需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

使用可寻址液滴微阵列对单细胞中的蛋白质进行计数

8.2K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56110

⸱

2018年7月6日

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了可寻址液滴微阵列（ADMs），这是一种基于液滴阵列的方法，能够测定单个细胞中蛋白质的绝对丰度。我们展示了ADMs在表征人源癌细胞系中肿瘤抑制蛋白p53表达异质性方面的应用能力。

摘要

通常，细胞行为和细胞反应是在群体水平上进行分析的，即多个细胞的反应被汇总为一个平均结果，从而掩盖了复杂细胞群体中丰富的单细胞行为。近年来，单细胞蛋白质检测与定量技术取得了显著进展。本文介绍了一种基于可寻址液滴微阵列的实用且灵活的单细胞分析平台。本研究描述了如何以单细胞分辨率测量目标蛋白的绝对拷贝数。肿瘤抑制蛋白p53是人类癌症中最常发生突变的基因，超过50%的癌症病例表现出非正常的p53表达模式。该实验方案详细说明了创建10 nL液滴的步骤，在这些液滴中分离单个人类癌细胞，并以单分子分辨率测定p53蛋白的拷贝数，从而精确评估其表达的变异性。该方法可应用于包括原代材料在内的任何细胞类型，用于测定任何目标蛋白的绝对拷贝数。

引言

本方法的目的是在单细胞分辨率下测定细胞群体中目标蛋白丰度的变化。单细胞分析提供了许多传统群体生化方法所不具备的优势。1,2,3,4,5 首先，在单细胞水平上进行研究能够揭示细胞群体丰富的异质性，而这种异质性在传统群体生化技术中会因平均化效应而丢失。大多数常用的生化方法依赖于大量细胞样本，通常需要数百万个细胞才能获得结果。显然，对整个细胞群体进行评估的结果取决于多种因素，例如蛋白表达的异质性，可能导致蛋白丰度分布中某些重要特征被遗漏。从实际角度来看，单细胞技术所需的高灵敏度使其能够处理极微量的生物样本，而这些样本量甚至不足以支持最灵敏的群体检测技术运行。一个典型实例是对稀有细胞类型（如循环肿瘤细胞，CTCs）的研究：即使对于预后较差的患者，单次7.5 mL血液样本中可能存在的CTCs也不足10个。6 本文介绍了利用基于抗体微阵列上打印的油封液滴所构建的低体积抗体检测方法，实现单细胞蛋白定量的技术流程。

微流控液滴平台具有高通量特性，每秒可生成数千个液滴，能够分离甚至在单个液滴中培养单个细胞，从而进行多种多样的生化分析。基于液滴的技术非常适合单细胞分析7,8,9，近年来的典型实例包括DropSeq10和inDrop11，这些技术得益于扩增方法的强大能力而得到显著推动。然而，由于蛋白质样品量有限且缺乏有效的扩增方法，单细胞蛋白质组学研究尤为具有挑战性。

液滴可通过多种方法进行分析，其中荧光显微镜技术已被广泛使用。单分子检测技术，如全内反射荧光（TIRF）显微镜，能够以无与伦比的信噪比对荧光分子进行可视化观察。12 由于隐逝场呈指数衰减，只有靠近表面（约100 nm范围内）的荧光分子才会被激发，这使得TIRF成为在复杂混合物中检测微量目标分子的有效策略。TIRF固有的光学切片能力还有助于避免洗涤步骤，从而缩短检测时间和降低实验复杂性。然而，TIRF需要平面表面，目前将TIRF显微镜应用于流动中液滴的研究实例通常涉及构建可用于成像的平面界面。13 为此，单细胞蛋白质组学技术常采用微阵列格式，在微流控芯片中设计基于表面固定的捕获试剂。4,14

液滴本身可以在平面基底上形成阵列，即所谓的液滴微阵列。15,16,17 将液滴在空间上组织成阵列，可方便地进行索引、随时间轻松监测、单独寻址，必要时还可逐个回收。液滴微阵列可在单个芯片上实现高密度的微反应器，每个芯片包含数千个独立存在或由微孔结构支撑的单元。18,19,20 这些阵列可通过液体处理机器人、喷墨点样仪或接触式微阵列仪依次沉积形成21,22,23,24,25,26，也可在特定表面上自组装形成，例如在超疏水表面上的超亲水微区图案上自发排列。27,28,29

