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原位 MHC-四聚体染色及定量分析以确定组织中抗原特异性CD8 T细胞的位置、丰度和表型

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DOI：

10.3791/56130

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2017年9月22日

 ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

本文内容

摘要

此处，我们介绍一种结合了 原位 使用MHC四聚体染色结合免疫组织化学技术确定组织中抗原特异性T细胞的定位、表型及数量。该方案用于分析抗原特异性CD8 T细胞在组织中相对于其他细胞类型和结构的空间分布及表型特征。

摘要

T细胞在许多免疫学过程中发挥关键作用，包括识别和清除病毒感染的细胞、防止自身免疫、协助B细胞和浆细胞产生抗体，以及识别和清除癌细胞。通过流式细胞术分析抗原特异性T细胞的MHC四聚体染色技术的发展，彻底改变了我们研究和理解T细胞免疫生物学的能力。尽管该技术在确定抗原特异性T细胞的数量和表型方面极为有用，但流式细胞术无法确定抗原特异性T细胞在组织中与其他细胞和结构之间的空间定位关系，而目前用于提取T细胞以进行流式细胞术的组织解离技术在非淋巴组织中的效率有限。原位MHC四聚体染色（IST）是一种用于在组织中可视化针对特定抗原的T细胞的技术。结合免疫组织化学（IHC），IST可确定组织中抗原特异性CD8和CD4 T细胞的丰度、定位及表型。本文中，我们描述了一种对具有特定表型、位于特定组织区室内的抗原特异性CD8 T细胞进行染色和计数的实验方案。这些方法正是我们近期由Li et al. 发表的研究论文《"滤泡中产生猴免疫缺陷病毒的细胞在体内部分受到CD8+细胞的抑制。"》中所使用的方法。所述方法具有广泛的适用性，因为只要存在相应的MHC四聚体，即可用于在任何组织中定位、表型鉴定和定量几乎所有抗原特异性的CD8 T细胞。

引言

T细胞在许多免疫学过程中起着关键作用，包括识别和清除病毒感染的细胞、防止自身免疫、协助B细胞和浆细胞产生抗体，以及识别和清除癌细胞。通过流式细胞术对特异性抗原CD8 T细胞进行肽/MHC I类四聚体染色技术的建立1，以及近期发展的CD4 T细胞MHC II类四聚体染色技术2，彻底改变了我们研究和理解T细胞免疫生物学的能力。尽管流式细胞术在确定抗原特异性T细胞的数量和表型方面极为有用，但它无法检测抗原特异性T细胞在组织中与其他细胞和结构之间的空间定位关系；此外，目前用于提取流式细胞术所需T细胞的组织解离技术在非淋巴组织中的效率有限3。

我们及其他研究者已开发出利用多肽负载的MHC I类和II类四聚体或多聚体试剂对组织中抗原特异性的CD8和CD4 T细胞进行染色的方法4,5,6,7,8,9,10,11,12,13这些原位免疫标记技术（IST）可用于确定组织中抗原特异性CD8和CD4 T细胞的位置、丰度及表型，并提供一种手段以检测这些细胞相对于组织中其他细胞和结构的分布情况。本研究团队已广泛采用MHC-I四聚体染色技术，在淋巴组织、生殖道和直肠组织中研究人类免疫缺陷病毒（HIV）和猴免疫缺陷病毒（SIV）特异性的CD8 T细胞，以深入理解HIV和SIV的免疫病理发生机制，并识别有效疫苗接种策略的相关免疫标志。14,15,16,17此外，我们还开发了一种将IST与 原位 杂交（ISH）技术用于在组织中定位和定量病毒特异性的CD8 T细胞及病毒感染的细胞，并确定 体内 效应细胞与靶细胞比例18,19.

本文介绍一种利用多肽负载的MHC-I四聚体对新鲜组织切片中抗原特异性的CD8 T细胞进行染色，结合免疫组化（IHC）对组织进行复染，并在特定组织区域中定量具有特定表型的细胞的方法。这些实验步骤与我们近期发表的Li et al. 的研究中所采用的方法相同，该研究确定了在猕猴慢性SIV感染期间，SIV特异性T细胞在淋巴组织中的定位、丰度及表型20。

