Aedes aegypti 蚊子感染 Wolbachia 后被释放到自然种群中，以抑制节肢动物传播病毒的传播。本文描述了在实验室中培育携带 Wolbachia 感染的 Ae. aegypti 的方法，用于实验和野外释放，并采取预防措施以尽量减少实验室适应和选择效应。
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摘要
摘要
Aedes aegypti 蚊子在实验条件下感染 Wolbachia 后，正被用于控制登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒等虫媒病毒的传播。携带 Wolbachia 的蚊子可被释放到野外，通过不相容交配减少种群数量，或使种群转变为对病毒传播具有抗性的蚊子。为使这些策略成功，从实验室释放的蚊子必须具备与本地蚊子相当的竞争能力。然而，实验室饲养可能导致近亲繁殖、遗传漂变以及对实验室环境的适应，从而降低其在野外的适应性，并可能干扰实验结果。为了评估不同 Wolbachia 感染株系在野外应用的适用性，必须在受控的实验室环境中维持蚊子多代繁殖。本文介绍了一种在实验室中维持 Ae. aegypti 蚊子的简易方案，该方案适用于携带 Wolbachia 的蚊子以及野生型蚊子。该方法最大限度地减少了实验室适应效应，并引入杂交繁殖，以提高实验结果对野外蚊子的代表性。此外，蚊群在最优条件下维持，以最大化其在开放野外释放时的适应性。
引言
Aedes aegypti 蚊子是传播全球一些最重要虫媒病毒的媒介，包括登革热病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒1。随着Ae. aegypti在热带地区的分布范围持续扩大，这些病毒对全球公共卫生的威胁日益加剧2,3,4。雌性Ae. aegypti偏好吸食人血5，因此通常生活在人类附近，尤其是在人口最密集的城市地区。由于与人类密切共处，它们也已适应在人工环境中繁殖，包括轮胎、花盆、排水沟和储水罐等场所6,7。与Aedes属中某些其他物种不同，Ae. aegypti还能轻松适应实验室环境，在直接从野外采集后无需特殊条件即可长期维持培养8,9,10。因其易于饲养，该蚊种已被广泛用于实验室研究，涵盖多个研究领域，最终目标是控制蚊子可能传播的疾病。
传统上，虫媒病毒的防控主要依赖使用杀虫剂来减少蚊虫种群数量。然而，目前人们越来越关注一种方法，即在实验室中培育经过改造的蚊子，然后将其释放到自然种群中。释放的蚊子可能经过基因改造11,12,13、生物改造14,15、辐照处理16、化学处理17,18，或采用多种技术结合的方式19，以达到抑制蚊子种群数量，或将其替换为对虫媒病毒传播具有抗性的蚊子的目的20。
Wolbachia 是目前被用作节肢动物传播病毒生物防治剂的细菌. 多个菌株 Wolbachia 最近被引入 埃及伊蚊 通过胚胎显微注射进行实验21,22,23,24这些菌株可降低蚊媒病毒在蚊虫体内的扩散和复制能力，从而减弱其传播潜力。23,25,26,27,28. Wolbachia 感染可通过母体传播给子代，但某些菌株在感染雄性与未感染雌性交配时会引发不育22. Wolbachia因此，可大量释放感染的雄性蚊子以抑制自然蚊群数量，这一点已在其他研究中得到近期证实 伊蚊 物种15,29。然而，由于 Wolbachia 也能抑制节肢动物传播的病毒传播 埃及伊蚊，还可以释放蚊子以替代传播能力较弱的本地种群。 埃及伊蚊 实验性感染 Wolbachia 目前正在多个国家采用后一种方法将其释放到野外14,30,31.
