通过使用植物来源的毒素秋水仙素进行两次处理，可杀死分裂中的细胞，从而获得无神经的Hydra vulgaris。这些Hydra无法自主摄食或排遗。本文介绍了一种在实验室中长期维持无神经Hydra vulgaris的改进方法。
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摘要
摘要
水螅的间质细胞谱系包含多能干细胞及其衍生物：腺细胞、刺细胞、生殖细胞和神经细胞。Hydra 的间质细胞可通过连续两次秋水仙素处理予以消除，秋水仙素是一种来源于植物的毒素，可杀死分裂中的细胞，从而消除源自间质干细胞的分化细胞的再生能力。这使得能够获得缺乏神经细胞的 Hydra。无神经细胞的水螅息肉无法张开其口部进行摄食、排遗或调节渗透压。然而，若定期进行强制喂食并实施“排气”操作，这类动物可在实验室中长期存活并无限期培养。缺乏神经细胞的特性使得研究人员能够探究神经系统在调控动物行为与再生过程中的作用。以往发表的无神经细胞 Hydra 培养方案涉及已过时的技术，例如使用手工拉制的微移液管尖端通过口吸方式喂食和清洗 Hydra。本文介绍了一种改进的无神经细胞 Hydra 培养方案。该方法使用尖头镊子强制张开其口部，并插入新鲜杀死的卤虫（Artemia）进行喂食。强制喂食后，使用注射器和皮下注射针头将新鲜培养基注入动物体腔，以清除未消化的残渣，此过程在此称为“排气”（burping）。这种利用镊子和注射器对无神经细胞 Hydra 进行强制喂食与排气的新方法，取代了需手工拉制微移液管尖端并通过口吸操作的旧技术，从而使整个过程更安全且显著提高时间效率。为确认口锥部位的神经细胞已被完全清除，需采用抗酪氨酸化微管蛋白抗体进行免疫组织化学检测。
引言
Hydra 的神经系统由神经网组成，其中神经元与两种上皮组织层均有关联1。神经网在垂唇和柄部区域更为密集，而在体柱区域则较稀疏2。神经细胞起源于间质干细胞，这类多能干细胞可分化为分泌细胞、刺细胞、生殖细胞以及神经元1。通过秋水仙素处理，可以消除Hydra vulgaris中的间质细胞3,4。秋水仙素是一种植物来源的毒素，可杀死正在分裂的细胞。尽管在其他生物中已发现秋水仙素能够抑制微管聚合，但先前的研究表明，在整个处理过程中，Hydra 体内始终存在微管，提示秋水仙素在Hydra中并非通过该机制发挥作用3。另有研究指出，秋水仙素在某些生物中无法有效结合微管蛋白，例如Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas和Schizosaccharomyces pombe，这可能解释了上述差异5。秋水仙素处理会诱导内胚层上皮细胞对间质细胞进行吞噬3，从而获得缺乏神经细胞、腺细胞和刺细胞的动物个体。目前尚不清楚为何间质细胞对秋水仙素处理特别敏感。鉴于终末分化的间质细胞以及间质干细胞谱系均受到损伤并被吞噬，Campbell 得出结论：秋水仙素并非直接作用于有丝分裂活性3。值得注意的是，秋水仙素处理在Hydra vulgaris中效果良好，但在其他物种（如Hydra oligactis）中效果较差6。 采用秋水仙素与羟基脲联合的改良处理方法可用于制备无神经的Hydra viridis7。因此，无神经Hydra（有时也称为"上皮型Hydra"8）是研究源自间质细胞谱系的这些特化细胞类型在组织稳态与再生过程中作用的有力工具。
Hydra 可能是目前已知唯一一种能够在没有神经系统的情况下生存的动物。无神经的 Hydra 是研究神经网在调控 Hydra 再生、稳态和行为中作用的特别有用模型。例如，通过移植将间质细胞引入无神经的 Hydra，使研究人员能够表征神经细胞分化具有高度区域特异性9。此外，由于无神经的 Hydra 仍具备再生能力，因此可用于探究不依赖神经系统的替代性再生通路。一个典型的例子是顶端神经发生和头部形成：在野生型 Hydra 中，这一过程依赖于神经系统中 cnox-2 基因的功能；但在无神经的 Hydra 中该基因似乎并非必需，提示可能存在一种替代性的头部再生机制10。
