利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析

摘要

我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略来开发非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了rAaeDV载体的构建、包装和定量分析以及幼虫感染的完整实验流程。

摘要

体内显微注射是分析单个蚊虫基因功能最常用的基因转移技术。然而，该方法操作技术要求较高，步骤复杂，尤其是在幼虫阶段应用时，由于其体型较小、体壁相对较薄且脆弱，以及高死亡率，限制了该技术的广泛应用。相比之下，病毒载体可用于克服基因递送过程中的胞外和胞内屏障。这类系统具有操作简便、基因转导效率高、基因表达可持续维持以及能够在体内产生持久效应等优势。蚊虫浓核病毒（MDVs）是一类特异性感染蚊虫的小型单链DNA病毒，可有效将外源核酸递送至蚊虫细胞中；然而，外源基因的替换或插入通常会导致病毒包装和/或复制能力的丧失，这成为将其开发为基因递送载体的主要障碍。

本文中，我们报告采用一种人工内含子小RNA表达策略，以开发一种非缺陷型重组病毒 埃及伊蚊 浓核病毒（AaeDV） 体内 递送系统。本文详细描述了重组埃及伊蚊痘病毒（rAaeDV）载体的构建、包装和定量分析，以及幼虫感染的具体操作步骤。

本研究首次证明了构建一种非缺陷型重组MDV微小RNA（miRNA）表达系统的可行性，从而为蚊媒基因功能分析提供了有力工具，并为利用病毒介导的转基因技术控制蚊媒传播疾病奠定了基础。我们证实了 白纹伊蚊 1^st 通过将病毒引入幼虫饲养场所的水体中，可以高效且有效地感染各龄期幼虫；所构建的重组AaeDV可用于在幼虫中过表达或敲低特定靶基因的表达，从而为蚊虫基因的功能研究提供一种有效工具。

引言

疟疾、登革热、寨卡热和黄热病等蚊媒传播疾病是重大的国际公共卫生问题，持续构成全球传染病负担的重要部分^1,2常规杀虫剂已被用于应对病媒，是预防蚊媒疾病可持续综合蚊虫控制策略的重要组成部分。然而，由于对环境的负面影响以及蚊虫种群抗药性的演化，此类策略已被证明相对无效或不理想^3,4因此，迫切需要寻找蚊虫控制的替代方法，而利用转基因技术培育不育雄性蚊虫以及释放抗病原体蚊虫已成为颇具前景的新控制策略。为了开发有效的新型控制方法，例如安全且高效的方法 体内 基因递送，需要对蚊子基因功能进行综合分析。

质粒DNA、双链RNA（dsRNA）或小干扰RNA（siRNA）的直接显微注射是最常用的方法 体内 蚊子基因递送方法。事实上，转基因蚊子品系的制备仍然依赖于胚胎显微注射技术^5,6,7然而，显微注射存在若干局限性。首先，该技术操作难度较高，涉及复杂的操作流程。其次，注射过程会对胚胎、幼虫、蛹及成虫造成物理损伤，直接影响目标生物的存活率。第三，由于大多数蚊虫幼虫生活在水生环境中，并具有典型的扭动运动特征，因此很难在显微注射过程中将其固定。第四，1^st-2^nd 3龄幼虫的体型比4龄幼虫小10至20倍^th 龄幼虫及更晚期的幼虫，且前者的表皮更为脆弱。这些特点使得操作1^st-2^nd 与老龄幼虫相比，低龄幼虫的存活率较低。综合这些因素，导致幼虫在注射后的存活率（约5%）明显低于成虫⁸基于病毒的递送系统已被开发用于克服相关的胞外和胞内屏障。这类系统具有易于操作、转导效率高、表达水平持久且稳定，以及能够产生持续效应等优势。 体内因此，利用逆转录病毒、慢病毒和腺病毒的基因递送系统已广泛应用于哺乳动物细胞系和模式物种中。辛德比斯病毒表达系统此前已被用于分析成年蚊子中的基因功能；然而，除生物安全方面的顾虑外，病毒侵染仍需通过注射方式进行。⁹尽管此前已有报道通过将幼虫浸泡在dsRNA溶液中实现口服递送，该方法作为一种可行的递送方式，但并不适用于小RNA功能分析。¹⁰因此，仍需为蚊子开发有效的病毒递送方法。

蚊子浓核病毒（MDVs）属于细小病毒科（Parvoviridae）中的浓核病毒亚科（Densovirinae），除一种外，其余均归属于短浓核病毒属（Brevidensovirus）¹¹。MDV病毒粒子无包膜，包含一条单链DNA（ssDNA）基因组和一个二十面体的衣壳（直径为20 nm）。病毒基因组大小约为4 kb，在宿主细胞核内进行复制。MDVs在环境中相对稳定，宿主范围较窄，对蚊子具有高度特异性。这些病毒能够在蚊群中自然传播并长期存在，并可侵入这些昆虫的几乎所有器官和组织，包括中肠、马氏管、脂肪体、肌肉、神经元以及唾液腺¹²。

