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方法文章

斑马鱼精原细胞的全睾丸针浸式超快速冷冻保存

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DOI：

10.3791/56118

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2018年3月4日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Aquaculture, Szent István University

本文内容

摘要

本研究的主要目的是调整针浸式玻璃化冷冻（NIV）程序，用于整块斑马鱼睾丸的冷冻保存。此外，还测试了该方法在五种不同斑马鱼品系中的可重复性。

摘要

当前科学与生物技术的发展趋势导致模式生物中产生了数千个新品系，从而迫切需要开发超越常规保种群体维持方法的新型遗传资源安全保存技术。本研究的主要目的是将针浸式玻璃化冷冻法（NIV）应用于整块斑马鱼睾丸的低温保存。通过整睾丸NIV法对早期生殖细胞进行冷冻保存，为斑马鱼遗传资源的储存提供了可能，尤其在于这些细胞在移植后能够发育为雄性和雌性配子。实验中将睾丸切除后固定于针灸针上，依次在两种冷冻保护剂中平衡（平衡液含1.5 M甲醇和1.5 M丙二醇；玻璃化冷冻液含3 M二甲基亚砜和3 M丙二醇），随后直接浸入液氮中。样品在三步连续的复温溶液中进行升温。该技术的主要优势包括：（1）复温后的睾丸经消化处理不产生精子，从而有利于后续操作；（2）超快速冷却使组织与液氮接触达到最优，最大化冷却效率，同时降低所需冷冻保护剂浓度，从而减少其毒性；（3）多个睾丸可同步暴露于冷冻保护剂和液氮中；（4）在五种不同的斑马鱼品系中均实现了超过50%的细胞存活率，证明了该方法的可重复性。

引言

科学与生物技术领域的新趋势已催生出数千种新的小鼠、Drosophila、斑马鱼及其他用作生物医学和其他科学研究模式生物的突变品系1。此外，随着新技术的不断开发和普及，突变品系的数量持续增长2。这使得人们有必要采用超越常规繁殖群体维持方式的遗传资源安全保存方法。冷冻保存作为一种能够长期安全保存遗传资源的技术，具有诸多优势，例如可延长繁殖季节、避免亲本群体的持续维护，并且在成本和人力方面更为高效2。

近年来建立的精子冷冻保存方案2,3,4 为成功保存斑马鱼雄性遗传物质提供了可能。然而，由于鱼类卵子或胚胎结构复杂且含有大量卵黄物质，目前尚无法实现其冷冻保存。最近，原始生殖细胞（PGCs）或精原干细胞（SSCs）移植技术的应用为克服这一障碍提供了新途径，这些细胞在移植后可发育成功能性的精子和卵子5。因此，SSCs 的冷冻保存为珍稀和宝贵遗传资源的保护开辟了新的前沿领域。

尽管冷冻保存具有诸多优势，但慢速冷冻过程会产生多种可能导致细胞损伤的条件2。这些因素包括细胞内和细胞外冰晶的形成、脱水、冷冻保护剂毒性等。细胞内结冰会损伤细胞，细胞外结冰可能导致细胞受到机械性挤压，而在慢速冷冻过程中水分从细胞中扩散出去则可能引起脱水6。近年来，玻璃化冷冻作为一种能够避免冰晶形成负面影响的技术，已被应用于鱼类配子的冷冻保存7,8,9。该技术通过超快速降温，使细胞内外介质转变为非晶态/玻璃态，而不会结晶形成冰7,10。已有研究证实，禽类和哺乳动物的睾丸及卵巢组织可成功实现玻璃化冷冻10,11,12，这为该技术在鱼类中的应用也提供了可能。

本研究介绍了用于整条斑马鱼睾丸冷冻保存的针浸式玻璃化冷冻（NIV）方法。我们展示了一种可靠的方法，可分离出无污染的斑马鱼早期生殖细胞，并通过冷冻保存获得较高数量的早期生殖细胞，同时其他类型细胞（尤其是精子）的混入较少。据我们所知，这是首次报道针对鱼类性腺组织及斑马鱼生殖系细胞的超快速冷却过程的详细可视化操作流程。此外，该方法在五种不同的斑马鱼品系中均验证了其可重复性：AB野生型、casper（roy-/-；nacre-/-）、leopard（leot1/t1）、vasa [Tg(vas::eGFP)] 以及Wilms肿瘤 [Tg(wt1b::eGFP 1)] 转基因品系。