基于上述考虑，可寻址液滴微阵列（Addressable Droplet Microarrays, ADMs）被设计用于结合液滴微阵列的多功能性、空间可寻址性和小体积优势，以及单分子全内反射荧光（TIRF）显微镜的高灵敏度，从而实现对蛋白质丰度的定量检测。5 ADMs 可实现单细胞分析：在抗体微阵列上形成包含单个细胞的液滴微阵列，随后覆盖油相以防止蒸发。液滴体积具有离散性，可避免样品损失，而这种隔离效果在连续流微流控芯片中通常需依赖片上阀门实现。30 单个细胞中目标蛋白的绝对含量极低；然而，由于液滴体积小，目标蛋白可在局部达到相对较高的浓度，从而可通过夹心抗体检测法进行检测——即在表面特定区域或位点固定捕获抗体，该抗体结合目标蛋白，后者再与液滴中含有的荧光标记检测抗体结合。作为一种无需标记目标蛋白的无标记方法，ADMs 可广泛应用于来源于原代组织的细胞分析，如处理后的血液、细针穿刺抽吸物和解离的肿瘤活检样本，同时也适用于培养细胞及其裂解液的分析。

测量细胞群体中蛋白质丰度的变化对于确定细胞对药物等刺激的异质性反应至关重要，有助于深入理解细胞功能与信号通路、评估亚群及其行为，并识别那些会被整体检测方法所掩盖的稀有事件。本实验方案描述了如何制备和使用可寻址的液滴微阵列，以定量测定人癌细胞中转录因子p53的丰度，并可用于研究p53在化疗药物作用下的功能。目标蛋白由所选用的捕获抗体和检测抗体决定，因此该方法可调整用于检测更多或不同的目标蛋白。文中提供了详细的指导，使用常规实验室耗材构建包含同轴喷嘴的简易装置，手动制备以油封顶的10 nL液滴阵列。完整的实验流程包括：将单个细胞加载至每个液滴中，裂解细胞，并利用全内反射荧光显微镜（TIRF）以单分子分辨率检测蛋白质表达水平。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 准备

