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方法文章

通过小鼠肺切除术与假体植入测量肺内表面积的标准化方法

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DOI：

10.3791/56114

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2017年7月26日

 ,  , 
1Department of Life Sciences, Peking University, 2National Institute of Biological Sciences, Beijing, 3Graduate School of Peking Union Medical College

本文内容

摘要

肺内表面面积（ISA）是评估肺部疾病及损伤诱导的肺泡再生过程中肺形态学与生理学的重要指标。本文介绍了一种标准化方法，可最小化在肺切除术和假体植入小鼠模型中对ISA测量的偏差。

摘要

肺的形态、生理及呼吸功能在生理性和病理性条件下均会发生变化。肺内表面面积（ISA）反映了肺的气体交换能力，是评估呼吸功能的关键指标。然而，观察者偏差可能显著影响肺形态学参数测量值的准确性。本文所述的实验方案可最大限度地减少在测量用于计算ISA的两个形态学参数——肺内体积（ILV）和平均线性截距（MLI）——过程中的变异。我们将ISA作为形态计量和功能参数，用于评估肺切除术（PNX）和假体植入小鼠模型中肺泡再生的效果，发现PNX处理后ISA的增加在胸腔内植入假体后受到显著抑制1。准确量化ISA的能力不仅有望提高肺损伤诱导肺泡再生模型中肺功能研究的可靠性和可重复性，还将促进多种肺部疾病机制的发现。

引言

肺的基本功能是血管与大气之间的氧气和二氧化碳交换。支气管肺发育不良（BPD）、慢性阻塞性肺疾病（COPD）以及急性呼吸道感染等肺部疾病会导致ISA降低2研究肺部疾病的科研人员已开发出多种定量方法，用于评估肺部的形态学变化，包括平均线性截距（MLI）、肺泡内衬体积（ILV）、气体交换单位数量、肺泡表面积（ISA）以及肺组织顺应性。2,3. 韦贝尔的开创性研究 等4 和 Duguid 等5 共同确立了ISA可作为人体肺部气体交换能力的直接测量指标，并可作为判定肺气肿严重程度的标准。过去五年中发表的多项研究已采用肺部形态学参数（例如， ISA 和 MLI）来评估小鼠肺部在发育过程中形态和功能的变化6 以及在PNX损伤后恢复期间1,7ISA 的计算采用 公式 18,9:

肺内表面面积方程，ISA=4x(ILV)/MLI，生理参数计算。

，其中 ILV 为肺内体积，MLI 为表示肺外周气道大小的中间参数10。

肺叶切除术（PNX）作为一种外科手术，通过切除一个或多个肺叶，已被广泛报道可在包括人类在内的多种物种中诱导肺泡再生。11，小鼠1，狗12，大鼠13和兔子14,15. 对小鼠肺组织在PNX术后14天的研究显示，既有肺泡的扩张以及新肺泡的形成均发生显著变化。 从头合成 肺泡的形成有助于剩余肺组织中肺泡间隔面积（ISA）、肺泡内衬体积（ILV）及肺泡数量的恢复1我们及其他研究者已证实，在肺切除术（PNX）后将海绵、石蜡或定制形状的假体等材料植入空置的胸腔内即，假体植入）会损害肺泡再生。目前已有充分证据表明，机械力是启动肺泡再生的最重要因素之一1,16,17此类研究凸显了将PNX处理和假体植入肺部的ISA值作为定量评估肺泡再生能力的有效标准。

观察者偏倚已知会显著影响肺部形态学参数的测量值（例如，MIL 和 ILV）。通过标准化方案可消除在测定 ILV 和 MLI 时的偏差，而 ILV 和 MLI 是计算 ISA 所依据的两个参数。本文提供了测量这些肺部参数的高详细度标准化操作流程。尤为重要的是，准确量化 ISA 的能力有望提高在损伤诱导的肺泡再生模型中肺功能研究的可靠性和可重复性，并将促进多种肺部疾病的机制研究。

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方案

本方案中使用的所有操作均按照北京生命科学研究所《实验动物护理和使用指南》中的建议进行。8周龄雄性CD-1小鼠饲养于特定病原体-free（SPF）设施中，直至开始实验。手术在完全麻醉的小鼠上进行（即，无任何脚趾夹捏反应）。手术后，小鼠被安置在温暖、潮湿的环境中，并提供充足的食物和新鲜水。小鼠通过腹腔注射过量麻醉剂实施安乐死。