Wolbachia介导的虫媒病毒控制方法依赖于对Wolbachia、蚊虫及其环境之间相互作用的深入理解。Wolbachia在多种昆虫中天然存在，而引入蚊虫中的不同菌株在效应上具有多样性32。随着新的Wolbachia感染类型被引入埃及伊蚊（Ae. aegypti）24，有必要在多种条件下对每种菌株在蚊虫适合度、繁殖能力以及虫媒病毒阻断效应等方面的影响进行系统表征。因此，必须在实验室中开展严谨的实验，以评估这些Wolbachia菌株在实地应用中的潜在成效。
在释放区进行携带 Wolbachia 感染的 Ae. aegypti 开放式野外释放时，通常每周需要饲养数千至数万只蚊子14,30,31。通过释放体型较大的蚊子，可提高其繁殖力33和交配成功率34,35，从而提升初期释放的效果。然而，蚊子也应适应其在野外将面临的环境条件，长期实验室饲养可能导致行为和生理上的改变，进而影响其在野外的表现36,37,38。
我们描述了一种简单的饲养方案 埃及伊蚊 在实验室中利用基本设备进行。本方案适用于野生型和 Wolbachia感染的蚊子，后者可能需要特别关注，因为某些情况 Wolbachia 菌株对蚊子的生活史性状具有显著影响39,40饲养条件避免过度拥挤和食物竞争，以获得大小一致的蚊虫，这对于媒介能力与适应性实验至关重要，同时确保蚊虫健康，适合野外释放41我们还采取预防措施，通过减少选择压力并确保下一代来自一个大型且随机的群体，以尽量降低实验室适应性和近交现象。然而，实验室环境与野外条件明显不同，长期在宽松条件下维持培养可能会降低蚊虫在释放到野外后的适应能力。37,42,43因此，我们定期将实验室品系的雌性与野外采集的雄性进行杂交，从而获得在遗传上较为相似、且适应目标野外种群的实验群体39这些方法不需要任何特殊设备，且可扩大规模，每周可饲养数以万计的个体，用于野外释放。该方案还优先考虑蚊虫在当代及跨代的适应性，这对于旨在在自然种群中建立种群的昆虫而言是一个重要考量。该方案适用于大多数需要维持蚊虫种群的实验室 埃及伊蚊特别是在需要高质量且与野外情况具有可比性的蚊虫进行实验对照时尤为重要。
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方案
蚊子对人类受试者的吸血实验已获得墨尔本大学人类伦理委员会批准（批准编号：0723847）。所有志愿者均签署了知情同意书。
1. 幼虫培育
注意：在本蚊虫种群维持方案中，蚊虫饲养环境温度为 26 ± 0.5 °C，相对湿度为 50–70%，光照周期为 12:12 小时（光:暗）。这些条件接近澳大利亚凯恩斯地区的平均气候条件，且处于埃及伊蚊（Ae. aegypti）存活与发育的最适温度范围内44,45,46。高温可能导致蚊虫种群中沃尔巴克氏体（Wolbachia）感染的丢失，应予以避免47。我们每个种群维持至少 500 只个体，以尽量减少近亲繁殖；种群规模过小可能对适应性产生不利影响 [Ross et al. 未发表数据]。在这些条件下，若营养充足，平均世代时间为 28 天（见表 1）。
- 将带有基质的卵放入托盘中浸入水中（图1A) 含3 L水（反渗透水或陈化自来水，后者通过将自来水置于托盘中静置24小时后使用）、约300 mg鱼食（一片压碎的饲料片，参见 材料表）并加入少量活性干酵母以诱导孵化48.
- 孵化后一天，使用玻璃移液管将约500条幼虫转移至含有4 L水的托盘中（图1B），使用计数器进行计数。每个培养皿中加入两片压碎的鱼饲料片。如有需要，可使用不同大小的容器进行幼虫培养（图1A），但幼虫密度应保持在0.5 条幼虫/mL以下，以避免过度拥挤。
- 每天检查托盘，确保幼虫有充足的食物；每隔两天向托盘中添加约两片食物片。提供食物 随意摄取 但需确保在此期间每只幼虫每日可获得 0.5 mg，以保证发育同步且体形大小一致，否则实验结果可能受到干扰（参见代表性结果）。
- 注意避免过度喂养幼虫，尤其是在表面积和水体较小的饲养容器中。若发现水体浑浊或幼虫出现明显死亡，应更换为新鲜水体；若喂养得当，幼虫死亡率应极低。
2. 成虫羽化
注意：若食物充足，幼虫将在孵化后五天开始化蛹，大多数幼虫应在孵化后七天内完成化蛹。若在26 °C下进行最佳培养，成虫将在化蛹后约两天开始羽化（见代表性结果）。当食物充足时，沃尔巴克氏体（Wolbachia）感染通常不会影响幼虫的发育23,39,49。