  1. 制备芯片并打印抗体微阵列
    1. 将粘性硅胶/丙烯酸隔离器连接到已进行功能化处理、可支持抗体微阵列的盖玻片上。此装置称为芯片。
      注：已有多种表面化学方法被测试其适用于可寻址液滴的性能。5 不同捕获试剂可能需要优化相应的表面化学条件。ADM 隔离器可商业购买，或通过激光切割丙烯酸材料自制（本文所用隔离器的 CAD 文件作为下载资源提供；参见补充代码文件）。
    2. 开启微阵列点样仪，并将湿度设置为 75%。
      注：相对湿度可减少点样溶液从微阵列针尖的蒸发，降低点内和点间变异。
    3. 将微阵列针在针清洗液中进行超声清洗 5 分钟。使用洗瓶以超纯水冲洗针尖，并用氮气吹干。
      注：应仅将针尖部分浸入清洗液中。若无法获得针固定装置，可使用带有适当钻孔的显微镜载玻片辅助固定。
    4. 配制 5 mL 点样缓冲液，包含 3 × 柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液、1.5 M 甜菜碱，并添加 0.01% 十二烷基硫酸钠（SDS）。可长期保存于 4 °C。
    5. 为制备点样溶液，将储存于 -80 °C 的抗 p53 抗体（p53/Mdm2 ELISA 试剂盒；参见材料表）分装样品解冻，与点样缓冲液按 1:1 混合，终浓度为 0.5 mg/mL。使用微量移液器将 5–10 µL 点样溶液加入 384 孔板中，并置于微阵列点样仪内。
    6. 将步骤 1.1.1 中组装的芯片装入微阵列点样仪。编程设定点样仪在隔离器各孔中心坐标位置打印微阵列点。
      注：微阵列点样仪通常使用多种专有软件，建议读者查阅相关文献。本方法所用 ADM 隔离器（见步骤 1.1.1 所附 CAD 文件）所需的微阵列包含矩形元素，相关尺寸参数已提供。
    7. 将芯片存放在密封容器中，并用铝箔包裹。可在 4 °C 保存最长 6 周。
      注：铝箔用于防止光损伤。4 °C 保存可减缓生物分子降解及可能降低微阵列活性的有害反应。密封容器可使芯片在使用前平衡至室温而不产生冷凝水。接触式微阵列点样依赖点样溶液与基底之间的表面张力和粘附力形成点样斑点。通常需进行预点样或吸除多余液体，以确保微阵列针上残留液量一致，从而获得大小均一的斑点。请勿丢弃用于预点样的牺牲性盖玻片，因其可用于评估批次质量。
  2. 准备用于分配可寻址液滴的注射器、管路和同轴喷嘴
    1. 拆卸 100 µL（用于水相液滴）和 1 mL（用于封盖油相）玻璃哈密尔顿注射器，用蒸馏 H2O 清洗各部件。
    2. 将一段 100 mm 长、内径/外径为 150 µm/360 µm 的熔融石英毛细管穿过一段 40 mm 长、内径/外径为 1.0 mm/1/16" 的 PFA 管，使其前端突出 2 mm。此组件构成同轴喷嘴。
    3. 在 10 µL 移液枪头末端涂一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，插入 40 mm 长、内径/外径为 1.0 mm/1/16" 的 PFA 管中。如有需要，在胶水固化前调整熔融石英管位置，确保喷嘴端突出 2 mm。
    4. 将熔融石英毛细管另一端插入一段 200 mm 长、内径/外径为 0.014"/0.062" 的 PTFE 管末端，并将该管连接至装有含 4% 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）（PBSA）的 100 µL 哈密尔顿注射器。
      注：蛋白质及其他生化物质可能非特异性结合于表面，导致损失或变性。BSA 可“封闭”表面，通过优先结合表面位点，减少非特异性吸附。
    5. 将一段 400 mm 长、内径/外径为 1.0 mm/2.0 mm 的 FEP 管插入 200 µL 移液枪头直至形成密封。在另一个 200 µL 移液枪头末端涂一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，将其推入前一个枪头中以固定管路。将 1.0 mm/2.0 mm FEP 管的开口端连接至装有矿物油的 1 mL 哈密尔顿注射器。
    6. 将 200 µL 移液枪头组件插入同轴喷嘴的 10 µL 移液枪头中。将两个注射器分别安装至独立的注射泵中，以便分别控制。
    7. 用 4% PBSA 封闭液填充 100 µL 注射器。重新连接并用封闭液冲洗“水相”管路，重复两次，共冲洗三次。
    8. 用含 0.125 µg mL-1 检测抗体（Alexa 488 标记的抗 p53 抗体 DO-1）的 4% PBSA 溶液填充 100 µL 注射器，并重新连接管路。通过推出 25 µL 检测抗体溶液，替换管路中的封闭液。
    9. 用矿物油冲洗“油相”管路，直至整个管路和喷嘴均充满油。重新填充 1 mL 注射器中的矿物油并重新连接管路。将管路与喷嘴组件固定在 XYZ 操纵器上。
  3. 准备显微注射仪和显微操作器
    注：以下步骤具体参考材料表中指定的显微注射仪和显微操作器组件，但其操作原则普遍适用于同类设备。
    1. 通过连接压力管路和毛细管夹持器组装显微注射仪。
    2. 缓慢旋转活塞旋钮，直至矿物油完全充满管路。
    3. 将毛细管夹持器安装至平移头支架上。
    4. 使用夹头将毛细管固定在毛细管夹持器中。
    5. 用移液器将 4% PBSA 溶液加入隔离器的一个孔中。
    6. 使用显微操作器移动装置，将毛细管尖端浸入溶液中。
    7. 缓慢将 4% PBSA 溶液充满毛细管，并静置封闭 10 分钟。
    8. 弹出微毛细管，并旋转平移模块，使组件远离芯片表面。

