本文介绍一种简单且易于实现的方法，用于损伤黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的节段神经，以在三龄幼虫的神经肌肉接头（NMJ）处观察并定量分析运动神经元的神经退行性变化。
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本文内容
摘要
摘要
神经元的变性在正常发育过程中以及对损伤、应激和疾病反应中均会发生。人类与无脊椎动物中神经元变性的细胞学特征极为相似，驱动这些过程的分子机制亦如此。果蝇， 黑腹果蝇，为研究神经退行性疾病的细胞复杂性提供了一个强大而简单的遗传模型生物。事实上，约70%与人类疾病相关的基因具有同源基因 果蝇 同源基因以及大量利用果蝇研究人类神经退行性疾病的工具和检测方法已被报道。更具体而言，果蝇的神经肌肉接头（NMJ）在 果蝇 由于能够分析神经元与肌肉之间的结构连接，该系统已被证明是研究神经肌肉疾病的有效方法。本文报道了一种 体内 运动神经元损伤检测在 果蝇，可在24小时后稳定地诱导神经肌肉接头处的神经退行性变。利用该方法，我们已描述了导致运动神经元退变的一系列时序性细胞事件。该损伤模型具有广泛的应用价值，已被用于鉴定神经退行性变所必需的特定基因，并解析神经元损伤后的转录响应机制。
引言
神经元退化发生在正常发育过程中，也可能由自然衰老过程、损伤、应激或疾病状态引起。 黑腹果蝇，这种常见的果蝇，由于在驱动神经元退化的分子机制方面与人类具有显著的相似性，因而为研究神经退行性变提供了简单而强大的模式生物。这种相似性体现在约70%与人类疾病相关的基因在果蝇中具有同源基因 黑腹果蝇 同源基因1 此外，已开发并应用了多种用于研究人类神经退行性疾病的检测方法和技术工具 果蝇.2,3 在……之内 黑腹果蝇神经肌肉接头（NMJ）可用于分析细胞和电生理特性，因其具有可见的神经-肌肉连接，已成为研究神经肌肉疾病的重要系统。2 在本研究中，我们描述了一种 体内 神经元损伤检测 果蝇 幼虫，可实现节段神经的可重复性损伤。该运动神经元损伤会在神经肌肉接头处引发一系列时序性细胞事件，导致24小时后出现神经退行性变 损伤后。可重复地损伤运动神经元并诱导神经退行性变的能力具有广泛的应用，例如鉴定退行性过程所必需的特定基因、解析神经元损伤后的转录响应，以及分析保护性信号级联反应。4,5,6 该方法还已与微流控技术结合，用于研究活体动物中的神经元变性和再生。7
我们采用一种已建立的定量检测方法，以研究机械损伤后黑腹果蝇（Drosophila）神经肌肉接头（NMJ）处的运动神经元变性。该检测方法基于以下事实：在突触后肌膜褶皱所构成的突触下网状结构（SSR）解体之前，突触前膜及其蛋白会首先丢失。8,9,10,11,12,13 该方法可用于量化"突触印迹"，即突触前神经元与相邻突触后肌肉失去连接的部位。研究表明，这一退行性过程在整个幼虫发育期间呈进行性发展12，且不能归因于突触发育异常或侧支出芽。8,9,10,11,12 相较于利用已有突变体，机械损伤的优势在于能够解析导致NMJ处神经变性的细胞事件的时间顺序。13
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方案
1. 试剂与仪器的准备
- 配制1x解剖缓冲液（70 mM NaCl，5 mM KCl，0.02 mM CaCl2，20 mM MgCl2，10 mM NaHCO3，115 mM蔗糖，5 mM海藻糖，5 mM HEPES； pH 7.2）。
- 配制1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
- 使用含0.01% Triton X-100的1x PBS配制1x PBT。
- 制备果汁琼脂平板。14 简言之，将30 g琼脂加入700 mL H2O中，高压灭菌。将0.5 g对羟基苯甲酸甲酯溶解于10 mL乙醇中，然后加入300 mL果汁浓缩液（葡萄或苹果）。将浓缩液混入已高压灭菌的琼脂溶液中，倒入10 mm × 35 mm培养皿的皿盖中。
注：葡萄琼脂预混粉也可从多家公司购买（参见材料表）。 - 准备5号镊子，用于对幼虫进行机械损伤。
- 使用标准的基于Drosophila CO2的麻醉装置。
