使用光学分数法和标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行体视学估算

摘要

本研究提供了一种利用标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行无偏立体学估算的逐步操作方案即， 一台光学显微镜、一个电动载物台（x、y、z平面）以及用于数字图像分析的公共领域软件。

摘要

在帕金森病的临床前研究中，分析黑质纹状体束（包括对黑质内多巴胺能神经元丢失的定量）至关重要。目前，估计多巴胺能神经元总数的金标准方法是采用光学分馏器法的无偏立体学技术。由于光学分馏器法背后的理论较为复杂，且在缺乏专用设备的情况下难以实施立体学分析，因此市面上已存在多种商业化的完整立体学系统，这些系统包含必要的软件，专门用于细胞计数。然而，由于多种原因，购置专用的立体学设备并不总是可行的。因此，本报告介绍了一种利用常规显微镜设备进行多巴胺能神经元立体学定量的方法，所需设备包括光学显微镜、配备成像软件的电动载物台（x、y、z轴）以及用于分析的计算机。本文提供了使用光学分馏器法进行立体学定量的逐步操作说明，并附有用于计算估计细胞数量的预编程文件。为评估该方法的准确性，将其结果与商业立体学仪器获得的数据进行了比较。结果显示，本方案与商业立体学设备所得细胞数量具有可比性，从而证明了该方案在无偏立体学分析中的精确性。

引言

在临床前帕金森病研究中，神经元细胞数量的定量对于确定黑质（SN）内的神经退行性变程度至关重要^1,2。对特定区域内细胞数量进行无偏倚体视学估算被认为是金标准^3,4,5。

在无偏立体学出现之前，人们通过调整计数的细胞轮廓来校正神经元在切片中可见概率的差异，从而评估切片中的神经元数量。其中最常用的方法之一是采用阿伯克龙比（Abercrombie）所描述的对定量细胞计数进行校正的方法。⁶该方法试图考虑到，如果同一细胞的片段出现在相邻的薄切片中，则该细胞可能被多次计数。因此，Abercrombie 和其他研究者提出了需要对被计数细胞的形状、大小和方向作出假设的计算公式。^7,8然而，这些假设通常无法实现，因而导致系统性误差，并偏离实际的细胞数量（即， 偏差）。此外，增加采样量也无法降低该偏差³.

使用光学分数法进行细胞数量的体视学估算时，通过应用数学原理直接在定义的三维体积内估算细胞数量。该方法的优点在于无需对所计数细胞的形状、大小和方向作出任何假设。因此，估算出的细胞数量更接近真实值，并且随着样本量的增加而愈加接近真实值。即， 无偏倚的³由于在使用体视学方法时必须遵循诸多规则以确保方法的无偏性，因此已开发出即用型商业体视学系统（综述见 Schmitz 和 Hof，2005）⁴）。专业的体视学系统采用基于设计的体视学方法进行 先验的 用于体视学评估的明确定义的探针和采样方案，可确保对被分析细胞的形状、大小、空间分布和方向具有独立性^4,9然而，市面上可购得的体视学系统价格昂贵，这可能会限制其在新研究中的应用。

本研究的目的是开发一种实用的技术，用于基于设计的体视学方法估算小鼠黑质中多巴胺能细胞数量，采用光学分数法并使用常规显微镜设备即， 光学显微镜、标准显微镜软件和电动x、y、z载物台。为此，本文提供了处理小鼠脑组织以及使用基于设计的无偏立体学方法估算黑质（SN）细胞数量的逐步操作指南。此外，还提供了用于计算估算细胞数量和误差系数（CE）的模板。

本文所述方法不仅限于黑质的分析，还可适用于小鼠或大鼠脑内其他解剖学定义区域的研究。例如，已有研究采用无偏倚体视学方法估算海马¹⁰和蓝斑¹¹中的神经元数量。此外，该方法也可用于评估除神经元以外的其他细胞类型，如星形胶质细胞¹²和小胶质细胞¹³。因此，对于希望在研究中应用无偏倚体视学方法但不愿花费大量资金购买体视学系统的科研人员而言，该方法具有重要应用价值。