2. 形成可寻址液滴并加载单个细胞

  1. 形成可寻址液滴
    1. 将芯片固定在显微镜载物台上。
      注意：该显微镜为倒置荧光自动显微镜，配备单分子全内反射荧光（TIRF）成像系统、编码的XY载物台以及电子倍增电荷耦合器件相机（EM-CCD）。
    2. 使用自动显微镜控制软件记录阵列中每个位点的显微镜载物台坐标。
    3. 设置显微镜载物台上的XYZ操纵器。将喷嘴倾斜至50–60°角。确保喷嘴具有足够的长度和间隙以到达芯片表面。将“水相”和“油相”注射泵分别设置为以100 µL/min流速输送10 nL和以100 µL/min流速输送5 µL。
      注意：在准备过程中，喷嘴前端的水相溶液可能会干燥。
    4. 持续输送水相溶液，直至喷嘴前端出现可见液滴。用无尘擦拭纸轻轻蘸去液滴。
      注意：根据所研究条件的数量，预留若干孔作为细胞储液池。对于单一细胞系/类型，一个储液池即可满足需求。
    5. 使用自动显微镜控制软件，将显微镜载物台坐标定位至阵列中的一个抗体位点，并对盖玻片表面进行聚焦。
    6. 小心不要扰动该位点，使用XYZ操纵器将同轴喷嘴的玻璃毛细管尖端对准抗体位点的一侧，注入10 nL水相溶液。不移动载物台的情况下，再注入5 µL油相以覆盖水相溶液。缓慢提起喷嘴使其脱离液滴，然后移至下一个孔。
    7. 对阵列中所有抗体位点重复步骤2.1.6。
    8. 30分钟后，使用自动显微镜控制软件对所有位点成像，以确定加样细胞前各抗体位点上结合的单分子背景信号。
  2. 向可寻址液滴中加载细胞
    1. 从培养箱中取出细胞培养瓶，使用胰蛋白酶/EDTA溶液使细胞脱离。
      注意：本研究中使用的是BE人结肠癌细胞系，在含10%（v/v）胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中，于CO2培养箱中培养。
    2. 如需进行荧光染色，则对细胞进行标记。
      1. 将细胞重悬于含0.125 μg/mL检测抗体（用Alexa 488标记的抗p53抗体DO-1）的L-15培养基中，其中FBS终浓度为10%。为确保单细胞悬液，将细胞悬液通过孔径40 µm的细胞筛过滤。
    3. 使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞悬液稀释或浓缩至浓度为25–400 × 103 个/mL。此浓度可确保细胞沉降时间距足够，便于微毛细管操作。
    4. 使用显微操作仪和微毛细管，从细胞储液池中将单个细胞加载至可寻址液滴中。
      注意：非贴壁细胞可批量吸入微量移液管，再逐个注入可寻址液滴。尽管已进行表面封闭处理，贴壁细胞系仍倾向于非特异性粘附于玻璃微毛细管内壁而造成损失。
    5. 使用10×物镜观察，通过显微注射仪从细胞储液池中将单个细胞吸入微毛细管内。
    6. 若使用电子操纵器载物台，则保存显微操作仪载物台坐标；否则手动记录Z轴位置。
    7. 通过向上移动微移液管，使其脱离芯片1 mm的高度。可通过操纵杆手动完成，或使用电子操纵器载物台的“弹出”功能自动完成。