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方案

本文所述所有方法均已获得匈牙利动物福利法的批准。

1. 试剂配制

  1. 储备溶液
    1. 通过将 0.378 g 海藻糖二水合物加入 1 mL 去离子水（dH2O）中配制 1 M 海藻糖溶液。充分混匀直至完全溶解。
    2. 通过将 0.342 g 蔗糖加入 1 mL 去离子水（dH2O）中配制 1 M 蔗糖溶液。充分混匀直至完全溶解。
    3. 通过 将 0.238 g HEPES 加入 1 mL 去离子水（dH2O）中配制 1 M HEPES 溶液。充分混匀直至完全溶解。
    4. 通过 将 100 mg 胶原酶（290 U/mg）加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 20 mg/mL 胶原酶溶液。彻底混匀至溶解。使用 0.2 µm 滤器无菌过滤。分装 50 µL 至 0.2 mL PCR 管中，于 -20 °C 冻存。
    5. 通过 将 75 mg 胰蛋白酶（~10000 U/mg）加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 15 mg/mL 胰蛋白酶溶液。彻底混匀至溶解。使用 0.2 µm 滤器无菌过滤。分装 50 µL 至 0.2 mL PCR 管中，于 -20 °C 冻存。
    6. 通过 将 5 mg DNase I（~3000 U/mg）加入 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 1 mg/mL DNase I 溶液。彻底混匀至溶解。使用 0.2 µm 滤器无菌过滤。分装 50 µL 至 0.2 mL PCR 管中，于 -20 °C 冻存。
    7. 通过 将 40 mg 台盼蓝加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中配制 0.4% 台盼蓝溶液。使用 0.2 µm 滤器无菌过滤。分装 1 mL 至 1.5 mL 离心管中。
    8. 通过 将 200 mg MS-222（三卡因甲烷磺酸盐）加入 1 L 去离子水（dH2O）中配制 200 mg/L MS-222 溶液。充分混匀直至完全溶解。此外，使用碳酸氢钠将 MS-222 溶液调节至中性 pH 7.0。
  2. 玻璃化冷冻用溶液
    1. 配制平衡液（ES）：在 2 mL 离心管中混合甲醇（MeOH；1.5 M）121.5 µL、丙二醇（PG；1.5 M）220 µL、胎牛血清（FBS；10%）200 µL、海藻糖储备液（0.1 M）200 µL、HEPES 储备液（25 mM）50 µL 和 L-15 培养基 1208.5 µL，配制 2 mL 平衡液（ES）。
    2. 配制玻璃化冷冻液（VS）：在 2 mL 离心管中混合丙二醇（PG；3 M）439 µL、二甲基亚砜（Me2SO；3 M）426 µL、胎牛血清（FBS；10%）200 µL、海藻糖储备液（0.1 M）200 µL、HEPES 储备液（25 mM）50 µL 和 L-15 培养基 685 µL，配制 2 mL 玻璃化冷冻液（VS）。
  3. 复温用溶液
    1. 配制复温液 1（WS1）：在 2 mL 离心管中混合胎牛血清（FBS；10%）150 µL、蔗糖储备液（3 M）450 µL 和 L-15 培养基 900 µL，配制 1.5 mL 复温液 1（WS1）。
    2. 配制复温液 2（WS2）：在 2 mL 离心管中混合胎牛血清（FBS；10%）150 µL、蔗糖储备液（1 M）150 µL 和 L-15 培养基 1200 µL，配制 1.5 mL 复温液 2（WS2）。
    3. 配制复温液 3（WS3）：在 2 mL 离心管中混合胎牛血清（FBS；10%）150 µL 和 L-15 培养基 1350 µL，配制 1.5 mL 复温液 3（WS3）。
  4. 配制消化液：每个样品在 2 mL 离心管中混合胶原酶储备液（2 mg/mL）50 µL、胰蛋白酶储备液（1.5 mg/mL）50 µL、DNase I（20 µg/mL）10 µL 和 L-15 培养基 390 µL，配制 500 µL 消化液。
  5. 准备解剖工具：剪刀、显微剪、镊子、弯头镊和针灸针。

