使用可寻址液滴微阵列对单细胞中的蛋白质进行计数

摘要

本文介绍了可寻址液滴微阵列（ADMs），这是一种基于液滴阵列的方法，能够测定单个细胞中蛋白质的绝对丰度。我们展示了ADMs在表征人源癌细胞系中肿瘤抑制蛋白p53表达异质性方面的应用能力。

摘要

通常，细胞行为和细胞反应是在群体水平上进行分析的，即多个细胞的反应被汇总为一个平均结果，从而掩盖了复杂细胞群体中丰富的单细胞行为。近年来，单细胞蛋白质检测与定量技术取得了显著进展。本文介绍了一种基于可寻址液滴微阵列的实用且灵活的单细胞分析平台。本研究描述了如何以单细胞分辨率测量目标蛋白的绝对拷贝数。肿瘤抑制蛋白p53是人类癌症中最常发生突变的基因，超过50%的癌症病例表现出非正常的p53表达模式。该实验方案详细说明了创建10 nL液滴的步骤，在这些液滴中分离单个人类癌细胞，并以单分子分辨率测定p53蛋白的拷贝数，从而精确评估其表达的变异性。该方法可应用于包括原代材料在内的任何细胞类型，用于测定任何目标蛋白的绝对拷贝数。

引言

本方法的目的是在单细胞分辨率下测定细胞群体中目标蛋白丰度的变化。单细胞分析提供了许多传统群体生化方法所不具备的优势。^1,2,3,4,5 首先，在单细胞水平上进行研究能够揭示细胞群体丰富的异质性，而这种异质性在传统群体生化技术中会因平均化效应而丢失。大多数常用的生化方法依赖于大量细胞样本，通常需要数百万个细胞才能获得结果。显然，对整个细胞群体进行评估的结果取决于多种因素，例如蛋白表达的异质性，可能导致蛋白丰度分布中某些重要特征被遗漏。从实际角度来看，单细胞技术所需的高灵敏度使其能够处理极微量的生物样本，而这些样本量甚至不足以支持最灵敏的群体检测技术运行。一个典型实例是对稀有细胞类型（如循环肿瘤细胞，CTCs）的研究：即使对于预后较差的患者，单次7.5 mL血液样本中可能存在的CTCs也不足10个。⁶ 本文介绍了利用基于抗体微阵列上打印的油封液滴所构建的低体积抗体检测方法，实现单细胞蛋白定量的技术流程。

微流控液滴平台具有高通量特性，每秒可生成数千个液滴，能够分离甚至在单个液滴中培养单个细胞，从而进行多种多样的....

方案

1. 准备

1. 制备芯片并打印抗体微阵列
   1. 将粘性硅胶/丙烯酸隔离器连接到已进行功能化处理、可支持抗体微阵列的盖玻片上。此装置称为芯片。
      注：已有多种表面化学方法被测试其适用于可寻址液滴的性能。⁵ 不同捕获试剂可能需要优化相应的表面化学条件。ADM 隔离器可商业购买，或通过激光切割丙烯酸材料自制（本文所用隔离器的 CAD 文件作为下载资源提供；参见补充代码文件）。
   2. 开启微阵列点样仪，并将湿度设置为 75%。
      注：相对湿度可减少点样溶液从微阵列针尖的蒸发，降低点内和点间变异。
   3. 将微阵列针在针清洗液中进行超声清洗 5 分钟。使用洗瓶以超纯水冲洗针尖，并用氮气吹干。
      注：应仅将针尖部分浸入清洗液中。若无法获得针固定装置，可使用带有适当钻孔的显微镜载玻片辅助固定。
   4. 配制 5 mL 点样缓冲液，包含 3 × 柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液、1.5 M 甜菜碱，并添加 0.01% 十二烷基硫酸钠（SDS）。可长期保存于 4 °C。
   5. 为制备点样溶液，将储存于 -80 °C 的抗 p53 抗体（p53/Mdm2 ELISA 试剂盒；参见材料表）分装样品解冻，与点样缓冲液按 1:1 混合，终浓度为 0.5 mg/mL。使用微量移液器将 5–10 µL 点样溶....