方案

所有涉及动物的饲养和使用均遵循适用的国际、国家和/或机构指南。该实验方案已获得德国维尔茨堡下弗兰肯行政区地方政府的批准。

1. 组织处理与免疫组织化学

1. 使用 CO₂ 或其他经批准的方法处死小鼠。
2. 使用 25 号针头和输注泵，对六只 12 周龄的 C56Bl/6N 雄性小鼠进行经心脏灌注，先用 10 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，随后用 70 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 0.1 M PBS 灌注。
   注意：PFA 具有毒性、致敏性及致癌性。
3. 使用脑组织切片模具，在距前囟 +0.74 mm 的冠状面区域解剖小鼠脑组织（见图 25，Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱¹⁴）。
4. 将包含黑质（SN）在内的脑组织背侧部分置于含 4% PFA 的 0.1 M PBS 中，在 4 °C 下浸泡固定 1 天。
5. 将 PFA 更换为 30% 蔗糖/0.1 mol PBS 溶液以进行冷冻保护，并在 4 °C 下继续孵育 2 天。
6. 将脑组织背侧部分放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂的冷冻模具中，并在液态干冰冷却的异戊烷中缓慢冷冻组织。
   注意：干冰温度极低（-78 °C）；操作时需佩戴个人防护装备（PPE），包括手套。干冰会升华产生 CO₂，因此应在通风橱内操作。
7. 在冠状面上连续切取 30-µm 厚的冷冻切片，从距前囟 2.46 mm 处开始（见图 51，Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱¹⁴），至距前囟 4.04 mm 处结束（见图 64，Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱¹⁴），并收集切片。
8. 将四套系列切片分别储存于装有冷冻保护液（30% 甘油、30% 乙氧基乙醇和 40% PBS）的试管中，于 -20 °C 保存。在切片过程中，通过在脑干上部区域打一个小孔标记右侧半球。
9. 进行免疫组织化学染色时，每只小鼠选取一套切片。将游离切片在摇床上用含 10% 正常山羊血清（NGS）、2% BSA 和 0.5% 去垢剂的 0.1 mol PBS 溶液预孵育 1 小时。然后加入用含 2% NGS、2% BSA 和 0.5% 去垢剂的 0.1 mol PBS 溶液稀释的兔抗小鼠酪氨酸羟化酶（TH；1:1,000 稀释）一抗，在 4 °C 下孵育过夜。
10. 室温下加入针对兔 Ig 的二抗（1:100 稀释）孵育 2 小时，随后加入亲和素/生物素试剂（1:100 稀释）。用 3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）和 H₂O₂ 进行孵育和显色。染色后将切片贴附于涂覆载玻片上。
    注：TH+ 多巴胺能黑质神经元见 图 1a。通过染色一套系列切片，每只动物可获得平均 13 张黑质致密部（SNpc）和网状部从前到后延伸的 SN 切片（图 1b）。各切片间隔 120 µm（1/4 系列）（图 1c）。
    注意：DAB 为疑似致癌物，接触和吸入均有毒性。操作 DAB 时需使用个人防护装备。