无神经的Hydra也被用于研究神经发生丧失后上皮细胞中神经发生和神经传递相关基因的表达与调控11。无神经的Hydra不会出现自发性收缩爆发12，表明这些收缩爆发受神经系统调控。然而，无神经的Hydra在用镊子夹捏体柱时仍会发生收缩，提示对机械刺激的收缩反应是通过上皮细胞中的间隙连接介导的，而自发性收缩行为则是通过神经细胞中的间隙连接介导的13。
在接触食物或还原型谷胱甘肽时，无神经的Hydra不会张开其口部，这表明感觉神经元对于检测食物的存在并向口部传递开启信号是必需的3。此外，神经网似乎在感知渗透压方面也发挥作用，因为无神经的个体无法通过自主张口来调节内部静水压，从而呈现出特征性的气球状外观3,4（图1B）。通过对无神经的Hydra频繁进行人工放气以调节静水压，可使口锥和体柱的部分异常形态有所改善。然而，长期放气会干扰其生长、伸长、出芽及组织结构的形成8。
尽管无神经的Hydra无法自主摄食和排遗，但仍可通过人工强制喂食并逐个“打嗝”排气的方式在实验室中长期维持。先前已有文献描述了对无神经Hydra进行强制喂食和打嗝的方法，但这些方案需要使用手工拉制至合适尺寸的微移液器吸头，并通过管路连接吹嘴进行操作14。本文介绍一种更简单、更安全且更省时的喂食与打嗝方法。
此外，以往的研究通过将固定的动物解离为单个细胞，并观察细胞形态来检测神经细胞的缺失3,4,15。本研究中，采用针对α-微管蛋白酪氨酸化羧基末端的单克隆抗体进行免疫组织化学染色，作为与机械解离法互补的方法，以检测口面（hypostome）中神经元是否被清除13,16。先前研究表明，该抗体也可用于显示柄部（peduncle）中的神经元13，但这些神经元以及体柱（body column）中的神经元较难辨认。尽管免疫组织化学足以确认口面中神经细胞的缺失，且无需依赖细胞类型形态学的专业判断，但它无法用于检测间质干细胞及其所有衍生细胞是否存在。细胞解离结合形态学分析的方法更为严谨，可对处理各阶段后每种细胞类型的残留数量进行定量评估。
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方案
1. 双重秋水仙素处理
- 配制0.4%（重量/体积）的秋水仙素溶液 水螅 培养基3,4,17.
注意： 秋水仙碱具有急性毒性，吞食致命，可能引起遗传性缺陷，并可能导致眼部损伤。操作粉末时应在通风橱中进行，并穿戴全套个人防护装备（PPE）。 - 孵育 Hydra vulgaris （此处使用了AEP菌株）在0.4%秋水仙素中以5:1的比例饥饿处理24小时 水螅 在黑暗条件下于室温孵育8小时，每毫升秋水仙素溶液置于培养皿中。
注意： 5 水螅/mL 秋水仙素是确定使用多少溶液以避免培养皿中细胞过密生长的参考依据 水螅使用相同体积的溶液进行后续的清洗和溶液更换。 - 移除秋水仙素溶液，并更换为新鲜的 水螅 不含秋水仙素的培养基。洗涤 水螅 用玻璃巴斯德吸管在洁净的容器中连续转接5次 水螅 转移至含 50 µg/mL 利福平的培养基之前 水螅 培养基。保持 水螅 在18 °C的培养箱中。
注意： 足够的1,000倍浓缩利福平储备液（50 mg/mL）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，可用于1至2周的处理，可储存于4 °C。具体用量可根据每天使用的溶液总体积确定。例如，若有2个培养皿，每个含有10 mL溶液，且每天更换两次，则一天共使用40 mL溶液，相当于每天使用40 µL的1,000倍浓缩储备液，或两周内共使用560 µL。该储备液随后按1:1000比例稀释于 水螅 使用时的培养基。
注意： DMSO 是一种易燃液体，可迅速穿透皮肤，使其他溶解的化学物质进入体内。操作该溶剂时应在通风橱中进行，并穿戴全套个人防护装备。需要注意的是，DMSO 在 4 °C 时会冻结 - 更换含利福平的 水螅 每天两次更换培养基，直至 水螅 停止向培养基中排出细胞，通常在处理后1周左右发生。此时，培养基可每天更换一次。在处理后的数天内， 水螅 将完全失去它们的触手。避免让 水螅 相互接触，因为它们可能会融合在一起，形成形状异常的 水螅 (图2A).