完整的MDV基因组可亚克隆至质粒载体中，以构建基于质粒的感染性克隆；当这些克隆被导入蚊细胞后，病毒基因组可从质粒载体中释放，并产生具有感染性的病毒颗粒。由于MDV具有较小的单链DNA（ssDNA）基因组，其感染性克隆易于构建，且病毒基因组易于操作^11,13这些特性使蚊媒病毒（MDV）成为研究蚊虫生物学的有价值工具。然而，由于病毒基因组序列几乎全部对病毒增殖至关重要，通过替换或插入外源基因来构建重组病毒会导致病毒包装和/或复制能力的下降，从而阻碍了MDV作为基因递送载体的开发。本文报道了一种利用人工内含子小RNA表达策略，开发出无缺陷的重组AaeDV（rAaeDV）的方法。 体内 具有质粒构建简便以及可维持功能性病毒的优势，能够在宿主细胞中实现稳定且长期的表达，而无需野生型病毒。此外，该方法可轻松实现对幼虫的转导。

本研究描述了以下步骤的实验方案：1）设计编码内含子小RNA表达盒的重组埃及伊蚊病毒（rAaeDV），2）利用C6/36包装细胞系生产重组病毒颗粒，3）对无细胞体系中的rAaeDV基因组拷贝数进行定量分析，以及4）通过将病毒直接引入幼虫栖息水体来感染白纹伊蚊（Ae. albopictus）幼虫。总体而言，本工作表明，利用所开发的MDV递送系统，可在蚊虫幼虫中实现特定小RNA或靶基因的过表达或敲低。

方案

所有实验方案均经南方医科大学伦理委员会批准。

1. 设计人工内含子

注意：本研究中使用的人工内含子长度为 65 bp，序列为 5'-GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG-3'。

1. 在人工内含子的两端放置HpaI限制性酶切位点，以便通过HpaI酶切将内含子从质粒中释放出来（见图1A）。
2. 在内含子中引入两个XbaI限制性酶切位点，以便利用XbaI酶切插入小RNA表达序列。
3. 向DNA合成公司订购人工内含子全长DNA序列的化学合成。所合成的DNA用于克隆至标准pUC19质粒中。
   注：人工内含子的关键组分包括多个保守的核苷酸元件，其中包括5'剪接供体位点（DS），序列为GUAAGAGU；保守的分支点序列（BPS），序列为UACUAAC；多嘧啶 tract（PPT），序列为UCUUC(U)₁₀；以及3'剪接受体位点（AS），序列为GAUAUCCUGCAG（图1A）。在DS与BPS之间引入了两个XbaI限制性酶切位点，可用于插入小RNA表达序列。该人工内含子在哺乳动物细胞和蚊子细胞中有效剪接的能力此前已得到验证¹⁴。

2. 设计人工内含子小RNA表达盒

注意：为了过表达或敲低内源性miRNA，在DS和BPS之间插入了编码前体miRNA或miRNA海绵的序列。作为示例，本研究选取了源自Ae. albopictus的内源性前体miRNA aal-let-7，用于构建重组病毒载体以实现miRNA的过表达和敲低。抗let-7海绵的设计依据先前描述的方法¹⁵。为了在幼虫中敲低目标基因，我们使用在线软件^16,17设计了特异的人工miRNA（amiRNA）或短发夹RNA（shRNA）序列；作为示例，本研究选择V-ATP酶亚基A mRNA（登录号：AY864912）作为目标基因。此后，该amiRNA将被称为amiVTP。pre-miRNA、海绵、amiRNA和shRNA的所有序列详情见补充表1。

