肺内表面面积（ISA）是评估肺部疾病及损伤诱导的肺泡再生过程中肺形态学与生理学的重要指标。本文介绍了一种标准化方法，可最小化在肺切除术和假体植入小鼠模型中对ISA测量的偏差。
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本文内容
摘要
摘要
肺的形态、生理及呼吸功能在生理性和病理性条件下均会发生变化。肺内表面面积（ISA）反映了肺的气体交换能力，是评估呼吸功能的关键指标。然而，观察者偏差可能显著影响肺形态学参数测量值的准确性。本文所述的实验方案可最大限度地减少在测量用于计算ISA的两个形态学参数——肺内体积（ILV）和平均线性截距（MLI）——过程中的变异。我们将ISA作为形态计量和功能参数，用于评估肺切除术（PNX）和假体植入小鼠模型中肺泡再生的效果，发现PNX处理后ISA的增加在胸腔内植入假体后受到显著抑制1。准确量化ISA的能力不仅有望提高肺损伤诱导肺泡再生模型中肺功能研究的可靠性和可重复性，还将促进多种肺部疾病机制的发现。
引言
肺的基本功能是血管与大气之间的氧气和二氧化碳交换。支气管肺发育不良（BPD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）以及急性呼吸道感染等肺部疾病会导致ISA降低2研究肺部疾病的科研人员已开发出多种定量方法，用于评估肺部的形态学变化，包括平均线性截距（MLI）、肺泡内衬体积（ILV）、气体交换单位数量、肺泡表面积（ISA）以及肺组织顺应性。2,3. 韦贝尔的开创性研究 等4 和 Duguid 等5 共同确立了ISA可作为人体肺部气体交换能力的直接测量指标，并可作为判定肺气肿严重程度的标准。过去五年中发表的多项研究已采用肺部形态学参数（例如， ISA 和 MLI）来评估小鼠肺部在发育过程中形态和功能的变化6 以及在PNX损伤后恢复期间1,7ISA 的计算采用 公式 18,9:
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方案
本方案中使用的所有操作均按照北京生命科学研究所《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。8周龄雄性CD-1小鼠饲养于特定病原体-free（SPF）设施中，直至开始实验。手术在完全麻醉的小鼠上进行（即，无任何脚趾夹捏反应）。手术后，小鼠被安置在温暖、潮湿的环境中，并提供充足的食物和新鲜水。小鼠通过腹腔注射过量麻醉剂实施安乐死。
1. 小鼠 PNX 手术
- 用戊巴比妥钠（120 mg/kg 体重）和丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重）通过腹腔注射（I.P.）对小鼠进行完全麻醉。当小鼠对脚趾夹捏不再产生反应时，开始手术。
- 用脱毛剂处理小鼠左侧胸壁区域（约3 × 3 cm）以去除毛发2 区域）。
- 将每只小鼠固定在插管平台上，使其腹侧朝向操作者（图1A).
- 拉出小鼠舌头，并使用带有导管引导槽的小动物喉镜照亮声带18 (图1A).
- 通过观察呼吸时声带的运动来区分声带。以向前倾斜的角度将一根20 G静脉输液套管针轻柔插入气管19.
- 将小鼠置于右侧卧位，并将套管连接至机械呼吸机（例如， 压力控制；参见 <....
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结果
本实验设置了PNX处理组和假体植入（Prosthesis-implanted）组。这些分组方式与本研究团队先前已发表的研究中所采用的分组一致14。
小鼠单侧肺切除术（PNX）及假体植入手术步骤如图2所示。手术及定量分析均采用8周龄雄性CD-1小鼠。在PNX处理组和假体植入组中，均切除左侧肺叶（图2A-2I）。在假体植入组中，左侧肺叶切除后，将一个模拟左侧肺叶大小和形状的假体植入胸腔（图2J-2L）。
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讨论
在本实验方案中，我们详细描述了小鼠左侧肺全肺切除（PNX）及假体植入后肺部参数的测量方法。目前，肺泡表面积指数（ISA）已被视为评估多种肺部疾病以及损伤诱导的肺泡再生过程中呼吸功能的关键指标。然而，尽管肺部研究领域普遍认可ISA作为有效评估指标的价值，但迄今为止，对于计算ISA所依赖的两个参数——肺内残余容积（ILV）和平均线性截距（MLI）——其测量方法的标准化问题却鲜有关注。显然，如同任何测量过程一样，获取无偏倚数据至关重要。本研究的核心目标是为小鼠肺部研究领域建立一套标准化的实验操作流程。
在制定本方案的过程中，我们尝试通过多种方式减少测量偏差的来源。我们发现，通过防止液体泄漏可以减少肺内液体体积（ILV）测量的变异，具体方法是确保插入气管的针头尺寸与之匹配（我们发现18号针头与小鼠气管尺寸较为接近）。我们还发现，在用PFA充气前必须彻底去除小鼠胸壁，以最大限度地减少胸壁对ILV测量结果的潜在影响。平均线性截距（MLI）值在很大程度上依赖于肺泡形态。因此，除了使用年龄和性别匹配的小鼠至关重要之外，在肺组织固定过程中正确维持肺泡形态也极为关键。本文采用了广泛使用的固定方法：使用.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢北京生命科学研究所提供的协助。本工作受到北京市自然科学基金（编号：Z17110200040000）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低成本电凝设备套件 | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| 诺伊斯剪刀 | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| 标准纹显微镊 | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo显微持针器 | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| 血管夹 | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| 静脉留置针-20号 | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| 外科缝合线 | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| 小鼠插管平台 | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| 小动物喉镜 | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO小动物呼吸机 | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| 加热垫 | Stuart equipment | SBH130D | |
| 戊巴比妥钠盐 | Sigma | P3761 | |
| 肝素钠盐 | Sigma | H3393 | |
| 苏木精溶液 | Sigma | GHS132 | |
| 醇溶伊红Y溶液 | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL移液管 | Thermo Scientific | 170356 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| O.C.T.包埋剂 | Tissue-Tek | 4583 | |
| 冷冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| 一次性底模 | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18号针头 | Becton Dickinson | 305199 | |
| 聚维酮碘 | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70%乙醇 | Fisher Scientific | BP82011 | |
| 一次性输液器 | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco | 10010023 | |
| 胶带 | 3M Scotch | 8915 | |
| 棉垫 | Vinda | Dr.P | |
| 硅胶假体 | 定制 | ||
| 明场显微镜 | Olympus | VS120 | |
| 标尺工具 | Adobe Photoshop |
参考文献
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22
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