原位 MHC-四聚体染色及定量分析以确定组织中抗原特异性CD8 T细胞的位置、丰度和表型

摘要

此处，我们介绍一种结合了 原位 使用MHC四聚体染色结合免疫组织化学技术确定组织中抗原特异性T细胞的定位、表型及数量。该方案用于分析抗原特异性CD8 T细胞在组织中相对于其他细胞类型和结构的空间分布及表型特征。

摘要

T细胞在许多免疫学过程中发挥关键作用，包括识别和清除病毒感染的细胞、防止自身免疫、协助B细胞和浆细胞产生抗体，以及识别和清除癌细胞。通过流式细胞术分析抗原特异性T细胞的MHC四聚体染色技术的发展，彻底改变了我们研究和理解T细胞免疫生物学的能力。尽管该技术在确定抗原特异性T细胞的数量和表型方面极为有用，但流式细胞术无法确定抗原特异性T细胞在组织中与其他细胞和结构之间的空间定位关系，而目前用于提取T细胞以进行流式细胞术的组织解离技术在非淋巴组织中的效率有限。原位MHC四聚体染色（IST）是一种用于在组织中可视化针对特定抗原的T细胞的技术。结合免疫组织化学（IHC），IST可确定组织中抗原特异性CD8和CD4 T细胞的丰度、定位及表型。本文中，我们描述了一种对具有特定表型、位于特定组织区室内的抗原特异性CD8 T细胞进行染色和计数的实验方案。这些方法正是我们近期由Li et al. 发表的研究论文《"滤泡中产生猴免疫缺陷病毒的细胞在体内部分受到CD8⁺细胞的抑制。"》中所使用的方法。所述方法具有广泛的适用性，因为只要存在相应的MHC四聚体，即可用于在任何组织中定位、表型鉴定和定量几乎所有抗原特异性的CD8 T细胞。

引言

T细胞在许多免疫学过程中起着关键作用，包括识别和清除病毒感染的细胞、防止自身免疫、协助B细胞和浆细胞产生抗体，以及识别和清除癌细胞。通过流式细胞术对特异性抗原CD8 T细胞进行肽/MHC I类四聚体染色技术的建立¹，以及近期发展的CD4 T细胞MHC II类四聚体染色技术²，彻底改变了我们研究和理解T细胞免疫生物学的能力。尽管流式细胞术在确定抗原特异性T细胞的数量和表型方面极为有用，但它无法检测抗原特异性T细胞在组织中与其他细胞和结构之间的空间定位关系；此外，目前用于提取流式细胞术所需T细胞的组织解离技术在非淋巴组织中的效率有限³。

我们及其他研究者已开发出利用多肽负载的MHC I类和II类四聚体或多聚体试剂对组织中抗原特异性的CD8和CD4 T细胞进行染色的方法^{4,5,6,7,8,9,....}

方案

1. 第1天：新鲜组织切片与一抗孵育

1. 使用手术刀将新鲜组织切成小块（约0.5 cm宽 × 0.5 cm高）。将每块组织分别粘附于活塞上，并用3–5 mL含4%低熔点琼脂糖的PBS包埋。使用标签纸在活塞上标注组织信息。将其置于冰桶中的预冷固定架内，使其凝固。
2. 打开切片机，将切片厚度设置为 200 µm。在切片机上安装剃刀刀片，并将装有组织的样品托插入切片机的水浴槽中。
3. 在磷酸盐缓冲液中加入肝素，配制含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS-H），肝素终浓度为100 µg/mL或18.7 U/mL，以保护RNA并为后续可能的原位杂交（ISH）应用提供条件。向切片机浴槽中加入100–120 mL预冷的无菌PBS-H，完全浸没包埋的组织。向浴槽中加入PBS-H冰块，维持温度在0–2 °C。启动切片机，将组织切成200 µm厚的切片。
   注意：必须将组织保持在冰上冷藏，以尽量减少组织内的细胞活性，同时冷藏的组织更易于切片。如果后续不进行原位杂交（ISH），可单独使用PBS。
4. 或者，对于那些使用切片机难以切片的组织（例如， 肠道和肺组织）使用手术刀或剃须刀片将组织切成尽可能接近200 µm的薄条。
5. 用实验样本信息标记24孔细胞培养板的盖子，并将组织小室放入对应的孔中。使用画笔将切片转移至置于24孔细胞培养板孔内的组织小室中，该孔内含有1 mL预冷的PBS-H。
   注意：在开始染色前应预先制备可重复使用的组织染色....