1. 订购前体miRNA、miRNA海绵和shRNA全长cDNA序列的化学合成，包含 Xba来自DNA制造商的两端均带有I型限制性酶切位点的序列。
2. 收到订购的DNA后，将含有DNA片段的离心管在10,000-14,000 × g下离心1分钟，以确保所有干燥的DNA均沉降至管底。
3. 将干燥的DNA溶于无DNase的水中，调整终浓度为10 ng/µL。
4. 用限制性内切酶消化质粒骨架和DNA序列 Xba在37 °C下孵育1小时，然后根据制造商的说明书，用小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）对线性化质粒骨架的5'端进行去磷酸化处理。
5. 65 °C 下加热 60 分钟以失活 CIAP。
6. 运行1.0%琼脂糖凝胶，切下线性化载体片段，然后使用凝胶回收试剂盒按照生产商说明书从凝胶切片中提取DNA。
7. 使用T4 DNA连接酶（5 U/µL）在22 °C下将DNA片段连接至载体骨架中，反应1小时。
8. 将步骤2.7中连接反应的产物转化至感受态细胞中 大肠杆菌 (E. coli) 细胞，并涂布于含有氨苄青霉素（终浓度为 100 µg/mL）的LB（Lysogeny Broth）琼脂平板上。
   1. 通过热激法进行转化¹⁸， 并使用适当的 E. coli 菌株。例如，使用 E. coli 用于热激转化的DH5α菌株
9. 从步骤2.8中挑取单个菌落，接种于3 mL含氨苄青霉素（终浓度为100 µg/mL）的富集培养基中培养。
10. 使用质粒小提试剂盒，按照制造商说明书从细菌培养物中提取质粒DNA。将样品送至DNA测序公司进行测序。
    注意：为了过表达或敲低内源性miRNA，将编码前体miRNA或miRNA海绵的序列插入到两者之间 XbaI 位点。由于病毒包装能力的限制，所有 miRNA 表达或海绵结构的长度必须小于 400 bp（病毒基因组长度的 10%）。¹⁹.

3. 将miRNA或shRNA表达盒克隆至质粒骨架以构建rAeaDV载体

注意：pUCA 是一种感染性克隆，包含携带 AaeDV 基因组（3,981 nt）的 pUCA 质粒¹⁹，由 Jonathan Carlson 教授惠赠，并已在先前研究中被详细描述¹¹。p7NS1-DsRed 可在 p7 启动子驱动下表达非结构蛋白 1（NS1）与红色荧光蛋白（DsRed）的融合蛋白，其详细信息已在其他文献中报道¹⁴。此外，将一种人特异性的 miR-941-1 前体²⁰ 及其海绵序列——随机化的短发夹 RNA（scrambled shRNA，序列：CGACGACTATCGTGCAATTTCAAGAG AATTGCACGATAGTCGTCG）——也亚克隆至 AaeDV 中作为阴性对照。

1. 按照方案步骤 2.4 至 2.7 所述，将 pre-miRNA、sponge、shRNA 或 amiVTP 表达盒连接至 pUCA 质粒骨架中 AaeDV NS1 编码区的 HpaI 位点。
2. 将 DNA 转化至 Stbl3 感受态 E. coli 细胞中，并按照步骤 2.8 至 2.10 所述筛选阳性克隆。
3. 随后，使用大提试剂盒并按照制造商说明，从细菌细胞中提取 rAaeDV 质粒。
   注意：应使用 Stbl3 或 Stbl4 E. coli 细胞进行 rAaeDV DNA 转化，以尽量减少非预期的 ITR 重组。应使用大提试剂盒提取 rAaeDV 质粒，以获得大量 DNA（>100 µg）。在产生病毒前，应始终通过 DNA 测序分析 rAaeDV 质粒的序列完整性²¹。

4. 使用 rAaeDV 质粒转染 C6/36 细胞

1. 在28 °C培养箱中，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基培养C6/36细胞。
2. 第0天，将细胞接种于十个25 cm²培养瓶中² 转染前18-20小时，将90-95%汇合度的细胞按1:2比例传代至培养瓶中。
   注意：培养1天后，细胞应达到90–95%融合度。
3. 第1天，用一系列rAaeDV质粒转染细胞²².
   1. 在微量离心管中，将10 µg DNA溶于600 µL RPMI-1640培养基中，轻轻混匀。同时，每项转染实验另准备600 µL RPMI-1640培养基和25 µL转染试剂。
   2. 室温（RT）孵育5-10分钟。然后，将625 µL的1640-转染试剂混合物加入1640-质粒DNA混合物中。
   3. 在室温下孵育该混合物20–30分钟。转染前，用2 mL RPMI-1640培养基将细胞洗涤两次。
   4. 在RT孵育（步骤4.3.3）后，将1640-转染试剂-DNA质粒混合物加入25 cm²培养瓶中² 培养瓶，28 °C 培养 6 小时。
   5. 转染后约6小时，弃去转染培养基，用5 mL RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，然后加入含10% FBS的RPMI-1640培养基。
      注意：rAaeDV 对感染表现出高感染率（95%） 白纹伊蚊 幼虫；然而，根据我们的经验，在近50%的感染幼虫中，感染局限于原发感染部位（例如，肛乳头和刚毛细胞）且无播散²³因此，若需在多个组织中感染幼虫，应共感染一种表达荧光蛋白的缺陷型重组病毒，以实现感染位点的可视化。例如，为获得表达 DsRed 的缺陷型重组病毒，应按照上述方法将 p7NS1-DsRed 与辅助质粒共转染至 C6/36 细胞中（共转染的浓度比例应为 2:1）。