该实验步骤中，将新鲜组织切片后与负载多肽的MHC-I四聚体（与异硫氰酸荧光素分子（FITC）偶联）在室温下孵育过夜。随后用多聚甲醛固定组织。固定后，使用兔抗FITC抗体对MHC四聚体信号进行扩增，并进一步与荧光标记的抗兔IgG抗体孵育，以进一步增强结合四聚体的信号。免疫组织化学（IHC）与原位染色技术（IST）联合使用，用于表征抗原特异性T细胞及其周围细胞。识别细胞表面或细胞外空间表位的抗体可在与四聚体共同孵育的一抗步骤中加入；而识别细胞内表位的抗体则需在染色前对细胞膜进行通透处理。染色后的组织切片使用共聚焦显微镜成像，并通过共聚焦图像分析软件进行分析。标记细胞的数量可通过共聚焦显微镜软件或ImageJ软件进行定量。本方案可用于对任何可获得MHC-I四聚体的组织中几乎所有抗原特异性的CD8 T细胞进行染色。

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方案

1. 第1天：新鲜组织切片与一抗孵育

  1. 使用手术刀将新鲜组织切成小块（约0.5 cm宽 × 0.5 cm高）。将每块组织分别粘附于活塞上，并用3–5 mL含4%低熔点琼脂糖的PBS包埋。使用标签纸在活塞上标注组织信息。将其置于冰桶中的预冷固定架内，使其凝固。
  2. 打开切片机，将切片厚度设置为 200 µm。在切片机上安装剃刀刀片，并将装有组织的样品托插入切片机的水浴槽中。
  3. 在磷酸盐缓冲液中加入肝素，配制含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS-H），肝素终浓度为100 µg/mL或18.7 U/mL，以保护RNA并为后续可能的原位杂交（ISH）应用提供条件。向切片机浴槽中加入100–120 mL预冷的无菌PBS-H，完全浸没包埋的组织。向浴槽中加入PBS-H冰块，维持温度在0–2 °C。启动切片机，将组织切成200 µm厚的切片。
    注意：必须将组织保持在冰上冷藏，以尽量减少组织内的细胞活性，同时冷藏的组织更易于切片。如果后续不进行原位杂交（ISH），可单独使用PBS。
  4. 或者，对于那些使用切片机难以切片的组织（例如， 肠道和肺组织）使用手术刀或剃须刀片将组织切成尽可能接近200 µm的薄条。
  5. 用实验样本信息标记24孔细胞培养板的盖子，并将组织小室放入对应的孔中。使用画笔将切片转移至置于24孔细胞培养板孔内的组织小室中，该孔内含有1 mL预冷的PBS-H。
    注意：在开始染色前应预先制备可重复使用的组织染色盒。组织染色盒可使用14 mL聚丙烯圆底带盖离心管和金属丝网制作。用锋利的剃刀将14 mL聚丙烯圆底带盖离心管的底部切下。将金属丝网剪成圆形，使其能够贴合管底的开口。用本生灯加热金属丝网圆片至发红变热，迅速将其放置于平面上，并将离心管压入金属丝网中。检查金属丝网是否牢固固定在管底，然后用锋利的剃刀在3 mL刻度处小心切去管子的顶部。每个组织染色盒中可放入最多3张组织切片，或总长度不超过1 cm的组织样本。2 每孔组织量。不同抗体组合的孔之间至少保留一个空孔，以避免交叉污染。
  6. 在将所有切割切片转移至组织腔室后，立即进行主要四聚体和抗体染色。始终保持切片浸没于1 mL PBS-H中并置于低温环境。
  7. 将组织切片与0.5 µg/mL的FITC标记、多肽负载的MHC-I四聚体在含2%正常山羊血清（NGS）的PBS-H中稀释后，4℃孵育过夜。在此孵育步骤中可同时加入针对目标细胞外表位的小鼠或其他非兔源抗体例如， 将大鼠抗CD8抗体用含2% NGS的PBS-H按1:500稀释。每孔加入1 mL稀释后的抗体。
    注意：选择CD8抗体时应谨慎，因为某些抗体可增强MHC四聚体与T细胞受体的结合，而另一些则可能抑制该结合。4,21此处描述的鼠抗人CD8抗体稳定性较差，有时会导致染色信号较弱。本实验采用该抗体进行三重标记，因为它是经测试后唯一能够标记恒河猴CD8 T细胞且非兔源和非小鼠源的CD8抗体。
  8. 每孔使用 1 mL 溶液进行一抗及后续所有孵育步骤，此步骤及后续所有孵育均在 4 °C 条件下进行，并将酶标板置于摇床上。
    注意：组织应悬浮于孵育 chamber 内，自由漂浮。