1. 小鼠 PNX 手术

  1. 用戊巴比妥钠（120 mg/kg 体重）和丁丙诺啡（0.1 mg/kg 体重）通过腹腔注射（I.P.）对小鼠进行完全麻醉。当小鼠对脚趾夹捏不再产生反应时，开始手术。
  2. 用脱毛剂处理小鼠左侧胸壁区域（约3 × 3 cm）以去除毛发2 区域）。
  3. 将每只小鼠固定在插管平台上，使其腹侧朝向操作者（图1A).
  4. 拉出小鼠舌头，并使用带有导管引导槽的小动物喉镜照亮声带18 (图1A).
  5. 通过观察呼吸时声带的运动来区分声带。以向前倾斜的角度将一根20 G静脉输液套管针轻柔插入气管19.
  6. 将小鼠置于右侧卧位，并将套管连接至机械呼吸机（例如， 压力控制；参见 材料表）。通过观察小鼠胸部的呼吸运动来检查套管是否已正确插入气管（图1B).
  7. 将呼吸机的吸气压设置为 12 cm H₂O2O，并将呼吸频率设置为每分钟120次（图1B).
  8. 用聚维酮碘和70%乙醇对手术区域的皮肤进行去污处理。
  9. 在第5肋间做一2至3厘米的后外侧开胸切口th 肋间隙，使用Noyes弹簧剪（切割刃：14 mm；尖端直径：0.275 mm）切开皮肤和肌肉图2B，C）。用于开胸手术的外科器械在使用前需进行灭菌处理。
  10. 在5处做1.5 cm切口th 肋间隙以暴露左肺（图2D，E手术过程中，使用高温电灼器止血。
  11. 用钝头镊子从胸腔中提起左肺叶的三分之一图 2F），然后用棉签将整个左肺拉出（图 2G).
  12. 识别左肺叶的肺动脉和支气管（图 2G).
  13. 用丝线外科缝合线在肺门处紧密结扎支气管和血管，并在结扎线远端3–4 mm处切除左肺叶图2H，我).
    注意：切勿剪断左侧肺门处的缝合结，否则可能导致气胸（即，胸腔内的空气或气体（气胸）.
  14. 用1针缝合胸壁，随后依次用5-6针间断缝合肌肉层和皮肤层，每针之间留出3-4 mm间隙。图 2M, 2N).
    注意：手术缝合针应远离心脏；意外刺穿心脏将导致立即死亡。
  15. 用聚维酮碘对手术区域进行消毒。
  16. 手术后，将小鼠置于38 °C的加热垫上，并连接呼吸机，直至小鼠开始出现自主呼吸运动（图 2O).

2. 假体植入

  1. 执行PNX手术步骤1.1至1.13（即操作进行至小鼠左肺叶被切除为止）。
  2. 使用钝头镊子夹住硅胶假体（定制，长12 mm，厚3 mm，宽7 mm，重0.2 g，椭球形）的中心部位（图2J）。在插入前对硅胶假体进行灭菌处理。
  3. 用一只手以镊子夹住肋骨以暴露胸腔，另一只手将假体插入左侧空置的胸腔。
    注意：假体的额状面与胸壁表面之间的插入角度约为45度（图2K，L）。插入假体时操作务必轻柔，用力过大会导致胸膜破裂。
  4. 使用钝头镊子调整假体的方向，确保其完全占据左侧空置的胸腔。
  5. 执行小鼠PNX手术步骤1.14至1.16。