    8. 使用自动显微镜控制软件将载物台坐标设定至目标可寻址液滴位置。通过将微移液管返回至已保存（或记录）的Z轴位置实现“注射”。此步骤可通过操纵杆手动完成，或在使用电子操纵器载物台时自动完成。
      注意：微毛细管将穿透覆盖油层，进入可寻址液滴的水相部分。
    9. 使用显微注射仪将细胞释放至可寻址液滴中。10 nL体积的可寻址液滴总体积增加不足1%。
    10. 对剩余的可寻址液滴重复步骤2.2.5–2.2.9，保留部分液滴为空白对照（即不含细胞的可寻址液滴）。
      注意：一种更简单的替代方法是，在步骤1.2.8中将溶液替换为含细胞的4% PBSA溶液，细胞浓度约为105 个/mL（相当于每10 nL含1个细胞），其中包含检测抗体。此时单细胞占据率符合泊松分布，需优化细胞浓度。
  3. 裂解细胞并成像阵列
    1. 使用明场显微镜对液滴中的细胞进行成像，包括任何荧光成像。
      注意：使用自动显微镜对约100个液滴成像约需3分钟。使用数值孔径NA = 1.49的60倍油浸物镜进行成像。明场成像无需滤光片，荧光成像则使用标准滤光片组。
    2. 使用单分子TIRF显微镜对阵列中所有位点进行成像。
      注意：成像参数与步骤2.3.1相同，但使用专用TIRF滤光片组。这些图像将在第3节中进一步分析，用于确定裂解前各抗体位点上结合的单分子背景信号。使用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行单分子成像，对约100个位点成像约需5分钟。
    3. 聚焦于一个可寻址液滴中的细胞。通过将单次6 ns激光脉冲（波长1064 nm，脉冲能量14.1 ± 0.3 µJ）聚焦在细胞附近位置，实现完全光学裂解。
      注意：激光脉冲引发膨胀的空化气泡，剪切细胞并将其内容物释放至液滴体积中。4,31 在低脉冲能量下，激光诱导裂解产生的机械效应不会扰动油-水界面。光学裂解通常需要约20–30分钟以裂解100个细胞。如讨论部分所述，若无法实现光学裂解，存在多种替代方法可用于裂解单个细胞。
    4. 对所有含细胞的可寻址液滴重复此操作，保留5个液滴作为空白对照（即含未裂解细胞的可寻址液滴）。
    5. 记录每个细胞裂解的时间。
      注意：这些时间将在步骤3.1.9中用于校正每个位点的个体结合曲线。通常只需记录第一个和最后一个细胞裂解的时间，并假设裂解事件之间的时间间隔足够一致，即可估算其余时间点。
    6. 在裂解后的前30分钟内每10分钟使用TIRF显微镜获取所有位点的单分子图像，随后60分钟内每20分钟获取一次。若仅关注平衡状态下结合的蛋白量，可在芯片于室温孵育90分钟后对所有位点成像。
      注意：达到平衡所需时间取决于液滴体积及检测中所用抗体的亲和力。TIRF显微镜使用波长为488 nm、后孔径处功率为1.5 mW的激光激发光源（使用光功率计测量）。通过将EM-CCD相机的采集参数设置为900 ms曝光时间、16位数字化、1 MHz读出速率及EM增益因子10，采集单分子图像。隔离器可通过小心移除盖玻片后重复使用。

