Aedes aegypti 蚊子感染 Wolbachia 后被释放到自然种群中，以抑制节肢动物传播病毒的传播。本文描述了在实验室中培育携带 Wolbachia 感染的 Ae. aegypti 的方法，用于实验和野外释放，并采取预防措施以尽量减少实验室适应和选择效应。
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本文内容
摘要
摘要
Aedes aegypti 蚊子在实验条件下感染 Wolbachia 后，正被用于控制登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒等虫媒病毒的传播。携带 Wolbachia 的蚊子可被释放到野外，通过不相容交配减少种群数量，或使种群转变为对病毒传播具有抗性的蚊子。为使这些策略成功，从实验室释放的蚊子必须具备与本地蚊子相当的竞争能力。然而，实验室饲养可能导致近亲繁殖、遗传漂变以及对实验室环境的适应，从而降低其在野外的适应性，并可能干扰实验结果。为了评估不同 Wolbachia 感染株系在野外应用的适用性，必须在受控的实验室环境中维持蚊子多代繁殖。本文介绍了一种在实验室中维持 Ae. aegypti 蚊子的简易方案，该方案适用于携带 Wolbachia 的蚊子以及野生型蚊子。该方法最大限度地减少了实验室适应效应，并引入杂交繁殖，以提高实验结果对野外蚊子的代表性。此外，蚊群在最优条件下维持，以最大化其在开放野外释放时的适应性。
引言
Aedes aegypti 蚊子是传播全球一些最重要虫媒病毒的媒介，包括登革热病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒1。随着Ae. aegypti在热带地区的分布范围持续扩大，这些病毒对全球公共卫生的威胁日益加剧2,3,4。雌性Ae. aegypti偏好吸食人血5，因此通常生活在人类附近，尤其是在人口最密集的城市地区。由于与人类密切共处，它们也已适应在人工环境中繁殖，包括轮胎、花盆、排水沟和储水罐等场所6,7。与Aedes属中某些其他物种不同，Ae. aegypti还能轻松适应实验室环境，在直接从野外采集后无需特殊条件即可长期维持培养8,9,10。因其易于饲养，该蚊种已被广泛用于实验室研究，涵盖多个研究领域，最终目标是控制蚊子可能传播的疾病。
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方案
蚊子对人类受试者的吸血实验已获得墨尔本大学人类伦理委员会批准（批准编号：0723847）。所有志愿者均签署了知情同意书。
1. 幼虫培育
注意：在本蚊虫种群维持方案中，蚊虫饲养环境温度为 26 ± 0.5 °C，相对湿度为 50–70%，光照周期为 12:12 小时（光:暗）。这些条件接近澳大利亚凯恩斯地区的平均气候条件，且处于埃及伊蚊（Ae. aegypti）存活与发育的最适温度范围内44,45,46。高温可能导致蚊虫种群中沃尔巴克氏体（Wolbachia）感染的丢失，应予以避免47。我们每个种群维持至少 500 只个体，以尽量减少近亲繁殖；种群规模过小可能对适应性产生不利影响 [Ross et al. 未发表数据]。在这些条件下，若营养充足，平均世代时间为 28 天（见表 1）。
- 将带有基质的卵放入托盘中浸入水中（图1A) 含3 L水（反渗透水或陈化自来水，后者通过将自来水置于托盘中静置24小时后使用）、约300 m....