3. ILV 的测定

  1. 准备一个自制装置（"充气管"），该装置由一支移除活塞的一次性移液管（10 mL）、一段40 cm长的软管（带针头适配器）、一个流速控制阀和一支18 G针头组成。组装完成后，用胶带将移液管固定在木板上（图3A）。移液管顶端与实验台之间的距离必须至少为30 cm。
  2. 通过将20 g多聚甲醛（PFA）溶解于500 mL预热的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，在55 °C水浴中配制新鲜的4%多聚甲醛固定液，每10 min手动摇动一次，直至溶液澄清。冷却至室温后，用0.45 µm滤膜过滤溶液。
    注意：操作PFA时需佩戴适当的个人防护装备（PPE）。
  3. 通过过量注射麻醉剂（0.8%苯巴比妥钠，1,000 U/mL肝素）处死小鼠。
  4. 将每只小鼠固定在聚苯乙烯解剖板上，并用70%酒精喷洒体表。
  5. 小心打开小鼠胸腔，用剪刀切除胸骨，充分暴露肺叶。
  6. 用剪刀去除多余组织以暴露气管，并确保将气管与食管分离。
  7. 剪断腹主动脉，并将一支25 G针头插入右心室；在插入前将针头连接至一支20 mL注射器。缓慢将1×PBS推入心脏以清除血细胞，直至肺组织变白。通常需要5–10 mL PBS以清除肺血管中的血液。
  8. 用新鲜的4% PFA充满自制的充气管，并排除充气管中所有气泡。
  9. 将充气管的18 G针头插入气管，并用血管夹夹闭气管，防止液体泄漏。
  10. 在25 cm/H2O2,20的恒定跨肺压下用4% PFA充胀肺组织。在室温下孵育2 h，使肺充分扩张。此"预固定"步骤对维持肺组织形态至关重要。
    1. 通过监测充气管，记录初始4% PFA体积值和最终体积值。肺内体积等于初始4% PFA体积减去最终4% PFA体积。
  11. 结扎气管，并用剪刀轻柔地将肺组织从周围结缔组织中分离出来（保持肺组织完整）。操作需极其轻柔，避免损伤肺组织。
  12. 将肺组织置于装有4% PFA的50 mL锥形管中，在4 °C、轻度振荡（50 rpm）条件下孵育12 h。随后进行组织处理与染色（见第4节）。

4. 组织包埋、切片与苏木精染色 & 伊红（H&E) 染色

  1. 固定后，使用 Noyes 弹簧剪刀修剪心脏及肺部多余的结缔组织。通过剪断连接肺叶与气管的支气管，轻柔地分离各个肺叶。
  2. 在旋转摇床（50 rpm）上用 50 mL 1× PBS 对肺叶进行充分洗涤，共洗涤 3–4 次，每次 30 分钟。
  3. 最后一次洗涤后，将肺叶浸入含 30% 蔗糖的 1× PBS 溶液中，在 4 °C 下进行冷冻保护处理，直至组织沉入 50 mL 锥形管底部（约 12 小时）。
  4. 在包埋和冷冻切片前，用镊子将肺叶样本从管中取出，保留副叶用于组织学分析，用吸水纸轻轻吸去副叶样本表面残留的蔗糖溶液，然后将样本完全浸入含有最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂的培养皿中，约 30 分钟。
  5. 使用冷冻模具，在液氮中速冻 O.C.T. 包埋的副叶样本。将肺叶的最大表面平行于模具底部放置。
  6. 进行冷冻切片时，每个样本共制备三张 10 µm 厚的切片用于组织学分析。弃去前 1 mm 组织，收集第一张 10 µm 切片，再弃去 0.5 mm 组织，收集第二张切片，再次弃去 0.5 mm 组织，最后收集第三张（终末）切片。
  7. 在进行 H&E 染色前，将切片在空气中干燥 1 小时。
  8. 进行 H&E 染色
    1. 用 3–4 次蒸馏水更换洗涤切片，然后将切片浸入新鲜苏木精染液中染色 2 分钟；在流动的自来水下冲洗切片；将切片浸入 1% HCl-70% 乙醇溶液中两次，以去除多余的苏木精。
    2. 将切片浸入新鲜伊红染液中染色 3 分钟；依次用 95% 乙醇洗涤两次，每次 30 秒，再用 100% 乙醇洗涤两次，每次 30 秒进行脱水；用二甲苯透明 30 秒，更换新鲜二甲苯重复透明一次；使用盖玻片和封片剂封片。