2. 第2天：固定与二次孵育

  1. 一次孵育后，用1 mL预冷的PBS-H溶液洗涤切片两次，每次20分钟。操作时，将组织腔室转移至另一个24孔细胞培养板中，该培养板的相应孔内已加入1 mL预冷的PBS-H溶液。
    注意：在不同组织腔室之间转移时，务必小心避免将一个实验样本的液体滴入另一个样本中。后续所有孵育和洗涤步骤均应类似地将组织腔室转移至含有适当溶液的新培养板中。操作过程中需密切观察组织腔室中的切片，确保切片未粘附在腔室侧壁上。若发生粘附，应将其轻轻推回溶液中。
  2. 用1 mL新鲜的PBS缓冲的4%多聚甲醛在室温下固定切片2小时（切勿过度固定），然后用冷PBS-H溶液洗涤两次，每次5分钟。
    警示：多聚甲醛具有毒性，请穿戴适当的个人防护装备。
    注意：若需检测细胞内表位，可在多聚甲醛固定后通过煮沸法进行抗原修复和通透处理，具体方法为将切片置于0.01 mol尿素溶液中加热。
  3. 将切片转移至含有0.01 mol尿素的24孔培养板中，并将培养板放入微波炉内。每次加热约10秒，共加热三次，累计30秒。
    注意：操作时需格外小心，因溶液沸腾可能导致切片被弹出孔外。若发生此情况，可用画笔将切片从组织腔室侧壁或培养板盖上轻轻推回至相应腔室底部。
  4. 在进行二抗孵育前，将组织切片置于含有PBS-H、0.3%去垢剂（PBS-H-T）和2%正常山羊血清（NGS）的封闭液中，在4 °C下于摇床上孵育1小时，以实现通透和封闭。后续抗体孵育均使用PBS-H-T/2% NGS溶液进行。
  5. 进行二抗孵育时，将组织腔室中的切片转移至含有兔抗FITC抗体的孔中，抗体用PBS-H-T/2% NGS按1:10,000比例稀释，孵育过夜。
  6. 使用小鼠抗CD20抗体进行复染，抗体用PBS-H-T/2% NGS按1:200比例稀释。若选择此方案，在孵育前需根据上述方法进行表位修复、细胞通透及封闭处理。

3. 第3天：三级培养

  1. 第二次孵育后，在4 °C下用PBS-H洗涤切片三次，每次至少20分钟。
  2. 使用适当的荧光标记抗体进行最终孵育（例如， 山羊抗兔绿色黄荧光抗体、山羊抗大鼠远红荧光染料标记抗体和山羊抗小鼠绿色荧光染料标记抗体，分别按1:5,000、1:5,000和1:2,000比例溶于PBS-H-T/2% NGS中，4℃孵育过夜。
    注意：如有需要，孵育时间可延长至三天。在此孵育步骤及后续操作中，应使用锡箔纸包裹培养板，避免光照，因为光照会淬灭荧光染料。

4. 第4天：切片封片

  1. 用 PBS-H 缓冲液清洗切片至少 20 分钟，重复三次。
    注意：如果计划进行后续的原位杂交（ISH）19，需将切片在 4% 多聚甲醛中固定 1 小时，以确保四聚体和抗体牢固结合，然后用 PBS-H 缓冲液清洗两次，每次 5 分钟。
    注意：多聚甲醛具有毒性，请佩戴适当的个人防护装备。
  2. 使用画笔将切片转移至显微镜载玻片上。操作时注意避免过度触碰组织。在每张切片上滴加含 4 mg/mL 正丙基棓酸盐或其他含荧光保护剂的甘油/明胶封片剂，盖上盖玻片。
  3. 将载玻片置于避光的玻片盒中，于 -20 °C 保存。用酒精清洗组织培养板，并去除盖子上的标签。
    注意：这些培养板可重复使用。

5. 共聚焦显微镜图像的采集

  1. 使用共聚焦显微镜，针对每种荧光染料选择适当的激光器和滤光片，拍摄高分辨率图像（图1A 和 B）。
    注意：本示例中使用了共聚焦显微镜（见材料表）。图像采集参数如下：对于黄绿色标记的抗原特异性T细胞，使用561 nm激光器，功率为20%；对于绿色标记的表达CD20的B细胞，使用488 nm激光器，功率为10%；对于远红标记的CD8 T细胞，使用640 nm激光器，功率为15%。采用20倍物镜，数值孔径为0.8。
  2. 在多个800 × 800像素视野中，以3 µm（或其他间隔）逐层连续采集三个通道的z轴序列图像。将采集的视野图像拼接成全景图（图1C-E）。根据相应切片的信息命名每幅全景图像，并保存用于后续分析。
  3. 使用相应的共聚焦显微镜分析与定量软件，或使用ImageJ进行定量图像分析。

