本研究的主要目的是调整针浸式玻璃化冷冻（NIV）程序，用于整块斑马鱼睾丸的冷冻保存。此外，还测试了该方法在五种不同斑马鱼品系中的可重复性。
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本文内容
摘要
摘要
当前科学与生物技术的发展趋势导致模式生物中产生了数千个新品系，从而迫切需要开发超越常规保种群体维持方法的新型遗传资源安全保存技术。本研究的主要目的是将针浸式玻璃化冷冻法（NIV）应用于整块斑马鱼睾丸的低温保存。通过整睾丸NIV法对早期生殖细胞进行冷冻保存，为斑马鱼遗传资源的储存提供了可能，尤其在于这些细胞在移植后能够发育为雄性和雌性配子。实验中将睾丸切除后固定于针灸针上，依次在两种冷冻保护剂中平衡（平衡液含1.5 M甲醇和1.5 M丙二醇；玻璃化冷冻液含3 M二甲基亚砜和3 M丙二醇），随后直接浸入液氮中。样品在三步连续的复温溶液中进行升温。该技术的主要优势包括：（1）复温后的睾丸经消化处理不产生精子，从而有利于后续操作；（2）超快速冷却使组织与液氮接触达到最优，最大化冷却效率，同时降低所需冷冻保护剂浓度，从而减少其毒性；（3）多个睾丸可同步暴露于冷冻保护剂和液氮中；（4）在五种不同的斑马鱼品系中均实现了超过50%的细胞存活率，证明了该方法的可重复性。
引言
科学与生物技术领域的新趋势已催生出数千种新的小鼠、Drosophila、斑马鱼及其他用作生物医学和其他科学研究模式生物的突变品系1。此外，随着新技术的不断开发和普及，突变品系的数量持续增长2。这使得人们有必要采用超越常规繁殖群体维持方式的遗传资源安全保存方法。冷冻保存作为一种能够长期安全保存遗传资源的技术，具有诸多优势，例如可延长繁殖季节、避免亲本群体的持续维护，并且在成本和人力方面更为高效2。
近年来建立的精子冷冻保存方案2,3,4 为成功保存斑马鱼雄性遗传物质提供了可能。然而，由于鱼类卵子或胚胎结构复杂且含有大量卵黄物质，目前尚无法实现其冷冻保存。最近，原始生殖细胞（PGCs）或精原干细胞（SSCs）移植技术的应用为克服这一障碍提供了新途径，这些细胞在移植后可发育成功能性的精子和卵子5。因此，SSCs 的冷冻保存为珍稀和宝贵遗传资源的保护开辟了新的前沿领域。
尽管冷冻保存具有诸多优势，但慢速冷冻过程会产生多种可能导致细胞损伤的....
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方案
本文所述所有方法均已获得匈牙利动物福利法的批准。
1. 试剂配制
- 储备溶液
- 通过将 0.378 g 海藻糖二水合物加入 1 mL 去离子水（dH2O）中配制 1 M 海藻糖溶液。充分混匀直至完全溶解。
- 通过将 0.342 g 蔗糖加入 1 mL 去离子水（dH2O）中配制 1 M 蔗糖溶液。充分混匀直至完全溶解。
- 通过 将 0.238 g HEPES 加入 1 mL 去离子水（dH2O）中配制 1 M HEPES 溶液。充分混匀直至完全溶解。
- 通过 将 100 mg 胶原酶（290 U/mg）加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 20 mg/mL 胶原酶溶液。彻底混匀至溶解。使用 0.2 µm 滤器无菌过滤。分装 50 µL 至 0.2 mL PCR 管中，于 -20 °C 冻存。
- 通过 将 75 mg 胰蛋白酶（~10000 U/mg）加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 15 mg/mL 胰蛋白酶溶液。彻底混匀至溶解。使用 0.2 µm 滤器无菌过滤。分装 50 µL 至 0.2 mL PCR 管中，于 -20 °C 冻存。
- 通过 将 5 mg DNase I（~3000 U/mg）加入 5 mL....
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结果
通常情况下，从单个新鲜的斑马鱼精巢中分离得到的早期生殖细胞数量在40,000至200,000个细胞之间，具体数量取决于鱼体大小。在对全部5个品系的新鲜斑马鱼精巢进行消化时，细胞悬液中不仅含有早期生殖细胞（图2），还发现了大量精子。相反，在解冻冷冻保存的精巢并进行消化后，精子数量显著减少。这表明精子无法耐受这种超快速冷冻方案，且极有可能在消化过程中被清除，从而获得纯度更高的早期生殖细胞悬液。
通过消化3条AB系雄性斑马鱼的新鲜睾丸组织发现，同一个体左右两侧睾丸中早期生殖细胞数量之间无显著差异（1 ± 0.5 × 105 vs 1.1 ± 0.7 × 105）（单因素方差分析；F(1,4) = 0.04，p = 0.85）。在本研究使用的所有斑马鱼品系中，当前的超快速冷却方案所获得的平均存活率均高.......
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讨论
本研究的主要目的是将先前为鸟类和哺乳动物物种开发的针浸式超快速冷却方法10,11,12，应用于鱼类精巢（以斑马鱼为模式生物）的冷冻保存。以往关于斑马鱼遗传资源冷冻保存的研究主要集中在斑马鱼精子的冷冻保存上2,3,4。然而，成熟的卵母细胞和胚胎的冷冻保存方案尚未建立，尽管最近一些研究表明早期卵母细胞的冷冻保存是可行的14,15。在本研究中，我们成功实现了斑马鱼精原细胞的冷冻保存，这为保存珍贵的遗传资源提供了新的可能，尤其重要的是，这些精原细胞在移植后能够发育为雄性和雌性配子5。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由匈牙利国家研究、开发与创新办公室（项目编号 116912，授予 ÁH）、COST 办公室（食品与农业 COST 行动 FA1205：AQUAGAMETE）、匈牙利奖学金项目（授予 ZM）以及新匈牙利国家卓越博士前奖学金（授予 EK）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Leibovitz 培养基 (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | 添加 L-谷氨酰胺 |
| 胎牛血清 (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| 三卡因甲磺酸盐 (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 蔗糖 | Acros Organics | 57-50-1 | |
| 海藻糖 | Acros Organics | 99-20-7 | 二水合物 |
| 甲醇 | Reanal | 20740-0-08-65 | |
| 丙二醇 | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| 二甲基亚砜 | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| 胶原酶 | Gibco | 9001-12-1 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNase I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | 用于配制 200 ml PBS 溶液的片剂 |
参考文献
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M.
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重印与许可
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