5. MLI 的定量分析

  1. 使用明场显微镜获取苏木精-伊红（H&E）染色的副叶组织切片的数字图像（20倍放大）。
  2. 为量化平均线性截距（MLI），从每例副叶组织的3张切片中合适的区域（避开动脉、静脉、主气道和肺泡管）随机选取共15个无重叠的视野（每个视野1,000 µm × 1,000 µm）。
  3. 使用标尺工具在选定视野区域上叠加一个网格，该网格包含10条均匀分布的垂直线和10条均匀分布的水平线，每条线长度为1,000 µm，相邻线间距为100 µm（图4B）。
  4. 将相邻两个肺泡上皮之间的线性长度定义为一个截距值。测量每条1,000 µm长度线上所有截距的数值。
  5. 对每个网格，量化10条水平方向1,000 µm长度线和10条垂直方向1,000 µm长度线上所有截距的数值。
    注意：MLI为从每例副叶组织制备的3张切片中总共15个网格所分析得到的截距长度的平均值。

6. ISA 的计算

  1. 使用公式1（见引言部分）计算ISA。ILV的测量方法见第3节，MLI的定量方法见第5节。

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结果

本实验设置了PNX处理组和假体植入（Prosthesis-implanted）组。这些分组方式与本研究团队先前已发表的研究中所采用的分组一致14。

小鼠单侧肺切除术（PNX）及假体植入手术步骤如图2所示。手术及定量分析均采用8周龄雄性CD-1小鼠。在PNX处理组和假体植入组中，均切除左侧肺叶（图2A-2I）。在假体植入组中，左侧肺叶切除后，将一个模拟左侧肺叶大小和形状的假体植入胸腔（图2J-2L）。

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讨论

在本实验方案中，我们详细描述了小鼠左侧肺全肺切除（PNX）及假体植入后肺部参数的测量方法。目前，肺泡表面积指数（ISA）已被视为评估多种肺部疾病以及损伤诱导的肺泡再生过程中呼吸功能的关键指标。然而，尽管肺部研究领域普遍认可ISA作为有效评估指标的价值，但迄今为止，对于计算ISA所依赖的两个参数——肺内残余容积（ILV）和平均线性截距（MLI）——其测量方法的标准化问题却鲜有关注。显然，如同任何测量过程一样，获取无偏倚数据至关重要。本研究的核心目标是为小鼠肺部研究领域建立一套标准化的实验操作流程。

在制定本方案的过程中，我们尝试通过多种方式减少测量偏差的来源。我们发现，通过防止液体泄漏可以减少肺内液体体积（ILV）测量的变异，具体方法是确保插入气管的针头尺寸与之匹配（我们发现18号针头与小鼠气管尺寸较为接近）。我们还发现，在用PFA充气前必须彻底去除小鼠胸壁，以最大限度地减少胸壁对ILV测量结果的潜在影响。平均线性截距（MLI）值在很大程度上依赖于肺泡形态。因此，除了使用年龄和性别匹配的小鼠至关重要之外，在肺组织固定过程中正确维持肺泡形态也极为关键。本文采用了广泛使用的固定方法：使用...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢北京生命科学研究所提供的协助。本工作受到北京市自然科学基金（编号：Z17110200040000）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
低成本电凝设备套件Fine Science Tools18010-00
诺伊斯剪刀Fine Science Tools15012-12
标准纹显微镊Fine Science Tools11000-12
Castroviejo显微持针器Fine Science Tools12060-01
血管夹Fine Science Tools18374-44
静脉留置针-20号Jinhuan Medical Product Co., LTD.29P0601
外科缝合线Jinhuan Medical Product Co., LTD.F602
小鼠插管平台Penn-Century, IncModel MIP
小动物喉镜Penn-Century, IncModel LS-2-M
TOPO小动物呼吸机Kent ScientificRSP1006-05L
加热垫Stuart equipmentSBH130D
戊巴比妥钠盐SigmaP3761
肝素钠盐SigmaH3393
苏木精溶液SigmaGHS132
醇溶伊红Y溶液SigmaHT110116
10 mL移液管Thermo Scientific170356
多聚甲醛SigmaP6148
O.C.T.包埋剂Tissue-Tek4583
冷冻切片机LeicaCM1950
一次性底模Fisher HealthCare22-363-553
18号针头Becton Dickinson305199
聚维酮碘Fisher Scientific19-027132
70%乙醇Fisher ScientificBP82011
一次性输液器WeigaoSFDA 2012 3661704
磷酸盐缓冲液Gibco10010023
胶带3M Scotch8915
棉垫VindaDr.P
硅胶假体定制
明场显微镜OlympusVS120
标尺工具Adobe Photoshop

参考文献

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