- 为防止接触，避免以旋转方式摇晃培养皿。应轻轻沿垂直和水平方向振荡培养皿，直至 水螅 分开。放置培养皿后应进行检查 水螅 放入18 °C培养箱，并根据需要进行调整。
注意： 对于需要每天更换两次培养基的日子，分别在上午和下午/晚上各更换一次培养基。
- 为防止接触，避免以旋转方式摇晃培养皿。应轻轻沿垂直和水平方向振荡培养皿，直至 水螅 分开。放置培养皿后应进行检查 水螅 放入18 °C培养箱，并根据需要进行调整。
- 一旦触手开始形成，即开始进行强制喂食并帮助排气 水螅 每周3至4次（见第2和第3节）。秋水仙素处理后约8-9天， 水螅 将开始再生它们的触手。
注意： 触手再生情况因个体而异。有些个体可能需要超过8至9天才能显示出触手再生的迹象。未能良好再生触手或再生触手形态异常的个体（图2B) 动物或体型过小无法喂食的动物应被移除。这些 水螅 很可能无法承受第二次治疗。 水螅 也可能出芽。然而，一些芽体可能仍含有间质细胞，并能独立摄食。- 移除所有能够自主摄食且已从母体脱离的幼体。通过添加活体饵料来识别这些个体 卤虫 放入饲喂盘中，观察动物是否捕捉并食用 卤虫 由其自身决定。1 或 2 水螅 也可能能够自主进食。这些也应丢弃。
注意： 无神经 水螅 具有特征性的气球状形态，触手比正常情况更短更细（由于刺细胞缺失），因此可轻易与外观正常的动物区分开来（图1A，1B).
- 移除所有能够自主摄食且已从母体脱离的幼体。通过添加活体饵料来识别这些个体 卤虫 放入饲喂盘中，观察动物是否捕捉并食用 卤虫 由其自身决定。1 或 2 水螅 也可能能够自主进食。这些也应丢弃。
- 在首次秋水仙素处理后的三周，重复进行秋水仙素处理（步骤1.1–1.5）。第二次秋水仙素处理对于清除残留的间质细胞和神经元细胞是必要的。3.