2. 睾丸采集

  1. 将鱼放入含有 200 mg/L MS-222（pH = 7）的培养皿中实施安乐死。在继续解剖前，需确认鱼的鳃已停止运动，并且自该时刻起至少已过去 10 分钟，以确保其因缺氧而死亡。
  2. 用纸巾轻轻擦干鱼体，将其背侧朝下放置于解剖垫上。
    1. 首先剪除腹鳍和胸鳍，以便于后续解剖操作。
    2. 在鱼腹部胸鳍之间的区域水平剪开皮肤，并沿腹部方向切开皮肤及下方肌肉，直至肛鳍。
    3. 打开鱼的体腔，用针将左右两侧体壁固定在解剖垫上。
      注意：睾丸位于鳔两侧的消化道器官上方（图 1）。
  3. 为防止污染，不要取出消化道器官，而是将其轻轻推向一侧，从对侧取出睾丸。睾丸与体壁相连，因此应小心分离，并使用显微剪剪断连接的腹膜。
  4. 此外，为防止污染，首先将睾丸置于 70% 乙醇中消毒 2 秒，然后将其转移至冰上的 96 孔板中的 L-15 培养基中。
    注意：如有必要，可在体视显微镜下精确清除睾丸周围的脂肪组织和较大的血管

3. 睾丸组织的超快速冷却

  1. 根据样本类型用适当的标签标记针具，并准备平衡液（ES）和玻璃化冷冻液（VS）。
  2. 将睾丸转移至较大的多孔板或培养皿中，用无菌针灸针穿刺固定两到三个睾丸（或根据针的大小可固定更多）。
    1. 首先将睾丸置于弯曲的镊子顶部，将针尖插入睾丸中央，然后用镊子小心地将睾丸向上拉。
    2. 穿刺睾丸后，轻轻地将其沿针向上推，确保各睾丸彼此分离，且不会脱落或滑下。
    3. 将穿有睾丸的针放入装有 L-15 培养基的 2 mL 离心管中，直至进行玻璃化冷冻（置于 25 ˚C 环境下；保存时间不应超过 1 小时）。
      注意：穿刺固定睾丸的操作应迅速完成，以防止睾丸干燥。
  3. 将带有睾丸的针转入平衡液中，在 25 ˚C 下孵育 5 分钟。
  4. 将针转入玻璃化冷冻液中，在 25 ˚C 下孵育 30 秒。
  5. 从玻璃化冷冻液中取出针，用无菌纸巾快速而轻柔地吸去组织表面残留的液体。注意避免睾丸粘附在纸巾上或脱落。
  6. 迅速将针浸入盛放在泡沫盒中的液氮中。
    注意：此步骤应迅速完成，以避免组织暴露于液氮蒸气中。使用少量液氮以防止样本间的交叉污染。
  7. 将针在密闭的泡沫盒内的液氮中保持 5 - 10 分钟。
  8. 将一个打开的 4.5 mL 冻存管及其管盖在同一泡沫盒中预冷。
  9. 5 - 10 分钟后，在液氮液面下将每根针分别转移至独立的冻存管中，并盖紧管盖。
    警告：操作液氮时务必穿戴防护装备（如隔热手套），因接触可能导致严重冻伤。
  10. 将冻存管迅速置于金属提杆上，并尽快放入液氮罐的储存提桶中。将样本保存在提桶式液氮杜瓦瓶中，以备后续使用。

4. 加热程序

  1. 分别将每根针进行预热。所有预热溶液的温度均应为 25 °C。
  2. 将冻存管从金属提杆上取下，并浸入盛放在泡沫盒中的液氮中。
  3. 在液氮蒸气中（使用镊子）打开冻存管，将针释放到液氮中。
  4. 迅速将针转移至第一预热溶液中，于 25 °C 孵育 1 分钟。转移过程中需确保动作迅速，以防止针在空气中升温。
  5. 将针转移至第二预热溶液中，于 25 °C 孵育 3 分钟。
  6. 将针转移至第三预热溶液中，于 25 °C 孵育 5 分钟。
  7. 用弯头镊子将睾丸从针上向下滑落分离。将每个复温后的睾丸单独放入已加入 250 µL L-15 培养基（补充 10% FBS）的 96 孔板中的不同孔内。确保各孔根据样本做好标记。在所有样本完成复温并进行后续操作前，将 96 孔板置于冰上保存。

5. 组织消化

  1. 为每个样品在单独的 2 mL 离心管中准备 500 µL 解离溶液。根据样品的编号标记离心管。将配制好的解离溶液在室温下孵育 5 分钟。
  2. 将预热的组织加入消化溶液中，并用小剪刀至少剪切 30 次，使其切成小块。
  3. 将剪碎的组织在 25 ˚C 下于摇床上孵育 90 分钟。
  4. 加入 400 µL L-15 和 100 µL FBS（终浓度为 10% FBS v/v）以终止消化过程。轻轻振荡混合溶液，并在室温下孵育 1 分钟。
  5. 将所得溶液通过 50 µm 滤膜过滤至 1.5 mL 离心管中。相应地标记离心管。
  6. 在 25 ˚C 下以 200 ×g 离心 10 分钟。
  7. 小心吸除上清液，将沉淀物重悬于 20 µL 含 10% FBS 的 L15 培养基中。手动振荡离心管，直至沉淀完全溶解。将细胞悬液置于冰上或 4 ˚C 保存，直至后续使用。