- 孵化后第七天，将托盘中的全部内容物倒入细网筛（孔径0.4 mm）中过滤。保留滤过的幼虫水，后续用于产卵杯（见“血液喂养与产卵”部分）。将筛网翻转，浸入装有200 mL水的塑料容器中，以转移蛹。如有幼虫残留，需补充食物。
- 准备成虫羽化笼（图1C），放入两杯10%蔗糖溶液（图1F）和两杯湿润的脱脂棉，以防干燥（图1E）。
- 若无需按性别分离蛹，可将带盖的蛹容器放入羽化笼中，并将盖子略微打开，以便成虫自行羽化进入笼内。或者，在容器上方倒置一个漏斗，以减少溺亡风险。在从笼中移除容器前，应确保所有成虫均已羽化，以避免对发育较慢个体造成选择性淘汰。
3. 用于杂交的蛹期性别鉴定
- 如果蛹需要按性别进行分拣（例如，用于杂交）用移液管将蛹从幼虫培养盘中移出，并按性别分离（图2) 转移至塑料容器中（图1A每隔24小时用200 mL水更换一次，直至获得所需数量的每种性别的个体。将容器盖上盖子并保持密闭。
- 成虫将羽化至容器中；在将其释放到笼子之前，需确认其性别（图2C）。在成虫羽化后24小时内，使用吸虫器移除任何被错误鉴定性别的个体，以防止其达到性成熟。确认性别后，每隔24小时将成虫释放至饲养笼中。
- 为了获得 Wolbachia- 与自然种群具有相似遗传背景的感染群体，通过添加进行远交 Wolbachia-将实验室种群中感染的雌性个体放入笼中，与通过野外诱卵器收集的卵所孵化出的未感染雄性个体共同饲养39，保持每个种群500个个体的既定密度。
- 连续进行至少三代的杂交，以产生在遗传上至少与野外种群有87.5%相似性的群体39关键步骤：确保此阶段的性别正确（参见步骤 3.1）。
- 女性 埃及伊蚊 通常在交配数小时内对再次交配具有抗性50在异交品系繁殖时，将雌性和雄性分别置于不同笼中成熟两天，然后用吸管将雌性转移到雄性笼中，使所有雄性均有平等的交配机会。
4. 血液喂养与产卵
- 在最后一批雌蚊羽化后至少等待三天再进行血液饲喂，以确保其充分成熟。雌蚊应在羽化后两周内完成血液饲喂，以防止过高的死亡率，特别是对于携带影响寿命的 Wolbachia 感染的蚊虫22,24,49。饲喂前一天移除糖杯，以提高吸血率。
- 请志愿者将前臂伸入笼中，使雌蚊能够吸血。大多数雌蚊可在5分钟内完成饱食，但为了减少对吸血速度较慢个体的选择压力，建议将前臂留在笼中15分钟，或直至所有雌蚊明显吸血膨胀；可选择佩戴乳胶手套以保护手部免受叮咬，建议使用。
- 血液饲喂两天后，在笼内放入两个盛有幼虫培养水并内衬砂纸条（图1G）（或滤纸条（图1H））的塑料杯，供雌蚊产卵。将砂纸条部分浸入水中以保持湿润。移除其他水源，防止雌蚊在产卵杯外产卵。
注意：杯中可使用自来水，但使用幼虫培养水可促进产卵行为51,52，且雌蚊产卵更为同步。
5. 卵的收集与处理
- 雌虫将在水线以上的砂纸上产卵；每天收集并更换一次砂纸条，直至不再有卵产出。注意，产卵过程可能持续长达一周。
- 将砂纸条在纸巾上轻轻按压30秒，使其部分干燥，注意不要使卵脱落。随后，用一张干燥的纸巾包裹砂纸条，并放入可密封的塑料袋中（图1I）。
- 在解剖显微镜下检查卵的状态（图3）。若砂纸条过湿，卵可能在浸水前提前孵化（图3B）；若干燥过度，则卵可能塌陷（图3C）。
- 卵可在采集后第三天起随时孵化；为确保下一代个体来自一个大而随机的群体，应将同一品系在不同天数采集的所有卵集中于同一容器的水中进行孵化。
- 如需长期保存，可将卵置于密封容器中，在约20 °C、高湿度（> 80%）条件下储存。在此条件下，未感染 Wolbachia 的卵可保存数月，且仍保持较高的孵化率53,54。
- 由于某些 Wolbachia 感染会显著降低卵随时间推移的存活能力49,55，因此应于采集后一周内孵化感染 Wolbachia 品系的卵，以避免相关品系出现过度死亡。若需要更多卵，可在一周后再次对雌虫进行血液饲喂。
| 天数 | 步骤 | ||
| 0 | 孵化卵 | ||
| 1 | 将幼虫计数后放入托盘 | ||
| 7 | 将幼虫和蛹转移至种群饲养笼 | ||
| 17 | 对雌性成虫进行血液饲喂 | ||
| 21 | 开始收集卵 | ||
| 25 | 完成卵的收集 | ||
| 28 | 孵化卵 | ||
表1：26 °C条件下埃及伊蚊（Ae. aegypti）种群维持时间表概述。 雌蚊吸血和卵孵化的时间具有灵活性，但应避免在这些阶段停留过久，特别是对于感染了沃尔巴克氏体（Wolbachia）的蚊子，以尽量减少死亡率。遵循此时间表可在各生活阶段最大限度地减少对发育或成熟速度较快或较慢蚊虫的筛选压力，前提是幼虫获得最佳喂养。