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结果
图4展示了营养不足对埃及伊蚊（Ae. aegypti）幼虫发育的影响。当每个幼虫每日获得的食物为0.25 mg或更少时，雄性和雌性幼虫的发育时间均会延长，且发育同步性低于每日获得0.5 mg食物的容器中的幼虫。若在整个幼虫发育期间未能提供充足的食物，可能对维持培养的计划产生不利影响。发育缓慢的个体可能面临被淘汰的风险，吸血行为可能被延迟，且在繁殖发生前成虫死亡的风险更高。
图5展示了在不同营养条件下饲养的埃及伊蚊（Ae. aegypti）成蚊的翅长（作为体型大小的估算指标）。当营养不足时，雄蚊和雌蚊的翅长均显著减小，且变异程度增大。在实验比较中，保持一致的体型大小非常重要，因为体型大小与繁殖力呈正相关，而在野外条件下，体型较大的蚊子预期具有更高的适应性33
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讨论
遵循本方案中所述的维持感染Wolbachia的Ae. aegypti的方法，可确保为实验和开放环境释放提供健康且质量稳定的蚊虫。与其他优先大量生产蚊虫的方案（参见参考文献57）不同，本方法侧重于提高蚊虫的适应性，既通过宽松的饲养条件提高代内适应性，又通过减少近亲繁殖、选择压力和实验室适应来优化跨代适应性。该方案虽专为携带Wolbachia感染的Ae. aegypti设计，但也适用于其他类型的Ae. aegypti。然而，该方案不适合大规模饲养（每周数百万只的量级），而此类规模在需要大量个体以实现种群压制的不育或不相容昆虫释放项目中可能是必需的57,58。
有一些关键步骤需要仔细遵循。在幼虫发育期间，必须提供充足的饲料并避免过度拥挤，以确保蚊虫同步发育且个体大小一致。在卵的孵化处理过程中也需格外小心；若产卵基质过湿或过干，幼虫可能过.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢叶恒林（Heng Lin Yeap）、Chris Paton、Petrina Johnson 和 Clare Doig 在建立种群维持方法过程中所做出的贡献，同时感谢三位匿名审稿人提出的建议，这些意见有助于改进本文稿。本研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）提供的项目资助和研究员基金（授予 AAH）以及惠康信托基金会（Wellcome Trust）提供的转化研究基金的支持。PAR 获得了澳大利亚政府研究培训计划奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 野生型 Aedes aegypti | 采自澳大利亚昆士兰地区的野外地点，详见 Yeap 等人39 的研究 | ||
| w Mel 感染的 Aedes aegypti | 由莫纳什大学提供。有关该品系的信息，请参见 Walker 等人23 的研究 | ||
| w AlbB 感染的 Aedes aegypti | 由莫纳什大学提供。有关该品系的信息，请参见 Xi 等人21 的研究 | ||
| w MelPop 感染的 Aedes aegypti | 由莫纳什大学提供。有关该品系的信息，请参见 McMeniman 等人22 的研究 | ||
| 速溶干酵母 | Lowan | 用于刺激卵孵化。可在普通杂货店购买。其他品牌亦可使用 | |
| 5 L 塑料桶 | Quadrant | Q110950 | 用于卵的孵化及幼虫饲养。其他产品亦可使用 |
| 鱼食（Tetramin 热带片剂） | Tetra | 16152 | 作为幼虫的食物来源。网址：https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE |
| 塑料容器 | 用于幼虫饲养。任何容量超过 500 mL 的塑料容器均可适用 | ||
| 玻璃移液管 | 用于在不同容器间转移幼虫和蛹。网址：https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez | ||
| 计数器 | RS Pro | 710-5212 | 用于辅助计数幼虫、蛹和卵。网址：http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y |
| 饲养盘 | Gratnells | 用于幼虫饲养。网址：http://www.gratnells.com | |
| 尼龙网筛 | 用于将幼虫和蛹转移至新鲜水中。其他品牌亦可使用。网址：https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white | ||
| 饲养笼 | BugDorm | DP1000 | 用于成蚊饲养。可使用替代产品。网址：http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| 35 mL 塑料杯 | Huhtamaki | AA272225 | 用于为成蚊提供水或蔗糖溶液。其他品牌亦可使用 |
| 35 mL 塑料杯盖 | Huhtamaki | GB030005 | 用于为成蚊提供蔗糖。其他品牌亦可使用 |
| 脱脂棉 | Cutisoft | 71841-13 | 湿润的脱脂棉作为成蚊的水源。其他品牌亦可使用 |
| 白砂糖 | 作为成蚊的糖源。可在普通杂货店购买 | ||
| 绳索 | M Recht Accessories | C323C/W | 用于为成蚊提供蔗糖溶液。其他品牌亦可使用。网址：https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/ |
| 塑料杯（大号） | 用作产卵容器。任何可容纳 100 mL 水的塑料杯均可适用 | ||
| 砂纸 | Norton Master Painters | CE015962 | 作为产卵基质提供。可使用替代产品，但本实验选用该品牌因其气味较淡。较浅的颜色有助于与卵形成对比。网址：https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html |
| 滤纸 | Whatman | 1001-150 | 作为替代产卵基质使用。其他品牌亦可使用 |
| 乳胶手套 | SemperGuard | Z560979 | 防止在血液饲喂过程中被蚊子叮咬手部。其他品牌亦可使用。网址：http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/ |
参考文献
- Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
- Campbell, L. P., et al.
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重印与许可