2. 图像采集

1. 使用与显微镜连接的成像软件，对经TH免疫组织化学染色的黑质切片进行数字图像采集。对同一系列的每张切片分别进行分析。
2. 使用成像软件的扫描切片功能。以 TIFF 格式保存，以获得高质量图像。图2).
   注意：图像分辨率为每厘米312像素。
3. 点击“采集”以打开采集窗口（图2a).
4. 将灰度图像的像素合并（binning）设置为“2”。
   注意：采集灰度图像而非彩色图片可减小最终图像堆栈文件的大小（图2a).
5. 在采集窗口中点击“Show Live”，以打开一个新窗口，显示该切片的实时图像（图2a 和 b).
6. 在采集窗口中点击“Stage”，从下拉菜单中选择“Scan Slide”并勾选该选项（图 2c).
   注意：这能够在 x,y 平面内获取并校准高倍放大的 SN 图像（630 倍放大），同时在 z 平面内以 1 µm 的层间间距获取连续光学切片图像，总覆盖范围为 13 µm。
7. 选择2.5倍物镜以定位SN。
8. 将物镜更换为63倍。
9. 定义左上角（TopLeft）(图 2c）和右下角（LowRight）（图 2d) 通过点击“Set”来设定该部分。
10. 单击“Z序列”，并勾选“Z平面序列”选项框（图 2e).
11. 使用成像软件，在每张切片上随机选取三个计数位点，测定切片的实际安装厚度。操作时，点击“View Top Offset”以定义切片的顶部图2e）然后单击“停止查看顶部”（Stop View Top）图 2f）。然后，点击“View Bottom Offset”（图 2f）然后单击“停止查看底部”（图 2g）。记录切片的厚度。
12. 从顶部偏移量中减去 3 µm（保护区域），并将结果输入顶部偏移量槽中（图 2h）。从顶部偏移数值中减去13 µm（光学分离器的高度），将结果输入到底部偏移参数栏中（图 2i）。选择以下参数：步数，14；大小，1.00（图 2i).
    注意：这对应于z平面13 µm的厚度，连续图像之间的距离为1 µm。
13. 选择保存文件的目录（图 2j).
14. 单击“Sequence”以开始采集图 2j).
15. 单击“Processing”，然后选择以下参数：“All Planes”（来自“Sequence”）；“Montage”；勾选“Fast”和“Stitching”选项框，图像重叠率为10%图 2k）。单击“开始”以启动图像拼接。
    注意：这将生成用于分析的堆叠图像（图2l, 图3a- e).