3. 数据分析

  1. 单分子计数（非拥挤/数字区间）
    1. 使用 Fiji（或 Matlab），针对任何未拥挤的抗体斑点，加载裂解前获取的图像（背景，BKD）。
      注意：以下步骤的操作可直接使用 Fiji 图像分析软件完成。用户指南可通过以下链接获取：https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html。
    2. 在 Fiji 中，选择 BKD 图像。在 "图像" 菜单选择 "重复" 复制 BKD。选择复制的图像，然后在 "过程 > 滤光片"，选择 "高斯模糊" 并指定50像素的半径。
    3. 通过将 BKD 图像除以模糊后的 BKD 图像，使激发光源的有效强度分布趋于均匀，从而得到平坦化的 BKD_FLAT 图像。
      1. 下方 "过程" 选择 "图像计算器…，指定操作 "分割"，所需图像，以及选择相应的框 "创建新窗口" 和 "32 位（浮点）结果"
    4. 将图像中的每个像素值减去 1（"过程 > 数学"，选择 "减去……”并设定数值为1）。平均像素强度应为0。
      注意：由于所有像素值的总和应为0，因此可轻松检查视野平整性和平坦背景图像，任何残余的偏移也更容易进行补偿。
    5. 在 BKD_FLAT 图像的任意一个角落选择一个 50 像素 × 50 像素的区域。通过选择测量像素强度的标准差（σ） "分析" 和 "测量".
      注意：所选内容的汇总统计结果将在“结果”窗口中显示。这决定了 非目标位点 背景区域应选择单分子密度较低的部位。待测区域可通过默认菜单中的选择工具手动选取，或通过运行宏代码进行选择。 "makeRectangle(x, y, width, height)"；这将创建一个矩形选区，其中 x 和 y 参数为选区左上角的坐标（以像素为单位）。
    6. 将图像阈值设为3σ，并生成二值图像SM_MASK。
      1. 在下方 "图像 > 调节"，选择 "阈值……并将下限阈值设为 3σ。
        注意：像素值低于阈值的将被设为零，高于阈值的像素则被设为1。该阈值将决定被阈值化后的像素归属于单个分子的置信度。
    7. 在分割图像 SM_MASK 中，将所有尺寸不为 4-9 像素的对象的像素强度值设为零2 且通过选择0.5 - 1的圆形度 "分析" 随后 "分析颗粒" 并指定大小和圆度。
      注意：像素大小可能需要根据其他荧光染料和显微镜设置进行优化。由于相机噪声的类型，单个像素的强度可能高于此阈值，尽管并非单分子，但仍可能被保留。像素大小标准可正确排除此类像素。单分子通常呈圆形。圆形度值为1表示完美的圆形，而接近0的值表示形状逐渐拉长。剩余的物体即为单分子，可进行计数。可设置掩膜以划定光斑区域，从而实现区分 现场 和 非目标位点 每帧计数。对于后期获取的帧，由于斑点上的信号已足够强，因此更容易进行计数，随后可将该方法应用于早期帧。
    8. 对于同一无拥挤的抗体点，加载并重复步骤 3.1.1 - 3.1.7，处理裂解后采集的时间分辨序列中所有图像帧。使用步骤 2.3.5 中记录的裂解时间校正任何结合曲线。
  2. 单分子计数（拥挤/模拟模式）
    1. 为了计算单个分子的平均强度，在继续操作之前，需重复步骤 3.1.1 - 3.1.8。
    2. 将图像 BKD_FLAT 与 SM_MASK 相乘，生成一幅非零像素值对应于单分子的图像。
      1. 为此，需在以下条件下进行 "过程" 菜单，选择 "图像计算器…，指定操作 "倍增" 以及所需的图像，并选中相应的框 "创建新窗口" 和 "32 位（浮点）结果"
    3. 选择并求和所有像素强度值 "分析" 然后 "测量"；选择结果的汇总统计数据将在结果窗口中显示。根据步骤 3.1.8 统计的单分子数量进行除法运算，以计算单个分子的平均荧光强度。
    4. 对于任何拥挤的抗体斑点，加载裂解后获得的图像，并按照步骤 3.1.2 和 3.1.3 的方法与背景模糊图像进行平场校正。
    5. 将平坦化图像中的每个像素值减去 1（"过程 > 数学"，选择 "减去……”并指定一个值为1）
    6. 在图像的任意一个角落选择一个 50 像素 × 50 像素的区域，测量像素强度的标准差（σ）。详见步骤 3.1.5。
    7. 通过将图像阈值设为3σ来创建二值图像掩膜，并将尺寸小于4像素的任何对象的像素强度值设为零2. 为此，需在以下条件下进行 "分析" 菜单，选择 "分析颗粒" 并指定大小和圆形度。
    8. 将扁平化的抗体斑点图像与二值图像掩膜相乘。
      1. 要执行此操作，在以下条件下 "过程" 菜单，选择 "图像计算器…”，指定操作 "倍增" 以及所需图像，并选中相应复选框 "创建新窗口" 和 "32 位（浮点）结果。"
    9. 通过选择剩余像素强度的总和 "分析" 随后 "测量"选择的汇总统计结果将在结果窗口中显示。
    10. 将像素强度总和除以单分子平均强度，以计算结合到拥挤位点的单分子数量。
  3. 绝对定量的标准曲线
    1. 重复步骤1和2，使用含已知浓度重组蛋白的4% PBSA溶液中的检测抗体，制备10 nL可寻址液滴。
    2. 进行10个浓度梯度的系列实验2- 107 通过调整添加到溶液中的已知浓度重组蛋白，实现每液滴中重组蛋白的数量可控。建议以每液滴蛋白分子数为单位进行操作，以便于单细胞数据的校准。
    3. 使用步骤3.3.2中的浓度梯度数据，将每个位点的单分子计数校准为每个液滴中的蛋白质丰度，并进一步校准为单个细胞中的蛋白质丰度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在人结肠癌细胞系BE细胞中，以单细胞分辨率确定了p53的绝对基础蛋白拷贝数。我们展示了p53表达量可在多个数量级范围内变化，并显示在静息状态的BE细胞群体中，细胞大小与蛋白拷贝数之间存在微弱的正相关关系。

当水相液滴在抗体点样位置被分配并覆盖油相时，可形成可寻址液滴微阵列。在此，这些液滴支持一种高灵敏度的p53蛋白检测。使用接触式微阵列仪和点样针将捕获抗体点样于盖玻片上。抗p53捕获抗体来自商用ELISA检测试剂盒。打印条件使得捕获点直径约为100 µm，每个点的最大捕获容量为6.2 ± 0.5 × 105 个蛋白分子。32