2. 强制喂食
- 添加 卤虫 将囊肿转移至底部收窄的细高玻璃容器中。向容器中注满 卤虫 水（6.72 M NaCl）。为获得更高的孵化率，避免每升水中加入超过1 g的休眠卵。
- 用封口膜覆盖容器顶部，并将一支10 mL血清移液管穿过封口膜插入容器中。通过将软管连接至水族箱空气泵，并将软管套在移液管上，以提供通气。确保移液管尖端到达容器底部，且无包囊沉积在底部。 卤虫 48小时后孵化。
注意： 孵化方法有多种不同方式 卤虫 效果可能同样良好。
- 用封口膜覆盖容器顶部，并将一支10 mL血清移液管穿过封口膜插入容器中。通过将软管连接至水族箱空气泵，并将软管套在移液管上，以提供通气。确保移液管尖端到达容器底部，且无包囊沉积在底部。 卤虫 48小时后孵化。
- 过滤 卤虫 来自 卤虫 水在 卤虫 网片（可从水族用品公司购买），在放入培养皿前用去离子水冲洗约 20 秒 水螅 培养基。盐度 卤虫 水的含量过高，不适合 水螅，因此 卤虫 使用前必须清洗。
- 在解剖显微镜下，处死该 卤虫 用精细镊子轻轻挤压。避免用力过猛导致内脏挤出，否则会黏附在镊子上，影响喂食。轻轻挤压 卤虫 在将其喂给 水螅 将有助于消化过程14. 将 freshly killed 的样本置于 卤虫 靠近 水螅 在培养皿中以促进快速摄食。
注意： 所有后续步骤均在解剖显微镜下进行。 - 使用一对镊子夹住 水螅 通过花梗。在喂食过程中继续握住花梗 水螅使用另一把镊子夹住体柱，以使 水螅 收缩
- 用第二对镊子的尖端轻轻敲击水螅口端的基盘中央（即口端的圆顶状结构）。有时这样做可使口张开。若敲击后口仍未张开，则将镊子插入基盘中心以刺破口部，随后略微松开镊子尖端的压力，以扩大刺破所形成的口部开口。
注意： 的 水螅 张口时可能会塌陷和萎缩（图2C）。如果发生这种情况， 卤虫 可能仍可插入到 水螅如果过于困难，则继续进行下一步 水螅 并返回到原始状态 水螅 一段时间后再次尝试。 水螅 在随后的张口过程中 tends 不会明显回缩。 - 快速拾取 卤虫 用镊子夹取并插入 水螅的胃腔。插入尽可能多的 卤虫 尽可能继续，直到胃腔充满且无法再容纳更多 卤虫 无法插入而不造成损坏 水螅，意外拔出任何 卤虫 内部，或阻碍口腔闭合。平均而言，此数值为 5 - 6 卤虫然而，最多已给体型较大的动物喂食了12只。
- 如果口部开始闭合，用镊子如上所述再次将其撑开；但需谨慎操作，因为任何 卤虫 动物体内的物质可能在张开嘴时开始流出。
- 如果 水螅 太小，无法用于整体 卤虫，剪切 卤虫 使用解剖刀并进行喂养 水螅 较小的片段。如果 卤虫 不会停留在内部 水螅，可能需要将镊子压在 卤虫 以将其保留在内部 水螅 直到其口部闭合。
- 转移已喂养的 水螅 用玻璃巴斯德吸管小心地转移到含有新鲜50 µg/mL利福平的培养皿中，避免意外溢出 水螅 培养基。如果一个 卤虫 被驱逐出 水螅 转移时，在新的培养皿中重新插入。
注意： 使用玻璃移液管转移 水螅，因为已有研究发现 水螅 与玻璃相比，塑料材质的移液管更不易粘附。移液管的长度并无影响，但使用5英寸的移液管可能操作起来更为方便。
3. 去气
- 排气 水螅 在喂食后8至20小时之间的任意时间去除未消化的物质。
- 用P320或类似目数的砂纸将30G注射针针尖打磨至平整。
注意： 27G 的皮下注射针头也可使用，但较细的高规格针头尖端更佳。 - 将针头连接至一次性 1 mL 塑料注射器，并用新鲜的 50 µg/mL 利福平溶液充满注射器 水螅 培养基
注意： 单次排气 水螅 需要约0.05 mL至0.1 mL溶液。建议使用1 mL注射器，因为使用较大容量的注射器更难控制溶液流出的力度和体积。 - 在解剖显微镜下，握住花序梗的梗部 水螅 用尖头镊子夹住，在口下盘中央用针轻敲。如果口未张开，将镊子插入口下盘，按上述摄食方法将口打开。
注意： 所有后续步骤均在解剖显微镜下进行。 - 使用注射器轻轻冲洗胃腔，注意力度要轻柔，以免将整个生物体冲走，用 50 µg/mL 利福平溶液冲洗直至所有碎屑完全排出。针头不一定需要插入到 水螅 如果尺寸的 水螅 不允许。针头可靠近口部开口处，并直接对准口腔方向。
- 使用玻璃巴斯德移液管转移已除气的 水螅 加入含有新鲜50 µg/mL利福平的培养皿中 水螅 培养基
4. 质量控制 通过 免疫组织化学
注意：以下实验方案改编自 Shenk, M. A, 等18 和 Böttger, A19 的方案。除非另有说明，所有步骤均在室温（RT）下进行。孵育步骤可使用摇床，可能有助于提高染色质量。然而，若 Hydra 个体相互缠绕，也可不使用摇床完成所有步骤。