3. 体视学评估的步骤

1. 使用 NIH ImageJ 软件 4.7 版本对 SN 堆栈图像进行分析。
2. 从 ImageJ.nih.gov 网站下载两个必需的插件：“Grid Overlay”插件¹⁵ 和 “Cell Counter”插件¹⁶。按照说明安装这两个插件。
3. 为实现无偏倚的体视学评估，定义计数参数如下：网格大小为 130 × 130 µm；计数框为 50 × 50 µm；光学分隔器高度为 13 µm。
4. 点击“文件” → “打开”来打开图像（图 4a）。使用“分析” → “设置比例尺”命令设置图像比例尺（图 4b）。在此步骤中，将定义的尺寸单位从像素更改为 µm（图 4c）。
   注意：对于所分析的图像，425 像素对应 100 µm。
5. 选择“插件” → “网格” → “网格类型：线条”命令以随机插入一个网格。勾选“随机偏移”选项。将网格内每个方格（网格方格）的大小定义为 130 µm × 130 µm = 16,900 µm²（图 3b 和 图 4d 以及 e）。
6. 将图像类型从 16 位更改为 RGB 颜色（点击“图像” → “类型” → “RGB 颜色”）（图 4f）。根据 Baquet 等¹⁷ 的描述定位 SNpc。使用“画笔工具”（画笔宽度：11）圈出 SNpc（图 3c 和 图 4g–i）。
7. 通过点击“分析” → “设置比例尺” → “点击以移除比例尺”来撤销“设置比例尺”命令（图 4j–l），以便后续计算以像素而非 µm 为单位进行。
8. 截取屏幕图像（图 4m），保存图像文件，并使用 ImageJ 打开新文件（图 4n）。选择“点”（图 4o）和画笔宽度为 25（图 4p）。标记所有与 SN 接触的网格方格，用于放置光学分隔器（图 4q）。对所有完全或部分位于所圈定 SN 区域内的光学分隔器进行细胞数量分析。
9. 选择一个包含 SN 部分的网格方格。使用 ImageJ 中的光标测量该方格的左上角，以确定起始的 x 和 y 坐标（图 4r）。
   注意：这些坐标将用于通过“光学分隔器位置”（图 4s）插入光学分隔器的位置，具体方法见步骤 4。
10. 使用名为“光学分隔器位置”的电子表格模板计算光学分隔器的位置，方法如步骤 4 所述。
11. 校准光学分隔器（由 Christopher S. Ward 编写的宏，补充文件）：点击“插件” → “宏” → “编辑”（图 4t），打开“opt_dis_grid.txt”文件（图 4u），并以像素为单位定义“usergrid”的大小，使其对应于光学分隔器的 x、y 维度（图 4v）。选择 50 µm × 50 µm 的尺寸，因此 usergrid 单边长度定义为 212.5 像素（50 × 4.25 像素）。
12. 通过输入定义光学分隔器中心位置的 ImageX 和 ImageY 坐标，确定其在堆栈图像中的位置（图 4v）。运行宏（“宏” → “运行宏”）（图 4w）。
    注意：网格将从堆栈图像中消失（图 3d 和 图 4x）。当在 z 平面下移时，光学分隔器将保持可见（图 3e 和 图 4x）。
13. 选择“插件” → “细胞计数器”以启动细胞计数器插件（图 4y）。初始化细胞计数器并选择标记类型（图 4z）。放大图像（点击“+”），并在 200% 放大倍数下进行细胞数量的体视学评估。
14. 根据多巴胺能神经元胞体的圆形或卵圆形形态及细胞大小识别它们（图 1a）。依据体视学规则对细胞数量进行定量。
    注意：由于光学分隔器是一个三维立方体（图 5a），应将立方体的前面、左侧和顶面（红色）定义为排除面。因此，不计数与红色线（左侧和前面）或顶面接触的 TH+ 细胞。将细胞计数结果添加到名为“细胞计数计算”的预设电子表格文件中（步骤 5）。
15. 根据 SN 图像，使用与覆盖网格相同大小的 x、y 步长（图 5b）以及“光学分隔器位置”电子表格模板（如步骤 4 所述），计算下一个用于放置光学分隔器进行下一次细胞计数的网格方格。
16. 使用“细胞计数计算”电子表格（步骤 5）估算细胞数量。

4. 使用“光学分隔器位置”电子表格模板计算光学分隔器位置

1. 使用“Optical disector position.xlsx”电子表格文件（图5b）计算每个光学分切器在黑质（SN）轮廓内覆盖网格中应放置的大小和位置（补充文件）。
2. 将“Set Scale”命令所定义的每微米像素数转换值填入“Optical disector position.xlsx”文件中标记为黄色的位置（图6a 和 补充文件）。
3. 将计划使用的光学分切器尺寸以及覆盖网格中每个网格方格的尺寸（以单边长度表示，单位为 µm）填入标记为橙色的位置。
   注意：结果将显示在橙色框旁边的红色框中。
4. 从黑质轮廓内已确定为起点的网格方格开始（如上文步骤3.9所述，已选定一个网格方格作为起始点）。
5. 将步骤3.9中测得的x和y坐标填入文件中的绿色框内（通过这些数值可计算出该第一个方格内光学分切器中心的x、y坐标，结果将显示在蓝色框中）。运行 opt_dis_grid.txt 宏（补充文件）。
6. 通过输入相对于第一个网格方格的网格方格间距（以方格数量计）来计算后续各个光学分切器的x、y坐标（填入棕色框中）。
   注意：+x 表示网格方格位于右侧；-x 表示位于左侧；+y 表示位于下方；-y 表示位于上方。结果将显示在灰色框中。

