电流设定为对照阈值电流的 ±20% 和 ±40%。在 100 ms 极化电流期间的 14 个时间点以及极化电流结束后的 12 个时间点，系统自动记录阈值的变化。阈值电紧张间接评估结间区的电导特性，是膜电位的标志。I/V 关系通过 200 ms 的亚阈值条件性电流进行评估，其强度以 10% 为步长从对照阈值的 +50% 交替变化至 -100%。I/V 关系与 TE 的区别在于：电流持续时间更长，极化强度从 +50% 到 -100% 逐步改变，并在每次极化电流停止后 1 ms 测定各强度下的阈值变化。I/V 关系可揭示轴突的整流特性1。RC 采用双脉冲范式进行评估，即先施加一个超强条件性刺激，随后在 2.5 ms 至 200 ms 的特定时间间隔施加一系列测试刺激。该参数检测轴突结区在超强刺激后发生的一系列明确定义的事件。这些事件包括：电压门控 Na+ 通道的失活，使后续反应更难引发，其程度由不应期和相对不应期量化1；随后是结间区的充电过程，以及由快速钾通道介导的兴奋性增强期，以超常兴奋性量化；最后是由缓慢激活的钾通道介导的后期兴奋性降低，以低常兴奋性量化。
- 通过同时观察复合肌肉动作电位（CMAP）形态，并对尺神经施加 1 ms 方波脉冲（阴极针电极），记录来自小鱼际肌的 CMAP。
图 2：轴突兴奋性测试的原始数据。 图 A 显示在逐步增加对尺神经刺激强度后出现的双相复合肌肉动作电位（CMAP）反应曲线。图 B 和图 C 分别表示刺激强度（mA）和 CMAP 幅值（mV）。图 B 和图 C 中的绿色部分表示自动逐步降低刺激强度以及相应的呈 S 形下降的 CMAP，这是阈值追踪所必需的。
4. 电生理实验后步骤
- 将大鼠转移至单独的笼子中，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。在动物完全从麻醉中恢复之前，不得将其单独留下或与其他动物同笼。一旦大鼠完全从麻醉中恢复，将其转移回原始笼子中。
- 研究结束后，以无痛方式对大鼠实施安乐死，例如腹腔注射致死剂量的巴比妥类药物（如 Lethabarb）。
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结果
采用本方案获得了大鼠尺神经的电生理学测量结果。图3展示了12周龄雌性Long Evans大鼠左侧尺神经的代表性记录。复合肌肉动作电位反映了同时被激活的传导纤维数量。超强刺激下的峰值反应（mV）（图3A）表示逐步增加刺激强度直至反应不再发生变化时所达到的峰值反应（图2B）。
图3B展示了由持续时间较长（200 ms）的电流所产生、且其强度以阈值的+50%至-100%按10%递增变化时的电流-电压（I/V）关系。I/V关系通过分析去极化和超极化电流引起的阈值电流差异，评估内向和外向整流特性。左下象限反映内向整流特性，表现为对超极化的适应以及内向整流电导的激活1。右上象限反映...
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讨论
本方案展示了一种简单、可靠且微创的技术，可在短时间内评估轴突的生物物理特性及其膜电位。与需要暴露神经的其他更具侵入性的技术相比，该轴突兴奋性检测方法造成的组织损伤极小，因而能够进行in vivo评估，保持目标神经的生理状态，并允许重复测量。
为确保结果的一致性，需考虑若干方法学因素。其中一个因素是麻醉剂的浓度和类型。先前已证实，异氟烷对超极化激活的环核苷酸门控通道具有影响10。此外，已有研究采用注射用麻醉混合物（包括美托咪定、咪达唑仑和布托啡诺），并发现其随时间推移对神经兴奋性亦产生影响10。相比之下，美托咪定/咪达唑仑/芬太尼（MMF）对神经兴奋性的影响较小，已在多项神经兴奋性研究中成功应用7,13,14，但其对神经兴奋性随时间变化的影响尚未系统研究。值得注意的是，由于芬太尼属于受控...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目得到了伦德贝克基金会、诺和诺德基金会、丹麦医学研究委员会、路德维希和萨拉·埃尔萨斯基金会、神经病学研究基金会以及耶特和卡伊·达尔博姆基金会的资助。R.A. 获得了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会早期职业博士后奖学金（#1091006）的支持
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| QTracS 程序 | Digitimer Ltd. | 轴突兴奋性程序 | |
| AM-Systems 2200，模拟刺激隔离器，2200V/50Hz | SDR Scientific | 850005 | 刺激器 |
| 高性能交流放大器型号 LP511 | Grass Technologies | 放大器 | |
| Humbug 50/60Hz 噪声消除器 | Quest Scientific Instruments | 726310 | 噪声消除器 |
| 低阻抗铂金单极皮下针电极 | Grass Technologies | F-E2-24 | 记录电极，长度 10 mm，规格 30 |
| 低阻抗铂金脑电图针电极 | Cephalon | 9013L0702 | 刺激电极，长度 10 mm，规格 30 |
| 多功能 I/O 设备型号 USB-6341 | National Instruments | 多功能输入/输出设备 | |
| 铁制底板 IP | Narishige Scientific Instrument Laboratory | 用于固定刺激针电极 | |
| 旋转 X 型块 X-4 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | 用于固定刺激针电极 | |
| 磁力支架 GJ-8 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | 用于固定刺激针电极 | |
| 显微操作器 M-3333 | Narishige Scientific Instrument Laboratory | 用于固定刺激针电极 |
参考文献
- Krishnan, A. V., Lin, C. S. -Y., Park, S. B., Kiernan, M. C. Axonal ion channels from bench to bedside: a translational neuroscience perspective. Prog neurobiol. 89 (3), 288-313 (2009).