- 配制封闭液：在1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入10%胎牛血清（FBS）和1%二甲基亚砜（DMSO）。将该溶液保存于4 °C，待后续使用（步骤4.6和4.11）。此溶液可保存1–2天。
注意： 本方案中使用的所有溶液必须作为危险废物妥善收集。 - 放松 水螅 在200 µL的2%乌拉坦中 水螅 在1.7 mL微量离心管中孵育1分钟。使用5 水螅 每种条件每管各一份：无神经组、未处理组、未处理且无一抗组、未处理且无二抗组。
注意： 不要超过1分钟。此处计时至关重要，因为动物在乌拉坦中停留时间过长后状况会变差。 - 去除聚氨酯并固定 水螅 在200 µL的4%多聚甲醛（PFA）中 水螅 培养基中孵育15分钟。
- 用1×PBS洗涤样品，每次10分钟，共洗涤3次。
注意： 所有 PBS 和 PBSTx 洗涤步骤均使用 500 µL 溶液。 - 用500 µL含0.5% Triton X-100的PBS溶液透化处理15分钟。
- 去除0.5% Triton X-100，加入500 µL封闭液。样本封闭至少1小时。
- 在封闭液中以1:200的比例稀释抗酪氨酸微管蛋白抗体。
注意： 该浓度系通过实验确定。若对照组信号过弱，可能需要提高浓度；若出现非特异性结合，则可能需要降低浓度。抗体的预孵育也可能有助于减少非特异性结合。 - 去除样本中的封闭液，加入 200 µL 一抗至无神经组织样本中 水螅，未处理对照组，以及无一抗的未处理对照组。对于无一抗的未处理对照组，仅加入 200 µL 封闭液，不加抗体。
- 孵育样品过夜（>4 °C 下 12 小时
注意： 或者在室温下孵育5 - 6小时。 - 移除一抗，用含0.3% Triton X-100的1x PBS（PBSTx）对样本进行充分洗涤。
注意： 保存一抗并于 4 °C 保存，可重复使用至少 2 - 3 次。 - 将山羊抗小鼠hP二抗用封闭液按1:500稀释，每孔加入200 µL至无神经组织样本中 水螅，未处理对照组，以及无一抗的未处理对照组。对于无二抗的未处理对照组，仅加入200 µL封闭液，不加抗体。
注意： 或者可使用荧光标记的二抗，此时无需执行步骤4.13至4.17。使用荧光二抗可节省时间，通常已足够满足实验需求，但辣根过氧化物酶（hP）标记的二抗具有更高的灵敏度。二抗的浓度需通过实验确定。若对照组信号过弱，可能需要提高浓度；若出现非特异性结合，则可能需要降低浓度。 - 4 °C 条件下孵育样品过夜。
- 去除二抗，并用PBSTx对样本进行充分洗涤。
- 配制1×PBT：含0.2%牛血清白蛋白（质量/体积）和0.05% Tween20的1×PBS溶液。将样品在1×PBT中孵育30分钟。
- 去除1x PBT，将样品在1:1,000 NHS-荧光素和1:10,000 H2O2 在1x PBT中避光孵育15分钟。从这一步开始，应尽可能将样品保持在避光条件下，因为荧光信号在光照下会减弱。
注意： NHS-荧光素的制备参照King, R. S. 和 Newmark, P. A. 详细描述的FISH实验方案进行。20 - 用 PBSTx 快速洗涤样品 3 次，然后每次 30 分钟，共洗涤 2 次。
- 将样品在4 °C条件下于PBSTx中继续孵育过夜以进行洗涤。
- 用1×PBSTx再洗涤几次。如需对细胞核进行可视化，可进行以下可选步骤，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）对DNA进行复染。否则，样品现在即可进行成像。
- 将5 mg/mL的DAPI储备液用PBSTx稀释至1:500的工作浓度，每管加入200 µL。样品于室温孵育30分钟。
注意： DAPI 是一种已知致癌物。请穿戴全套个人防护装备。 - 去除 DAPI，用 PBSTx 洗涤样本 2 至 3 次，然后进行荧光显微镜成像。
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结果
在初始的8小时秋水仙碱处理后，所有Hydra均能存活。其中一些Hydra仅残留触手残基（图3A），而另一些则已完全失去触手（图3B）。在随后的1至2天内，触手会持续萎缩，直至所有Hydra均丧失触手。处理约1周后，Hydra将开始出现触手再生的迹象，先长出短小的芽状触手（图3C），随后完全再生出触手（图3D）。在最初的Hydra群体中，约有50–60%在处理后1至2周内最终实现触手再生。
第二次...