5. 从转染的C6/36细胞中收获重组AaeDV病毒颗粒

1. 转染后第5天收集细胞。用5 mL玻璃滴管反复吹打培养基，使细胞脱离并悬浮于培养皿中。将所有细胞悬液转移至无菌的15 mL离心管中。
2. 在-80 °C或干冰/乙醇浴中冷冻30分钟，然后在37 °C条件下解冻。涡旋振荡1分钟。重复冻融过程3次。
3. 在4 °C条件下，以4,800 × g离心20分钟。收集上清液，弃去沉淀。随后将上清液通过0.22 µm一次性注射式滤器过滤。分装后将最终纯化的病毒颗粒储存于-80 °C。
   注意：避免反复冻融。

6. 定量分析rAaeDV

1. 制备DNA标准品。用HpaI酶切所有rAaeDV质粒，线性化后使用凝胶回收试剂盒纯化消化产物²⁴。
2. 构建绝对定量标准曲线，并根据先前描述的方法测定病毒滴度²⁵。

7. 蚊子转导

1. 洗涤 100 1^st 龄期 白纹伊蚊 用去离子水清洗幼虫三次，然后将幼虫转移至含有95 mL去离子水的烧杯中。加入5 mL rAaeDV储备液（终浓度为1.00 × 10）¹⁰ copies/mL
2. 在28 °C条件下孵育24 h，用去离子水清洗幼虫三次，然后将幼虫转移回培养板并定期喂食。
3. 通过qPCR或Western blot检测幼虫中目标基因的表达水平（代表性结果如图所示） 图3 和 4).
   注意：可采用荧光信号检测方法更精确地分离感染幼虫。例如，为检测感染表达DsRed的重组病毒幼虫中的荧光信号，可将幼虫置于凹面载玻片上，每8小时在倒置荧光显微镜下观察一次，持续至感染后2天。一旦检测到荧光幼虫，应将其转移至单独的塑料培养杯中，以便后续连续观察。该方法可用于鉴定多种组织被感染的幼虫。

结果

rAaeDV 构建策略 
构建了一种缺陷型 rAaeDV 载体，用于在蚊子幼虫中表达 DsRed 基因。所获得的质粒包含一个 NS1-DsRed 融合蛋白表达盒，其中缺失了 VP 蛋白序列（图 1A）。设计了包含 miRNA、miRNA 海绵（sponge）、shRNA 和 amiRNA 表达结构的 rAaeDV 质粒（如 图 1B 所示）。例如，构建了一种 rAaeDV 载体，用于在蚊子幼虫中过表达 aal-let-7。所获得的质粒在病毒 NS1 外显子中插入了一个内含子型 pre-aal-let-7 表达盒（图 1B）。构建了一种 rAaeDV 载体，其在病毒 NS1 外显子中包含一个内含子型 aal-let-7 海绵表达盒，用于在蚊子幼虫中敲低 a...

讨论

克服限制rAaeDV构建的两个关键障碍至关重要。第一个障碍是缺陷型重组病毒的产生。已有报道称，MDV可用作表达适当大小外源基因的载体，例如蝎源性昆虫特异性神经毒素20和GFP蛋白；然而，无论采用何种构建策略，一旦将外源基因插入或替换MDV的开放阅读框（ORFs），病毒颗粒便无法独立形成，除非共转染辅助质粒以提供缺失的必需病毒蛋白。这种缺陷型病毒无法进行继发性传播，该过程 体内 在基因组存在缺陷的蚊子中。我们的结果验证了一种内含子表达策略，该策略提供了一种新范式，可克服基因组缺陷型蚊媒病毒在递送外源基因方面的局限性，从而实现外源基因向蚊子体内的高效递送。

第二个限制是病毒衣壳大小对重组病毒基因组长度提出的严格要求。为了实现高效包装，基因组长度不能超过4,400个核苷酸（即野生型MDV基因组长度的110%）。可将一个不超过400个核苷酸的内含子型miRNA表达盒（包括miRNA表达盒和人工内含子）插入AaeDV基因组中。尽管重组病毒基因组长度仍处于适合包装的范围内，但该递送系统仍有改进空间。由于基因组长度受限，若无高效的内含子表达策略，难以实现外源基因的有效表达。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Thermo Scientific	75004260
离心系统	Beckman Coulter	363118
GeneJET 凝胶回收试剂盒	Thermo Scientific	K0691
E.Z.N.A. 质粒大提试剂盒	Omega Biotech	D6904
纯化琼脂	OXOID	LP0028A
FastAP 热敏感碱性磷酸酶 (1 U/µL)	Thermo Scientific	EF0651
FastDigest HpaI	Thermo Scientific	FD1034
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684
T4 DNA 连接酶 (5 U/µL)	Thermo Scientific	EL0011
TransStbl3 化学感受态细胞	北京全式金生物	CD521-01
氨苄青霉素	北京天根生化科技	RT501
蛋白酶 K	Promega	MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	北京天根生化科技	FP205