方法文章

使用光学分数法和标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行体视学估算

DOI：

10.3791/56103

⸱

2017年9月1日

 ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

本文内容

摘要

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本研究提供了一种利用标准显微镜设备对小鼠黑质中多巴胺能神经元数量进行无偏立体学估算的逐步操作方案即， 一台光学显微镜、一个电动载物台（x、y、z平面）以及用于数字图像分析的公共领域软件。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在帕金森病的临床前研究中，分析黑质纹状体束（包括对黑质内多巴胺能神经元丢失的定量）至关重要。目前，估计多巴胺能神经元总数的金标准方法是采用光学分馏器法的无偏立体学技术。由于光学分馏器法背后的理论较为复杂，且在缺乏专用设备的情况下难以实施立体学分析，因此市面上已存在多种商业化的完整立体学系统，这些系统包含必要的软件，专门用于细胞计数。然而，由于多种原因，购置专用的立体学设备并不总是可行的。因此，本报告介绍了一种利用常规显微镜设备进行多巴胺能神经元立体学定量的方法，所需设备包括光学显微镜、配备成像软件的电动载物台（x、y、z轴）以及用于分析的计算机。本文提供了使用光学分馏器法进行立体学定量的逐步操作说明，并附有用于计算估计细胞数量的预编程文件。为评估该方法的准确性，将其结果与商业立体学仪器获得的数据进行了比较。结果显示，本方案与商业立体学设备所得细胞数量具有可比性，从而证明了该方案在无偏立体学分析中的精确性。

引言

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在临床前帕金森病研究中，神经元细胞数量的定量对于确定黑质（SN）内的神经退行性变程度至关重要1,2。对特定区域内细胞数量进行无偏倚体视学估算被认为是金标准3,4,5。

在无偏立体学出现之前，人们通过调整计数的细胞轮廓来校正神经元在切片中可见概率的差异，从而评估切片中的神经元数量。其中最常用的方法之一是采用阿伯克龙比（Abercrombie）所描述的对定量细胞计数进行校正的方法。6该方法试图考虑到，如果同一细胞的片段出现在相邻的薄切片中，则该细胞可能被多次计数。因此，Abercrombie 和其他研究者提出了需要对被计数细胞的形状、大小和方向作出假设的计算公式。7,8然而，这些假设通常无法实现，因而导致系统性误差，并偏离实际的细胞数量（即， 偏差）。此外，增加采样量也无法降低该偏差3.

使用光学....

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方案

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所有涉及动物的饲养和使用均遵循适用的国际、国家和/或机构指南。该实验方案已获得德国维尔茨堡下弗兰肯行政区地方政府的批准。

1. 组织处理与免疫组织化学

  1. 使用 CO2 或其他经批准的方法处死小鼠。
  2. 使用 25 号针头和输注泵，对六只 12 周龄的 C56Bl/6N 雄性小鼠进行经心脏灌注，先用 10 mL 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，随后用 70 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 0.1 M PBS 灌注。
    注意：PFA 具有毒性、致敏性及致癌性。
  3. 使用脑组织切片模具，在距前囟 +0.74 mm 的冠状面区域解剖小鼠脑组织（见图 25，Paxinos 和 Franklin 小鼠脑图谱14）。
  4. 将包含黑质（SN）在内的脑组织背侧部分置于含 4% PFA 的 0.1 M PBS 中，在 4 °C 下浸泡固定 1 天。
  5. 将 PFA 更换为 30% 蔗糖/0.1 mol PBS 溶液以进行冷冻保护，并在 4 °C 下继续孵育 2 天。
  6. 将脑组织背侧部分放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂的冷冻模具中，并在液态干冰冷却的异戊烷中缓慢冷冻组织。
    注意：干冰温度极低（-78 °C）；操作时需佩戴个人....

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结果

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采用本方法，右侧黑质（SN）中TH+多巴胺能神经元的估计数量在7,363至7,987个细胞之间，左侧SN中则在7,446至7,904个细胞之间。因此，右侧SN中多巴胺能神经元的平均数量（± SEM）为7,647 ± 83个细胞，左侧SN为7,675 ± 66个细胞。每只动物的计算CE值均低于0.08（范围：0.073–0.079）（图7）。为验证本方法与市售专用体视学系统的可比性，还使用体视学装置对SN细胞数量进行了定量分析（图8）。计数参数如下：网格大小为130 × 130 µm；计数框为50 × 50 µm；保护带为3 µm。切片在BX53显微镜上使用100×/1.25数值孔径物镜进行分析。根据平均切片厚度估算的TH+ SN神经元数量，在右侧SN中为7,067至8,105个细胞/SN，在左侧SN中为7,164至8,015个细胞/SN。右侧SN的平均神经元数量为7,535 ± 155个细胞，左侧SN为7,699 ± 128个细胞。每个SN的Gunder.......