2. 选择 Drosophila 幼虫
- 取一个试剂瓶或瓶子 黑腹果蝇 含有在25 °C下培养的游走三龄幼虫。
- 选择十个独立的2nd 或 3rd 根据外观区分龄期幼虫。三龄幼虫可通过前端分枝状气门识别，而二龄幼虫体型较小，前端气门呈棒状。
注意：幼虫阶段也可根据时间进行鉴定。在 25 °C 条件下，二龄幼虫约在孵化后 48 小时出现，三龄幼虫则在其后约 24 小时蜕皮形成。若需观察神经肌肉接头处的神经退行性变化，需对二龄幼虫进行损伤处理。
3. 准备 果蝇 用于机械损伤的幼虫
- 使用镊子或画笔小心夹取单个幼虫，注意不要以任何方式挤压幼虫。
- 将十只幼虫直接放入盛有冷的1×PBS或解剖缓冲液的玻璃培养皿中，以去除食物残渣并减缓幼虫活动能力。
4. 机械损伤与处理 果蝇 幼虫
- 将每只幼虫放置在 CO2 麻醉装置上。
- 在解剖显微镜下，小心地将每只幼虫翻转至背侧，以便透过体壁观察节段神经。
- 从口钩开始，将5号镊子置于幼虫体长的约1/2至2/3处。定位后，用5号镊子夹住包含节段神经的大约1/3腹侧体壁。
- 为确保幼虫节段神经受损，需施加足够力量压碎节段神经，同时保持体壁完整。为确定合适的力度，可先压碎10只幼虫，并确保5小时后的死亡率低于50%。
- 损伤后，小心将幼虫转移至含有约0.5 g酵母糊的果汁琼脂平板上。将每只幼虫的前端置于酵母糊上，以保证其在运动功能受损的情况下仍可继续摄食。
注意：为确认幼虫节段神经已受损，可在转移至琼脂平板后观察其运动功能是否受损。受损幼虫在损伤部位后方基本瘫痪，但仍可活动口钩并进食。损伤后动物死亡率较高，因此建议损伤的动物数量比实验所需多20–50%。 - 将含有酵母糊和10只受损幼虫的琼脂平板放入一个空的100 × 15 mm培养皿底部。用一张湿润的纸巾覆盖该培养皿（其中已放置了受损幼虫的琼脂平板），注意纸巾不得接触幼虫或琼脂平板。将此培养皿置于较大的密闭容器中，在室温下保存。
- 在损伤后指定时间点（6、12或24小时）取出幼虫进行解剖。
注意：若需观察损伤对轴突细胞骨架的即时影响，可在损伤后立即解剖幼虫；若需观察轴突运输缺陷，可在损伤后约6小时解剖；损伤约12小时后可观察到泛素化蛋白的积累；损伤24小时后可在神经肌肉接头处观察到运动神经元的退变。
5. 神经肌肉接头处神经变性的分析
- 按照先前所述方法解剖 Drosophila 幼虫神经肌肉接头（NMJ）。15,16 简言之，将幼虫固定于Sylgard培养皿上，沿背侧切开，并用解剖针在解剖缓冲液液滴中展开成肌膜外翻标本，以暴露体壁肌肉。根据所用抗体的不同，使用4%多聚甲醛（PFA）或Bouin氏液固定幼虫，以标记神经元和肌肉。
注意：若需观察荧光蛋白标签（如绿色荧光蛋白GFP），应使用PFA固定，因为Bouin固定液可能过于强烈而影响荧光信号。 - 进行先前已描述的免疫荧光染色11,13,16，以同时标记突触前运动神经元和邻近的突触后肌膜褶皱（SSR）。使用荧光标记的辣根过氧化物酶（HRP）（1:300）17 标记突触前膜和轴突，使用抗Bruchpilot（Brp）抗体（nc82；1:100；Developmental Studies Hybridoma Bank）标记活性区。同时使用抗Discs Large（Dlg）抗体（1:10,000）18 标记突触后肌肉。
- 采用先前建立的方法定量分析NMJ处的神经变性8,9,10,11,12,13,14。简言之，同时观察单个NMJ的突触前和突触后区域。任何仅被突触后标记物标记而无突触前标记物的突触小泡，均指示神经变性位点（图1）。可定量每条NMJ的平均突触小泡数量以及每只动物的平均NMJ数量。
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结果
通过采用此处介绍的方法，我们已证明机械性神经元损伤可实现对神经退行性事件的时间解析。14,18 此类事件的发生顺序此前已有表征，其过程始于细胞骨架的即刻破坏，随后出现轴突运输障碍、泛素化蛋白累积，并在损伤后24小时发生继发性神经退行性变。在损伤前，野生型神经肌肉接头（NMJ）显示突触前活性区标志物Brp与突触后标志物Dlg在整个NMJ区域相互对置（图1A）。节段神经的机械性损伤可诱导中度至重度的神经退行性变，表现为被Dlg染色的突触小泡不再含有突触前活性区蛋白Brp（图1B）。任何被Dlg染色但缺乏Brp信号的突触小泡均被视为“突触残迹”（synaptic footprint），可被计数并量化为一次神经退行性事件。神经退行性表型的频率和严重程度均可按照先前所述方法进行量化。11