6. 活性评估与细胞计数

  1. 在适当标记的 0.2 mL PCR 管中，将 5 µL 细胞悬液与 5 µL 的 0.4% 台盼蓝溶液混合。若使用不同体积，需确保稀释比例保持 1:1。
  2. 室温（25 °C）孵育该悬液 1 至 3 分钟。
  3. 在显微镜下使用血细胞计数板检测每个样品的细胞活力。
  4. 计数 15 个视野中活细胞（未被台盼蓝染色）的数量。计算 20 µm 细胞悬液中的总细胞数。此时悬液已准备好用于后续实验。
    注意：在优化其他体型较大物种的实验流程时，应使用重量相等的睾丸组织片段。为避免个体差异对结果的影响，所有实验组应使用同一生物个体的睾丸组织。以斑马鱼为例，我们利用了其左右睾丸所含生殖细胞数量相等（或极为相近）的特性13（参见代表性结果）。左侧睾丸作为对照，右侧睾丸则进行玻璃化冷冻与复温处理。细胞活力百分比通过比较从玻璃化冷冻/复温睾丸中分离的细胞数量与新鲜睾丸中分离的细胞数量来计算。

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结果

通常情况下，从单个新鲜的斑马鱼精巢中分离得到的早期生殖细胞数量在40,000至200,000个细胞之间，具体数量取决于鱼体大小。在对全部5个品系的新鲜斑马鱼精巢进行消化时，细胞悬液中不仅含有早期生殖细胞（图2），还发现了大量精子。相反，在解冻冷冻保存的精巢并进行消化后，精子数量显著减少。这表明精子无法耐受这种超快速冷冻方案，且极有可能在消化过程中被清除，从而获得纯度更高的早期生殖细胞悬液。

通过消化3条AB系雄性斑马鱼的新鲜睾丸组织发现，同一个体左右两侧睾丸中早期生殖细胞数量之间无显著差异（1 ± 0.5 × 105 vs 1.1 ± 0.7 × 105）（单因素方差分析；F(1,4) = 0.04，p = 0.85）。在本研究使用的所有斑马鱼品系中，当前的超快速冷却方案所获得的平均存活率均高...

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讨论

本研究的主要目的是将先前为鸟类和哺乳动物物种开发的针浸式超快速冷却方法10,11,12，应用于鱼类精巢（以斑马鱼为模式生物）的冷冻保存。以往关于斑马鱼遗传资源冷冻保存的研究主要集中在斑马鱼精子的冷冻保存上2,3,4。然而，成熟的卵母细胞和胚胎的冷冻保存方案尚未建立，尽管最近一些研究表明早期卵母细胞的冷冻保存是可行的14,15。在本研究中，我们成功实现了斑马鱼精原细胞的冷冻保存，这为保存珍贵的遗传资源提供了新的可能，尤其重要的是，这些精原细胞在移植后能够发育为雄性和雌性配子5。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由匈牙利国家研究、开发与创新办公室（项目编号 116912，授予 ÁH）、COST 办公室（食品与农业 COST 行动 FA1205：AQUAGAMETE）、匈牙利奖学金项目（授予 ZM）以及新匈牙利国家卓越博士前奖学金（授予 EK）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Leibovitz 培养基 (L-15)Sigma-AldrichL1518添加 L-谷氨酰胺
胎牛血清 (FBS)Sigma-AldrichF9665
三卡因甲磺酸盐 (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
蔗糖Acros Organics57-50-1
海藻糖Acros Organics99-20-7二水合物
甲醇Reanal20740-0-08-65
丙二醇Reanal08860-1-08-65
二甲基亚砜Reanal00190-1-01-65
胶原酶Gibco9001-12-1
胰蛋白酶Sigma-AldrichT8003
DNase IPanreac AppliChemA3778
台盼蓝Sigma-AldrichT6146
磷酸盐缓冲液 (PBS)Sigma-AldrichP4417用于配制 200 ml PBS 溶液的片剂

参考文献

  1. Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
  2. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
  3. Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
  4. Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
  5. Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
  6. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
  7. Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
  8. Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
  9. Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
  10. Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
  11. Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).
  12. Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
  13. Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
  14. Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
  15. Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
  16. Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
  17. Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
  18. Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
  19. Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).

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