图1：用于饲养的设备 埃及伊蚊 在实验室中。 (A用于孵化卵或培育幼虫的塑料容器，容积分别为 500、750 和 5,000 mL（从左至右）。B用于在受控密度下饲养幼虫的托盘，通常在4升水中饲养500条幼虫。C) 19.7 L 和 (D使用3 L的笼子饲养成虫，每升密度应维持在25只或更少，以提供充足的空间。E35 mL 杯中装有湿润的棉絮，为成虫提供水源。F) 35 mL 杯中装有蔗糖溶液，通过棉线或牙科棉条提供糖源。G-H装有幼虫饲养水并内衬砂纸或滤纸作为产卵基质的杯子G 和 H，分别）。(I用于存放砂纸条或滤纸的自封袋。砂纸上的黑色斑点为蚊卵。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：Ae. aegypti 蛹和成虫的侧面（A）和背侧（B）视图（C），展示其性别二态性。 每个图中雄性位于左侧，雌性位于右侧。在营养充足条件下，雄性和雌性蛹可通过体型区分；雌性大于雄性（A），且头胸部相对较膨大，而雄性两侧较扁平（B）。在所有饲养条件下，成虫雄性和雌性均易于区分，主要依据是雄性具有羽状触角和较长的喙状附肢。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 不同条件下保存的四日龄 Ae. aegypti 蚊卵。（A）附着在砂纸上、处于高湿度（> 80%）但无可见水分条件下的完整蚊卵。若保存得当，野生型 Ae. aegypti 蚊卵的孵化率应高于90%。（B）在未浸水前即提前孵化的蚊卵，其特征为卵盖脱落并可见幼虫。这表明砂纸条湿度过高。（C）过度干燥的蚊卵可能出现塌陷，表现为明显的凹陷形态。若砂纸变硬，也提示蚊卵可能过于干燥。请点击此处查看该图的放大版本。
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结果
图4展示了营养不足对埃及伊蚊（Ae. aegypti）幼虫发育的影响。当每个幼虫每日获得的食物为0.25 mg或更少时，雄性和雌性幼虫的发育时间均会延长，且发育同步性低于每日获得0.5 mg食物的容器中的幼虫。若在整个幼虫发育期间未能提供充足的食物，可能对维持培养的计划产生不利影响。发育缓慢的个体可能面临被淘汰的风险，吸血行为可能被延迟，且在繁殖发生前成虫死亡的风险更高。
图5展示了在不同营养条件下饲养的埃及伊蚊（Ae. aegypti）成蚊的翅长（作为体型大小的估算指标）。当营养不足时，雄蚊和雌蚊的翅长均显著减小，且变异程度增大。在实验比较中，保持一致的体型大小非常重要，因为体型大小与繁殖力呈正相关，而在野外条件下，体型较大的蚊子预期具有更高的适应性33
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讨论
遵循本方案中所述的维持感染Wolbachia的Ae. aegypti的方法，可确保为实验和开放环境释放提供健康且质量稳定的蚊虫。与其他优先大量生产蚊虫的方案（参见参考文献57）不同，本方法侧重于提高蚊虫的适应性，既通过宽松的饲养条件提高代内适应性，又通过减少近亲繁殖、选择压力和实验室适应来优化跨代适应性。该方案虽专为携带Wolbachia感染的Ae. aegypti设计，但也适用于其他类型的Ae. aegypti。然而，该方案不适合大规模饲养（每周数百万只的量级），而此类规模在需要大量个体以实现种群压制的不育或不相容昆虫释放项目中可能是必需的57,58。
有一些关键步骤需要仔细遵循。在幼虫发育期间，必须提供充足的饲料并避免过度拥挤，以确保蚊虫同步发育且个体大小一致。在卵的孵化处理过程中也需格外小心；若产卵基质过湿或过干，幼虫可能过...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢叶恒林（Heng Lin Yeap）、Chris Paton、Petrina Johnson 和 Clare Doig 在建立种群维持方法过程中所做出的贡献，同时感谢三位匿名审稿人提出的建议，这些意见有助于改进本文稿。本研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）提供的项目资助和研究员基金（授予 AAH）以及惠康信托基金会（Wellcome Trust）提供的转化研究基金的支持。PAR 获得了澳大利亚政府研究培训计划奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 野生型 Aedes aegypti | 采自澳大利亚昆士兰地区的野外地点，详见 Yeap 等人39 的研究 | ||