- Lin, C. S. -Y., Krishnan, A. V., Park, S. B., Kiernan, M. C. Modulatory effects on axonal function after intravenous immunoglobulin therapy in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Arch neurol. 68 (7), 862-869 (2011).
- Park, S. B., Goldstein, D., Lin, C. S. -Y., Krishnan, A. V., Friedlander, M. L., Kiernan, M. C. Acute abnormalities of sensory nerve function associated with oxaliplatin-induced neurotoxicity. J. Clin. Oncol. 27 (8), 1243-1249 (2009).
- Arnold, R., Pussell, B. A., Pianta, T. J., Lin, C. S. -Y., Kiernan, M. C., Krishnan, A. V. Association between calcineurin inhibitor treatment and peripheral nerve dysfunction in renal transplant recipients. Am. J. Transplant. 13 (9), 2426-2432 (2013).
- Boërio, D., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of motor axons in the maturing mouse. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (1), 45-53 (2009).
- Boërio, D., Kalmar, B., Greensmith, L., Bostock, H. Excitability properties of mouse motor axons in the mutant SOD1(G93A) model of amyotrophic lateral sclerosis. Muscle & Nerve. 41 (6), 774-784 (2010).
- Alvarez, S., Calin, A., Graffmo, K. S., Moldovan, M., Krarup, C. Peripheral motor axons of SOD1(G127X) mutant mice are susceptible to activity-dependent degeneration. Neurosci. 241, 239-249 (2013).
- Fledrich, R., et al. Soluble neuregulin-1 modulates disease pathogenesis in rodent models of Charcot-Marie-Tooth disease 1A. Nat. Med. 20 (9), 1055-1061 (2014).
- Vianello, S., et al. Low doses of arginine butyrate derivatives improve dystrophic phenotype and restore membrane integrity in DMD models. FASEB J. 28 (6), 2603-2619 (2014).
- Osaki, Y., et al. Effects of anesthetic agents on in vivo axonal HCN current in normal mice. Clin Neurophysiol. 126 (10), 2033-2039 (2015).
- Biessels, G. J., et al. Phenotyping animal models of diabetic neuropathy: a consensus statement of the diabetic neuropathy study group of the EASD (Neurodiab). J. Peripher. Nerv. Syst. 19 (2), 77-87 (2014).
- Boërio, D., Greensmith, L., Bostock, H. A model of mouse motor nerve excitability and the effects of polarizing currents. J. Peripher. Nerv. Syst. 16 (4), 322-333 (2011).
- Arnold, R., Moldovan, M., Rosberg, M. R., Krishnan, A. V., Morris, R., Krarup, C. Nerve excitability in the rat forelimb: a technique to improve translational utility. J. Neurosci. Methods. 275, 19-24 (2017).
- Moldovan, M., Alvarez, S., Krarup, C. Motor axon excitability during Wallerian degeneration. Brain. 132 (Pt 2), 511-523 (2009).
- Madison, R. D., Robinson, G. A., Krarup, C., Moldovan, M., Li, Q., Wilson, W. A. In vitro electrophoresis and in vivo electrophysiology of peripheral nerve using DC field stimulation. J. Neurosci. Methods. 225, 90-96 (2014).
- Moldovan, M., Krarup, C. Evaluation of Na+/K+ pump function following repetitive activity in mouse peripheral nerve. J. Neurosci. Methods. 155 (2), 161-171 (2006).
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