5. 使用“细胞计数计算”电子表格估算细胞数量

1. 使用 West 发表的公式计算每只动物中 TH+ SN 细胞的估计数量（N） 等., 1991³，其中 ∑Q^- 定义为在一个脑切片的所有光学分隔器中计数的TH+神经元的总数。
   注意：光学分离器的高度（h）相对于所测切片厚度（t）包含在公式中。面积抽样分数（asf）定义为光学分离器框架面积（A optical disector）与网格步长平方面积（A x,y step ）之比，即 A optical disector / A x,y step图3b），而切片采样分数（ssf）定义为对整个连续切片脑组织进行采样的切片所占的比例：
   
   为确保高质量的定量估计，误差系数（CE）应低于0.10。使用Keuker提出的公式计算CE。 等., 2001¹⁰:
   
2. 为对每只小鼠黑质（SN）内细胞数量进行体视学估算，输入每只小鼠生成的系列切片总数、光学分离器的高度以及光学分离器的x,y面积（A光学分离器，单位：µm²），网格方格的x,y面积（A x,y 步长，单位为µm²），并使用“Calculation of cell count.xlsx”电子表格文件测量黄色框内切片的平均厚度（单位：µm）图6b 和补充文件).
3. 按照步骤5所述，分析来自同一只动物的每个SN切片。
4. 在每个光学分隔器的灰色框中输入细胞计数，每行对应一个SN切片，使用“Calculation of cell count.xlsx”电子表格文件（补充文件).
   注意：估计的细胞数量和计算的CE显示在蓝色框内（图6b).

6. 使用商用体视学系统估算细胞数量

1. 通过点击“Probes” → “Optical Fractionator Workflow”打开光学分馏器工作流程窗口，开始估算多巴胺能SNpc细胞数量。
   注意：将弹出一个新窗口，用于确定是否将对一个新的SN系列进行计数。
2. 在弹出窗口中点击“Start a new subject”，开始一个新的TH+ SN切片系列。
3. 按照光学分馏器工作流程的各个步骤进行操作。在第一步中设置样本信息，包括输入研究者姓名、样本名称（SN组）及其他有用信息；输入本SN需计数的切片数量；输入切片的切割厚度；输入切片间隔，本实验中为4；输入随机确定的起始切片编号。
4. 在第二步中，将显微镜调至低倍放大（2X物镜），并在菜单中选择“2X Mag Lens”。
5. 在第三步中，使用鼠标左键勾画感兴趣区域，即根据Baquet et al., 2009¹⁷所描述的SNpc区域。
6. 在第四步中，将显微镜调至高倍放大，更换物镜至100X，并从下拉菜单中选择“100X Mag lens”。
7. 在第五步中，通过聚焦到切片的顶部和底部来测量贴附后的组织厚度。
8. 在第六步中，将计数框大小设为50 × 50 µm；此即光学分馏器的（x,y）尺寸。
9. 在第七步中，将系统性随机采样（SRS）网格的大小设为130 × 130 µm。
10. 在第八步中，设置3 µm的保护层（guard zone）。
11. 在第九步中保存设置。
12. 最后，在光学分馏器工作流程的第十步中，对SRS网格内每个光学分馏器中的TH+多巴胺能细胞进行计数。操作时，首先点击“Counting”按钮开始。
13. 完成一个切片后，点击“Begin Next Section”按钮，开始同一SN系列下一个SN切片的光学分馏器工作流程。
14. 当一个SN系列的最后一个SN切片完成定量后，点击“I've Finished Counting”。
15. 点击“View Results”按钮以显示体视学采样的结果。