| w Mel 感染的 Aedes aegypti | 由莫纳什大学提供。有关该品系的信息，请参见 Walker 等人23 的研究 | ||
| w AlbB 感染的 Aedes aegypti | 由莫纳什大学提供。有关该品系的信息，请参见 Xi 等人21 的研究 | ||
| w MelPop 感染的 Aedes aegypti | 由莫纳什大学提供。有关该品系的信息，请参见 McMeniman 等人22 的研究 | ||
| 速溶干酵母 | Lowan | 用于刺激卵孵化。可在普通杂货店购买。其他品牌亦可使用 | |
| 5 L 塑料桶 | Quadrant | Q110950 | 用于卵的孵化及幼虫饲养。其他产品亦可使用 |
| 鱼食（Tetramin 热带片剂） | Tetra | 16152 | 作为幼虫的食物来源。网址：https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE |
| 塑料容器 | 用于幼虫饲养。任何容量超过 500 mL 的塑料容器均可适用 | ||
| 玻璃移液管 | 用于在不同容器间转移幼虫和蛹。网址：https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez | ||
| 计数器 | RS Pro | 710-5212 | 用于辅助计数幼虫、蛹和卵。网址：http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y |
| 饲养盘 | Gratnells | 用于幼虫饲养。网址：http://www.gratnells.com | |
| 尼龙网筛 | 用于将幼虫和蛹转移至新鲜水中。其他品牌亦可使用。网址：https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white | ||
| 饲养笼 | BugDorm | DP1000 | 用于成蚊饲养。可使用替代产品。网址：http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| 35 mL 塑料杯 | Huhtamaki | AA272225 | 用于为成蚊提供水或蔗糖溶液。其他品牌亦可使用 |
| 35 mL 塑料杯盖 | Huhtamaki | GB030005 | 用于为成蚊提供蔗糖。其他品牌亦可使用 |
| 脱脂棉 | Cutisoft | 71841-13 | 湿润的脱脂棉作为成蚊的水源。其他品牌亦可使用 |
| 白砂糖 | 作为成蚊的糖源。可在普通杂货店购买 | ||
| 绳索 | M Recht Accessories | C323C/W | 用于为成蚊提供蔗糖溶液。其他品牌亦可使用。网址：https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/ |
| 塑料杯（大号） | 用作产卵容器。任何可容纳 100 mL 水的塑料杯均可适用 | ||
| 砂纸 | Norton Master Painters | CE015962 | 作为产卵基质提供。可使用替代产品，但本实验选用该品牌因其气味较淡。较浅的颜色有助于与卵形成对比。网址：https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html |
| 滤纸 | Whatman | 1001-150 | 作为替代产卵基质使用。其他品牌亦可使用 |
| 乳胶手套 | SemperGuard | Z560979 | 防止在血液饲喂过程中被蚊子叮咬手部。其他品牌亦可使用。网址：http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/ |
参考文献
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