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讨论

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体视学研究始于组织处理。在对黑质组织进行连续切片时，必须小心操作，以防止在体视学分析过程中切片丢失。此外，一个关键步骤是对一侧半球进行标记，以便在进行体视学分析时区分左侧和右侧黑质。在本研究中，在脑干上部打一个微小孔洞的方法取得了最佳效果。另外，由于光学分馏法要求将组织切成约30–40 µm的厚片，而不是免疫组织化学中常用的5–10 µm切片，因此必须确保抗体及其他孵育液在免疫组织化学染色过程中能够充分渗透组织，例如可通过使用去污剂来实现。

使用TH抗体对多巴胺能神经元进行免疫组织化学染色可标记黑质（SN）神经元，以及位于SN内侧的腹侧被盖区（VTA）内的神经元和红核后区的神经元。因此，在对黑质进行体视学分析时，另一个关键点是了解小鼠黑质的解剖结构，因为仅通过标准的免疫组织化学或组织学染色无法单独可视化SN神经元。相反，识别下丘脑核、红核后区和VTA等解剖标志对于确定黑质的完整范围至关重要17,18,19

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披露

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C. W. I. 曾担任 Merz Pharmaceuticals, LLC 和 TEVA 的科学委员会成员；曾获得 Ipsen、Merz Pharmaceuticals, LLC 和 Allergan, Inc. 提供的差旅资助；并在提交本研究之外，获得过来自 Merz、TEVA 和 Allergan, Inc. 的演讲酬金。J. V. 曾担任 Boston Scientific、Medtronic 和 AbbVie 的顾问，并在提交本研究之外，获得过来自 Medtronic、Boston Scientific、AbbVie、Bial、Allergan 和 GlobalKinetics 的酬金。

致谢

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作者感谢Keali Röhm、Louisa Frieß和Heike Menzel提供的专业技术支持；感谢Helga Brünner在动物护理方面的帮助；以及感谢Chistopher S. Ward开发并分发用于ImageJ软件的光学分测器网格插件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Paxinos小鼠图谱小鼠脑 乔治·Paxinos Keith B.J. Franklin 版权 @2001 由 Academic Press 所有 CD 光盘设计 &以及由 Paul Halasz 创建
脑组织切片矩阵 小鼠Zivic InstrumentsBSMAS 001-1
多聚甲醛默克1040051000
蔗糖 /D(+) 蔗糖Roth4621.1
异戊烷Roth3927.1
甘油默克1040931000
乙醇Sigma Aldrich32205-1L
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>磷酸盐缓冲盐水成分：
氯化钠Sigma Aldrich31434-1KG-R
磷酸二氢钾默克1048731000
二水合磷酸氢二钠默克1065801000
氯化钾默克1049360500
正常山羊血清DakoX0907
牛血清白蛋白SigmaA4503-100G
Triton X-100Sigma AldrichX100-100ml去垢剂
3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐/DAB片剂 10mg pH 7.0Kem En Tec4170
H2O230% 过氧化氢默克1072090250
亲和素/生物素试剂赛默飞世尔科技32050标准超敏ABC染色试剂盒，1:100
兔抗小鼠酪氨酸羟化酶抗体abcamAb1121:1000
生物素标记的山羊抗兔IgG H+L向量实验室BA-10001:100
StereoInvestigator 11.07 版本MBF
BX53显微镜奥林巴斯
VisiviewVisitron Systems GmbH3.3.0.2
Axiophot2Zeiss
ImageJ 软件美国国立卫生研究院版本 4.7
Tissue-TEK OCT樱花4583
干冰
网格覆盖插件Wayne Rasbandhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
细胞计数插件Kurt de Voshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html 
光学分隔器宏Christopher Ward
C57Bl/6N 雄性小鼠查尔斯河实验室，德国
SuperFrost Plus 涂层载玻片兰根布林克，德国
25G 针头 Microlance 3BD300400
REGLO 模拟输注泵IsmatecISM 829
StereoInvestigator 系统StereoInvestigator 版本 11.07
BX53显微镜BX53显微镜
自选立体学Visiview
Axiophot2Axiophot2

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
  2. Ip, C. W., ....

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