结果

在人结肠癌细胞系BE细胞中，以单细胞分辨率确定了p53的绝对基础蛋白拷贝数。我们展示了p53表达量可在多个数量级范围内变化，并显示在静息状态的BE细胞群体中，细胞大小与蛋白拷贝数之间存在微弱的正相关关系。

当水相液滴在抗体点样位置被分配并覆盖油相时，可形成可寻址液滴微阵列。在此，这些液滴支持一种高灵敏度的p53蛋白检测。使用接触式微阵列仪和点样针将捕获抗体点样于盖玻片上。抗p53捕获抗体来自商用ELISA检测试剂盒。打印条件使得捕获点直径约为100 µm，每个点的最大捕获容量为6.2 ± 0.5 × 10⁵ 个蛋白分子。³²

使用与盖玻片键合的隔离器可形成更高密度的液滴，因为它能限制油向邻近抗体捕获位点的扩散。图1A

讨论

可寻址液滴微阵列是一种灵敏且可扩展的方法，可用于定量测定单个细胞内蛋白质的绝对拷贝数。

在本实验方案中，降低非特异性结合（NSB）水平对于实现尽可能低的检测限至关重要。蛋白质及其他生化物质可能会非特异性地结合到液滴中存在的多种界面——盖玻片表面、抗体点以及油/水界面。蛋白质可能因分配进入界面或油相本身而发生损失。我们已证实，在水相液滴中添加4% BSA可有效抑制使用本方案所指定抗体时的蛋白质非特异性结合。对于其他蛋白质靶标及其相应的检测抗体，可能需要采用不同的封闭策略，例如使用非离子型去污剂或相容性表面活性剂。也可尝试使用氟化油作为封顶油，并评估其适用性。在此类情况下，还需额外考虑封顶油的临界胶束 浓度及其密度等因素。

未清洗的打印缓冲液在点样后仍保留在每个点位，有助于对齐。初次沉积液滴时，需注意避免同心管喷嘴的尖端划伤或损坏抗体点。在进一步开发该方法时，可将荧光染料掺入抗体打印缓冲液中，使其与捕获抗体一同固定。这样即可在液滴点样前完成洗涤和封闭步骤；然而，若采用喷墨打印等自动化 液滴点样方法，则此步骤并非.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>细胞培养
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	10010015
DMEM高糖	Sigma	D6429
胎牛血清（FBS）	Biochrom	S0115
细胞培养瓶	康宁	SIAL0639
胰蛋白酶/EDTA	Biochrom	L2153
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>微阵列
微接触点阵仪	DigiLab，英国	OmniGrid 微阵列点样仪
微接触针	ArrayIt，美国	946MP2
盖玻片（Nexterion）	肖特，欧洲	1098523	尺寸（mm）：65.0 × 25.0；厚度（mm）：0.17
p53 捕获抗体	Enzo	ADI-960-070
p53 检测抗体，Alexa Fluor 488 标记	圣克鲁斯	sc-126	储存浓度 200μg/mL
氯化钠-柠檬酸钠缓冲液	Gibco	15557-044
甜菜碱	Sigma	61962
十二烷基硫酸钠	Sigma	L3771
384孔板（低体积）	Sigma	CLS4511
氮气钢瓶	BOC	工业级，无氧
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>液滴
显微操作仪	Eppendorf	Patchman NP2
手动显微注射仪	Eppendorf	CellTram Vario
微量移液器	丹麦奥格里约	MBB-FP-L-0
注射泵	KD Scientific	KDS-210
100 μL型注射器	Hamilton	81020	气密性PTFE鲁尔锁
1 mL 注射器	Hamilton	81327	气密性PTFE鲁尔锁
硅胶隔离器	Grace Bio-Labs	JTR24R-A-0.5	带粘合剂的6x4孔硅胶隔离板
激光切割机	VersaLASE	VLS2.30 CO2激光器 3W	用于定制隔离器的激光切割
1毫米厚的丙烯酸板	Weatherall-英国	Clarex 精密片材 001	用于定制隔离器的激光切割
粘附片	3M		用于将定制隔离器粘附到微阵列盖玻片上
超级胶水	Loctite	LOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD 熔融石英管	IDEX	FS-115
1.0 mm 内径/1/16” OD PFA 管	IDEX	1503
0.014” ID/0.062” OD 聚四氟乙烯管	运动性	008T16-100
1.0 mm 内径/2.0 mm 外径 FEP 管	IDEX	1673
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific	BP9700100
矿物油	Sigma	M5904
超纯水	德国默克密理博公司	MilliQ
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>显微镜技术 &光学与光子学
配备编码XY载物台的全内反射荧光显微镜	日本尼康	尼康 Ti-E
EM-CCD	安道尔科技，爱尔兰	IXON DU-897E
激光激发光源	Vortran，美国	Stradus 488-50
光学裂解激光源	美国 Continuum 公司	Surelite SLI-10
用于TIRF的显微镜滤光片组	Chroma，美国	z488bp
用于光学裂解的显微镜滤光片组	Laser 2000，英国	LPD01-532R-25
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>软件
Fiji	开源		图像分析软件
Matlab	Mathworks	7.14 或更高版本	图像分析软件