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讨论
此前所述并在此展示的神经元机械性损伤可用于诱导节段神经的损伤/应激 果蝇 幼虫4,5,6,14 该实验技术此前已被用于解析导致神经退行性变事件的时间序列，以及研究损伤后运动神经元胞体内的转录变化。5,14 此外，该技术已与微流控芯片联用，以观察和研究轴突的变性与再生过程 果蝇 幼虫7 该技术的局限性包括在造成损伤时因刺破幼虫表皮而导致幼虫死亡。然而，可在短时间内处理大量幼虫，以弥补较高的幼虫死亡率。我们引入的一项改进措施是对2nd 龄期或早期3rd 龄幼虫，这对于观察损伤后24小时发生的神经肌肉接头处运动神经元的退化至关重要。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢昆尼皮亚克大学Keller实验室和Magie实验室的所有成员提供的有益建议。特别感谢Barron L. Lincoln II在Keller实验室中开发了这一损伤检测方法。我们还要感谢昆尼皮亚克大学文理学院授予L.C. Keller的科研资助（Grant-In-Aid）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 显微解剖剪刀 | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 镊子 | Fine Science Tools | 11231-30 | 有些人偏好3号，而有些人则偏好5号 |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-30 | 有些人偏好3号，而有些人则偏好5号 |
| CO2 空气钢瓶 | Tech Air | UN 1013 | 可购买不同规格的钢瓶 |
| CO2 麻醉装置 | Genesee Scientific | 59-114 | |
| 不锈钢针，0.1号 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 硅胶弹性体，基础剂与固化剂 | Dow Corning | 3097358-1004 | 用于制备解剖板 |
| Bouin氏溶液 | Sigma | HT 10132-1L | 应测试抗体在Bouin氏溶液和PFA中的染色效率 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）中含4%多聚甲醛（PFA） | Affymetrix | FLY-8030-20 | 应测试抗体在Bouin氏溶液和PFA中的染色效率 |
| 解剖体视显微镜 | AmScope | SM-1BZ | |
| 光源 | AmScope | HL150-AY-220V | |
| 抗nc82抗体 | 发育研究杂交瘤库 | nc82-s | |
| 抗discs large抗体 | 发育研究杂交瘤库 | AF3 | |
| Alexa Fluor 抗辣根过氧化物酶 | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | 可选用Alexa Fluor® 488、594或647 |
| 果蝇培养基葡萄汁琼脂预混粉 | Genesee Scientific | 47-102 | |
| 显微镜载玻片 | Genesee Scientific | 29-101 | |
| 玻璃盖玻片 | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene 工具箱 | Fisher Scientific | 03-484C | 用于构建幼虫恢复用的保湿室 |
参考文献
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