利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析

摘要

我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略来开发非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了rAaeDV载体的构建、包装和定量分析以及幼虫感染的完整实验流程。

摘要

体内显微注射是分析单个蚊虫基因功能最常用的基因转移技术。然而，该方法操作技术要求较高，步骤复杂，尤其是在幼虫阶段应用时，由于其体型较小、体壁相对较薄且脆弱，以及高死亡率，限制了该技术的广泛应用。相比之下，病毒载体可用于克服基因递送过程中的胞外和胞内屏障。这类系统具有操作简便、基因转导效率高、基因表达可持续维持以及能够在体内产生持久效应等优势。蚊虫浓核病毒（MDVs）是一类特异性感染蚊虫的小型单链DNA病毒，可有效将外源核酸递送至蚊虫细胞中；然而，外源基因的替换或插入通常会导致病毒包装和/或复制能力的丧失，这成为将其开发为基因递送载体的主要障碍。

本文中，我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略，以开发一种非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了重组埃及伊蚊痘病毒（rAaeDV）载体的构建、包装和定量分析，以及幼虫感染的具体操作步骤。

本研究首次证明了构建一种非缺陷型重组MDV微小RNA（miRNA）表达系统的可行性，从而为蚊媒基因功能分析提供了有力工具，并为利用病毒介导的转基因技术控制蚊媒传播疾病奠定了基础。我们证实了 白纹伊蚊 1^st 通过将病毒引入幼虫饲养场所的水体中，可以高效且有效地感染各龄期幼虫；所构建的重组AaeDV可用于在幼虫中过表达或敲低特定靶基因的表达，从而为蚊虫基因的功能研究提供一种有效工具。

引言

疟疾、登革热、寨卡热和黄热病等蚊媒传播疾病是重大的国际公共卫生问题，持续构成全球传染病负担的重要部分^1,2常规杀虫剂已被用于应对病媒，是预防蚊媒疾病可持续综合蚊虫控制策略的重要组成部分。然而，由于对环境的负面影响以及蚊虫种群抗药性的演化，此类策略已被证明相对无效或不理想^3,4因此，迫切需要寻找蚊虫控制的替代方法，而利用转基因技术培育不育雄性蚊虫以及释放抗病原体蚊虫已成为颇具前景的新控制策略。为了开发有效的新型控制方法，例如安全且高效的方法 体内 基因递送，需要对蚊子基因功能进行综合分析。

质粒DNA、双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）的直接显微注射是最常用的方法 体内 蚊子基因递送方法。事实上，转基因蚊子品系的制备仍然依赖于胚胎显微注射技术^5,6,7然而，显微注射存在若干局限性。首先，该技术操作难度较高，涉及复杂的操作流程。其次，注射过程会对胚胎、幼虫、蛹及成虫造成物理损伤，直接影响目标生物的存活率。第三，....

方案

所有实验方案均经南方医科大学伦理委员会批准。

1. 设计人工内含子

注意：本研究中使用的人工内含子长度为 65 bp，序列为 5'-GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG-3'。

1. 在人工内含子的两端放置HpaI限制性酶切位点，以便通过HpaI酶切将内含子从质粒中释放出来（见图1A）。
2. 在内含子中引入两个XbaI限制性酶切位点，以便利用XbaI酶切插入小RNA表达序列。
3. 向DNA合成公司订购人工内含子全长DNA序列的化学合成。所合成的DNA用于克隆至标准pUC19质粒中。
   注：人工内含子的关键组分包括多个保守的核苷酸元件，其中包括5'剪接供体位点（DS），序列为GUAAGAGU；保守的分支点序列（BPS），序列为UACUAAC；多嘧啶 tract（PPT），序列为UCUUC(U)₁₀；以及3'剪接受体位点（AS），序列为GAUAUCCUGCAG（图1A）。在DS与BPS之间引入了两个

结果

rAaeDV 构建策略 
构建了一种缺陷型 rAaeDV 载体，用于在蚊子幼虫中表达 DsRed 基因。所获得的质粒包含一个 NS1-DsRed 融合蛋白表达盒，其中缺失了 VP 蛋白序列（图 1A）。设计了包含 miRNA、miRNA 海绵（sponge）、shRNA 和 amiRNA 表达结构的 rAaeDV 质粒（如 图 1B 所示）。例如，构建了一种 rAaeDV 载体，用于在蚊子幼虫中过表达 aal-let-7。所获得的质粒在病毒 NS1 外显子中插入了一个内含子型 pre-aal-let-7 表达盒（图 1B）。构建了一种 rAaeDV 载体，其在病毒 NS1 外显子中包含一个内含子型 aal-let-7 海绵表达盒，用于在蚊子幼虫中敲低 a.......

讨论

克服限制rAaeDV构建的两个关键障碍至关重要。第一个障碍是缺陷型重组病毒的产生。已有报道称，MDV可用作表达适当大小外源基因的载体，例如蝎源性昆虫特异性神经毒素20和GFP蛋白；然而，无论采用何种构建策略，一旦将外源基因插入或替换MDV的开放阅读框（ORFs），病毒颗粒便无法独立形成，除非共转染辅助质粒以提供缺失的必需病毒蛋白。这种缺陷型病毒无法进行继发性传播，该过程 体内 在基因组存在缺陷的蚊子中。我们的结果验证了一种内含子表达策略，该策略提供了一种新范式，可克服基因组缺陷型蚊媒病毒在递送外源基因方面的局限性，从而实现外源基因向蚊子体内的高效递送。

第二个限制是病毒衣壳大小对重组病毒基因组长度提出的严格要求。为了实现高效包装，基因组长度不能超过4,400个核苷酸（即野生型MDV基因组长度的110%）。可将一个不超过400个核苷酸的内含子型miRNA表达盒（包括miRNA表达盒和人工内含子）插入AaeDV基因组中。尽管重组病毒基因组长度仍处于适合包装的范围内，但该递送系统仍有改进空间。由于基因组长度受限，若无高效的内含子表达策略，难以实现外源基因的有效表达。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Thermo Scientific	75004260
离心系统	Beckman Coulter	363118
GeneJET 凝胶回收试剂盒	Thermo Scientific	K0691
E.Z.N.A. 质粒大提试剂盒	Omega Biotech	D6904
纯化琼脂	OXOID	LP0028A
FastAP 热敏感碱性磷酸酶 (1 U/µL)	Thermo Scientific	EF0651
FastDigest HpaI	Thermo Scientific	FD1034
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL)	Thermo Scientific	EL0011
TransStbl3 化学感受态细胞	北京全式金生物	CD521-01
氨苄青霉素	北京天根生化科技	RT501
蛋白酶 K	Promega	MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	北京天根生化科技	FP205