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讨论
水螅 通过两次秋水仙素处理可消除间质细胞3,4首次处理后的几天内，必须防止个体之间的相互接触 水螅 以避免融合 水螅 碎片变形 水螅此外，在首次处理后能够自主进食的动物必须被移除，因为第二次秋水仙素处理可能不足以清除这些动物体内残留的间质细胞。为最大化无神经动物的存活率 水螅 第二次秋水仙素处理后，应给动物饲喂尽可能多的 卤虫 尽可能在第一次处理恢复后立即进行，每次喂食间隔1-2天，以恢复和生长。每次秋水仙碱处理都会导致 水螅 随着细胞被排出，其尺寸会显著减小，因此尺寸越大 水螅 在每次治疗之前进行，越早进行，成功的几率就越大 水螅 将恢复至可喂养和维持的大小。
由于存活率较低 水螅 每次处理后，可能需要从大量样本开始 水螅然而，在开始治疗时，对患者进行过多治疗必须谨慎对...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢加州大学欧文分校的 Dick Campbell 博士就生成和维持无神经动物原始方案的讨论，感谢王瑞女士在改进注射器和针头技术方面的帮助，感谢加州大学欧文分校的 Danielle Hagstrom 女士和 Rob Steele 博士对稿件提出的修改意见。本研究工作得到了 RCSA 和美国国家科学基金会（NSF）CMMI-1463572 项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 秋水仙碱 | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 mL 注射器 | BD | 301025 | |
| 卤虫卵 | Brine Shrimp Direct | N/A | 可在当地购买 |
| 卤虫孵化皿 | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm × 15 mm 培养皿 | Celltreat | 229663 | |
| 30 G × 3/4" 皮下注射针头 | Covidien | 1188830340 | 也可使用 27G 针头 |
| 2 个细尖镊子 | Dumont | 0109-5-PO | |
| 利福平 | EMD Millipore | 557303 | |
| 山羊抗小鼠 IgG 多克隆抗体（HRP 标记） | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher | BP9703-100 | |
| 手术刀 | Fisher | 08-920A | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10437028 | |
| DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐） | Invitrogen | D1306 | |
| PBS 片剂 | MP Bio | 2810305 | |
| 抗酪氨酸化微管蛋白单克隆抗体 | Sigma | T9028 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D2650 | |
| 过氧化氢 | Sigma | 216763 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma | P6148 | |
| 吐温 X-100 | Sigma | T9284 | |
| 吐温 20 | Sigma | P1379 | |
| 尿烷 | Sigma | U2500 | |
| 气泵 | Tetra | 77846-00 | |
| 玻璃巴斯德吸管 | VWR | 53283-916 | 吸管长度不限 |
| 15 mL 离心管 | VWR | 89039-670 | |
| P320 砂纸 | 3M | IBGABBV00397 | 可在当地家居装修商店购买 |
参考文献
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