6. 定量图像分析

注意：定量图像分析可使用共聚焦显微镜分析与定量软件完成，也可使用 ImageJ 软件实现。此处以 ImageJ 为例进行说明。

  1. 通过将共聚焦图像拼图拖拽至 ImageJ 窗口中以打开该图像（图 2A）。
    注意：ImageJ 可直接打开由多种不同共聚焦显微镜采集的图像拼图。若 ImageJ 无法直接打开该拼图，请将选定的 z 扫描序列导出为 TIFF 文件后再打开。
  2. 复制选定的 z 扫描图像以进行分析（“"Image"-> "Duplicate"”）（图 2B）。
  3. 拆分不同荧光通道（“"Image"-> "Color"-> "Split Channels"”）（图 2C）。
  4. 在待分析的相应通道中绘制用于定量分析的感兴趣区域（ROI），以确保客观性，并通过按下键盘上的“"T"”键将其添加至 ROI 管理器。测量该区域面积。
    注意：ImageJ 的 ROI 管理器显示的面积单位为 µm2（图 2D）。
  5. 调整待分析通道的荧光亮度与对比度（“"Image"-> "Adjust"-> "Brightness/Contrast"”）（图 2E）。
  6. 将 ROI 叠加至图像上（“"ROI manager"-> "Flatten"”）（图 2F）。
  7. 使用“"Multi-point"”工具对图像中的阳性细胞进行定量（图 2G）。

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结果

图1展示了如何使用共聚焦显微镜采集共聚焦图像。图2展示了使用ImageJ进行定量图像分析的方法。图3和图4展示了来自感染SIV的恒河猴淋巴结组织的代表性图像，组织经MHC四聚体、CD8抗体和CD20抗体染色，用于展示MHC四聚体染色的特异性。图3比较了负载SIV来源肽段的MHC I类分子四聚体与同一组织切片中负载无关肽段的MHC I类分子四聚体的染色结果。图4显示，经MHC/SIV肽段四聚体染色的细胞可与CD8抗体共染色，但不与标记B细胞的CD20抗体共染色。图5展示了一个拼接图像的示例，该图像由多个用于定量分析淋巴结不同解剖区域中具有特定表型的四聚体染色细胞的共聚焦z轴序列图像组合而成。放大区域显示淋巴结中一...

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讨论

IST联合IHC为在包含其他细胞和组织结构的原生环境中检测、鉴定和定量抗原特异性CD8 T细胞提供了重要工具。本文详细描述了IST与IHC联合使用的实验流程，并结合定量图像分析，以确定恒河猴淋巴结中抗原特异性CD8 T细胞的定位、丰度及表型。类似染色方法可应用于人类、小鼠或其他物种的组织，前提是存在相应的MHC-I四聚体。此外，也可采用相对类似的方法，利用肽-MHC II类四聚体或右旋糖酐多聚体（dextramer）染色标记组织中的抗原特异性CD4 T细胞。4,5,6,7,8,9,10,11,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院公共卫生服务基金（T32 DA007097、R01AI096966 和 UM1AI26617）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MHC-I 单体NIH 四聚体核心设施MHC-四聚体制备材料
ExtrAvidin-FITCSigma-AldrichE2716MHC-四聚体制备材料
正常山羊血清Jackson Immunoresearch005-000-121
低熔点琼脂糖PromegaV3121
肝素Sigma-AldrichSLBL6391V
Triton X-100Sigma-AldrichT-6878
尿素J.T.Baker4204-05
甘油明胶Sigma-AldrichSLBH2672V
正丙基没食子酸酯Sigma-AldrichP3130
大鼠抗人CD8抗体（1:500）Acris0714抗体不稳定，使用单次冻存分装
小鼠抗人CD20抗体（1:500）NOVOCASTRA6026819
小鼠抗人Ki67抗体（1:500）Vector6022201
山羊抗小鼠IgG-A488抗体（1:2,000）Jackson Immunoresearch124083
山羊抗兔IgG-Cy3抗体（1:5,000）Jackson Immunoresearch106232
山羊抗大鼠IgG-Cy5抗体（1:5,000）Jackson Immunoresearch118088
山羊抗人IgM-Dylight649抗体（1:5,000）Jackson Immunoresearch86579
切片机：VF-300 微型切片机Precisionary Instruments, LLC1079
快速固化瞬干胶Loctite46551
24孔平底组织培养板Falcon353226
显微镜载玻片Globe Scientific Inc.#1321
剃刀 刀片Ted Pella, Inc121-6
Feather 一次性手术刀FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.No. 21
2号圆头画笔PRINCETON ART & BRUSH CO.4350R可根据需要使用剃刀修剪
共聚焦显微镜OlympusFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0Olympus

参考文献

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