结果

图1展示了如何使用共聚焦显微镜采集共聚焦图像。图2展示了使用ImageJ进行定量图像分析的方法。图3和图4展示了来自感染SIV的恒河猴淋巴结组织的代表性图像，组织经MHC四聚体、CD8抗体和CD20抗体染色，用于展示MHC四聚体染色的特异性。图3比较了负载SIV来源肽段的MHC I类分子四聚体与同一组织切片中负载无关肽段的MHC I类分子四聚体的染色结果。图4显示，经MHC/SIV肽段四聚体染色的细胞可与CD8抗体共染色，但不与标记B细胞的CD20抗体共染色。图5展示了一个拼接图像的示例，该图像由多个用于定量分析淋巴结不同解剖区域中具有特定表型的四聚体染色细胞的共聚焦z轴序列图像组合而成。放大区域显示淋巴结中一.......

讨论

IST联合IHC为在包含其他细胞和组织结构的原生环境中检测、鉴定和定量抗原特异性CD8 T细胞提供了重要工具。本文详细描述了IST与IHC联合使用的实验流程，并结合定量图像分析，以确定恒河猴淋巴结中抗原特异性CD8 T细胞的定位、丰度及表型。类似染色方法可应用于人类、小鼠或其他物种的组织，前提是存在相应的MHC-I四聚体。此外，也可采用相对类似的方法，利用肽-MHC II类四聚体或右旋糖酐多聚体（dextramer）染色标记组织中的抗原特异性CD4 T细胞。^{4,5,6,7,8,9,10,11,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MHC-I 单体	NIH 四聚体核心设施		MHC-四聚体制备材料
ExtrAvidin-FITC	Sigma-Aldrich	E2716	MHC-四聚体制备材料
正常山羊血清	Jackson Immunoresearch	005-000-121
低熔点琼脂糖	Promega	V3121
肝素	Sigma-Aldrich	SLBL6391V
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-6878
尿素	J.T.Baker	4204-05
甘油明胶	Sigma-Aldrich	SLBH2672V
正丙基没食子酸酯	Sigma-Aldrich	P3130
大鼠抗人CD8抗体（1:500）	Acris	0714	抗体不稳定，使用单次冻存分装
小鼠抗人CD20抗体（1:500）	NOVOCASTRA	6026819
小鼠抗人Ki67抗体（1:500）	Vector	6022201
山羊抗小鼠IgG-A488抗体（1:2,000）	Jackson Immunoresearch	124083
山羊抗兔IgG-Cy3抗体（1:5,000）	Jackson Immunoresearch	106232
山羊抗大鼠IgG-Cy5抗体（1:5,000）	Jackson Immunoresearch	118088
山羊抗人IgM-Dylight649抗体（1:5,000）	Jackson Immunoresearch	86579
切片机：VF-300 微型切片机	Precisionary Instruments, LLC	1079
快速固化瞬干胶	Loctite	46551
24孔平底组织培养板	Falcon	353226
显微镜载玻片	Globe Scientific Inc.	#1321
剃刀 刀片	Ted Pella, Inc	121-6
Feather 一次性手术刀	FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.	No. 21
2号圆头画笔	PRINCETON ART & BRUSH CO.	4350R	可根据需要使用剃刀修剪
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0	Olympus