使用与盖玻片键合的隔离器可形成更高密度的液滴，因为它能限制油向邻近抗体捕获位点的扩散。图1A

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

可寻址液滴微阵列是一种灵敏且可扩展的方法，可用于定量测定单个细胞内蛋白质的绝对拷贝数。

在本实验方案中，降低非特异性结合（NSB）水平对于实现尽可能低的检测限至关重要。蛋白质及其他生化物质可能会非特异性地结合到液滴中存在的多种界面——盖玻片表面、抗体点以及油/水界面。蛋白质可能因分配进入界面或油相本身而发生损失。我们已证实，在水相液滴中添加4% BSA可有效抑制使用本方案所指定抗体时的蛋白质非特异性结合。对于其他蛋白质靶标及其相应的检测抗体，可能需要采用不同的封闭策略，例如使用非离子型去污剂或相容性表面活性剂。也可尝试使用氟化油作为封顶油，并评估其适用性。在此类情况下，还需额外考虑封顶油的临界胶束 浓度及其密度等因素。

未清洗的打印缓冲液在点样后仍保留在每个点位，有助于对齐。初次沉积液滴时，需注意避免同心管喷嘴的尖端划伤或损坏抗体点。在进一步开发该方法时，可将荧光染料掺入抗体打印缓冲液中，使其与捕获抗体一同固定。这样即可在液滴点样前完成洗涤和封闭步骤；然而，若采用喷墨打印等自动化 液滴点样方法，则此步骤并非...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

ASR 设计了实验，开发了实验方案并分析了数据。SC 和 PS 进行了细胞大小实验。ASR 和 OC 撰写了稿件。作者谨此衷心感谢 David R. Klug 教授提供设备使用支持。作者谨此感谢帝国理工学院高级创客空间（Imperial College Advanced Hackspace）提供制造与原型开发设施的使用权限。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞培养
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies10010015
DMEM高糖SigmaD6429
胎牛血清（FBS）BiochromS0115
细胞培养瓶康宁SIAL0639
胰蛋白酶/EDTABiochromL2153
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>微阵列
微接触点阵仪DigiLab，英国OmniGrid 微阵列点样仪
微接触针ArrayIt，美国946MP2
盖玻片（Nexterion）肖特，欧洲1098523尺寸（mm）：65.0 × 25.0；厚度（mm）：0.17
p53 捕获抗体EnzoADI-960-070
p53 检测抗体，Alexa Fluor 488 标记圣克鲁斯sc-126储存浓度 200μg/mL
氯化钠-柠檬酸钠缓冲液Gibco15557-044
甜菜碱Sigma61962
十二烷基硫酸钠SigmaL3771
384孔板（低体积）SigmaCLS4511
氮气钢瓶BOC工业级，无氧
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>液滴
显微操作仪EppendorfPatchman NP2
手动显微注射仪EppendorfCellTram Vario
微量移液器丹麦奥格里约MBB-FP-L-0
注射泵KD ScientificKDS-210
100 μL型注射器Hamilton81020气密性PTFE鲁尔锁
1 mL 注射器Hamilton81327气密性PTFE鲁尔锁
硅胶隔离器Grace Bio-LabsJTR24R-A-0.5带粘合剂的6x4孔硅胶隔离板
激光切割机VersaLASEVLS2.30 CO2激光器 3W用于定制隔离器的激光切割
1毫米厚的丙烯酸板Weatherall-英国Clarex 精密片材 001用于定制隔离器的激光切割
粘附片3M用于将定制隔离器粘附到微阵列盖玻片上
超级胶水LoctiteLOCPFG3T
150 μm ID/360 μm OD 熔融石英管IDEXFS-115
1.0 mm 内径/1/16” OD PFA 管IDEX1503
0.014” ID/0.062” OD 聚四氟乙烯管运动性008T16-100
1.0 mm 内径/2.0 mm 外径 FEP 管IDEX1673
牛血清白蛋白（BSA）Fisher ScientificBP9700100
矿物油SigmaM5904
超纯水德国默克密理博公司MilliQ
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>显微镜技术 &光学与光子学
配备编码XY载物台的全内反射荧光显微镜日本尼康尼康 Ti-E
EM-CCD安道尔科技，爱尔兰IXON DU-897E
激光激发光源Vortran，美国Stradus 488-50
光学裂解激光源美国 Continuum 公司Surelite SLI-10
用于TIRF的显微镜滤光片组Chroma，美国z488bp
用于光学裂解的显微镜滤光片组Laser 2000，英国LPD01-532R-25
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>软件
Fiji开源图像分析软件
MatlabMathworks7.14 或更高版本图像分析软件

参考文献

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28(2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046(2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551(2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235(2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

p53
使用可寻址液滴微阵列对单细胞中的蛋白质进行计数
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。