结果

采用本方法，右侧黑质（SN）中TH+多巴胺能神经元的估计数量在7,363至7,987个细胞之间，左侧SN中则在7,446至7,904个细胞之间。因此，右侧SN中多巴胺能神经元的平均数量（± SEM）为7,647 ± 83个细胞，左侧SN为7,675 ± 66个细胞。每只动物的计算CE值均低于0.08（范围：0.073–0.079）（图7）。为验证本方法与市售专用体视学系统的可比性，还使用体视学装置对SN细胞数量进行了定量分析（图8）。计数参数如下：网格大小为130 × 130 µm；计数框为50 × 50 µm；保护带为3 µm。切片在BX53显微镜上使用100×/1.25数值孔径物镜进行分析。根据平均切片厚度估算的TH+ SN神经元数量，在右侧SN中为7,067至8,105个细胞/SN，在左侧SN中为7,164至8,015个细胞/SN。右侧SN的平均神经元数量为7,535 ± 155个细胞，左侧SN为7,699 ± 128个细胞。每个SN的Gunder...

讨论

体视学研究始于组织处理。在对黑质组织进行连续切片时，必须小心操作，以防止在体视学分析过程中切片丢失。此外，一个关键步骤是对一侧半球进行标记，以便在进行体视学分析时区分左侧和右侧黑质。在本研究中，在脑干上部打一个微小孔洞的方法取得了最佳效果。另外，由于光学分馏法要求将组织切成约30–40 µm的厚片，而不是免疫组织化学中常用的5–10 µm切片，因此必须确保抗体及其他孵育液在免疫组织化学染色过程中能够充分渗透组织，例如可通过使用去污剂来实现。

使用TH抗体对多巴胺能神经元进行免疫组织化学染色可标记黑质（SN）神经元，以及位于SN内侧的腹侧被盖区（VTA）内的神经元和红核后区的神经元。因此，在对黑质进行体视学分析时，另一个关键点是了解小鼠黑质的解剖结构，因为仅通过标准的免疫组织化学或组织学染色无法单独可视化SN神经元。相反，识别下丘脑核、红核后区和VTA等解剖标志对于确定黑质的完整范围至关重要^17,18,19

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Paxinos小鼠图谱			小鼠脑 乔治·Paxinos Keith B.J. Franklin 版权 @2001 由 Academic Press 所有 CD 光盘设计 &以及由 Paul Halasz 创建
脑组织切片矩阵 小鼠	Zivic Instruments	BSMAS 001-1
多聚甲醛	默克	1040051000
蔗糖 /D(+) 蔗糖	Roth	4621.1
异戊烷	Roth	3927.1
甘油	默克	1040931000
乙醇	Sigma Aldrich	32205-1L
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>磷酸盐缓冲盐水成分：
氯化钠	Sigma Aldrich	31434-1KG-R
磷酸二氢钾	默克	1048731000
二水合磷酸氢二钠	默克	1065801000
氯化钾	默克	1049360500
正常山羊血清	Dako	X0907
牛血清白蛋白	Sigma	A4503-100G
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-100ml	去垢剂
3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐/DAB片剂 10mg pH 7.0	Kem En Tec	4170
H2O230% 过氧化氢	默克	1072090250
亲和素/生物素试剂	赛默飞世尔科技	32050	标准超敏ABC染色试剂盒，1:100
兔抗小鼠酪氨酸羟化酶抗体	abcam	Ab112	1:1000
生物素标记的山羊抗兔IgG H+L	向量实验室	BA-1000	1:100
StereoInvestigator 11.07 版本	MBF
BX53显微镜	奥林巴斯
Visiview	Visitron Systems GmbH	3.3.0.2
Axiophot2	Zeiss
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	版本 4.7
Tissue-TEK OCT	樱花	4583
干冰
网格覆盖插件	Wayne Rasband		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
细胞计数插件	Kurt de Vos		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
光学分隔器宏	Christopher Ward
C57Bl/6N 雄性小鼠	查尔斯河实验室，德国
SuperFrost Plus 涂层载玻片	兰根布林克，德国
25G 针头 Microlance 3	BD	300400
REGLO 模拟输注泵	Ismatec	ISM 829
StereoInvestigator 系统			StereoInvestigator 版本 11.07
BX53显微镜			BX53显微镜
自选立体学			Visiview
Axiophot2			Axiophot2