利用类群特异性rDNA引物对水生大型无脊椎动物进行肠道内容物遗传分析的实验室方案

摘要

对大型无脊椎动物肠道内容物的分析大多采用视觉检测方法。这类方法需要研究者具备关于猎物生物形态多样性的深入知识，且无法检测到软体猎物，同时由于猎物被严重破碎，使得某些生物（包括钩虾）的鉴定几乎无法进行。本文提供了针对钩虾食性中大型无脊椎动物猎物鉴定的详细且新颖的遗传学方法。

摘要

分析食物网对于更好地理解生态系统至关重要。例如，外来物种的入侵可能导致食物网相互作用发生严重变化。然而，在许多情况下，准确鉴定野外捕食者与猎物之间的相互关系十分困难。这类分析通常依赖于对肠道内容物的视觉评估或稳定同位素比值（δ¹⁵N 和 δ¹³C）的分析。这些方法需要对各个猎物生物的形态多样性或同位素特征有全面了解，从而在准确鉴定猎物生物时面临障碍。尤其是视觉肠道内容物分析往往会低估软体猎物生物，因为猎物的破碎、摄食和消化过程使得特定物种的鉴定变得困难。因此，基于聚合酶链式反应（PCR）的策略，例如使用类群特异性引物组，为研究食物网相互作用提供了强有力的工具。本文中，我们详细描述了利用核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）的类群特异性引物组来研究野外大型无脊椎动物消费者肠道内容物的实验方案。DNA 可从整只标本（针对小型分类单元）或从野外采集个体的肠道内容物中提取。需使用靶向相应 DNA 亚基的通用引物组，直接从待测个体确认 DNA 模板的存在及其功能效率。我们还证明，通过使用未修饰的类群特异性引物进行 PCR 扩增，并结合后续的单链构象多态性（SSCP）分析（采用聚丙烯酰胺凝胶），可将所摄食猎物进一步鉴定至物种水平。此外，我们展示，使用不同荧光染料作为标记，可通过自动化片段分析对多个肠道内容物样本中的不同猎物类群 DNA 片段进行并行筛查。

引言

捕食者-猎物相互作用构成了大多数营养级相互作用和食物网动态，是表征物质和能量在生态系统内部及之间食物网中流动的关键方面，这也是生态学的主要目标之一¹。确定碳和营养物质的来源及其流动路径，有助于深入理解生态系统之间的生态连通性²。然而，诸如河流及其流域等生态系统，不仅通过有机物和营养物质的通量相互连接，还通过生物体的移动实现连接³。因此，生境改变若中断了连接这些系统的资源流动，就可能强烈影响两个生态系统的食物网结构，这种影响不仅表现为直接效应，还可能通过改变捕食者-猎物群落的组成而产生间接效应。例如，已有研究表明食物网的变化与个别捕食者物种（如，虹鳟）的迁移行为相关⁴。此类变化可能威胁生物多样性以及水生生态系统的正常功能。因此，在野外分析捕食者-猎物相互作用，对于评估人类活动引起的环境变化（如水资源管理措施）对水生生态系统原生生物多样性的影响至关重要。

由于在复杂系统中追踪营养级联关系较为困难，目前已建立多种方法以实现对野外摄食相互作用的评估⁵。传统上，野外摄食关系的研究依赖于对解剖后肠道中猎物残余的视觉鉴定，且需要研究者具备关于猎物形态多样性的广泛知识。视觉肠道内容物分析已为多个消费者类群的资源利用提供了认识（例如....

方案

1. 从野外采集大型无脊椎动物并制备样本用于遗传肠道内容物分析。

1. 在每个采样点采集大型无脊椎动物，将目标消费者物种的个体分拣至单独的离心管中，并立即在液氮或干冰中冷冻，以防止肠道内容物清除及DNA降解。
   注意：避免将样本保存在酒精中，因为某些大型无脊椎动物在酒精将其杀死前容易发生反胃。
2. 仅使用中等大小和大型（约 >3 mm）的大型无脊椎动物物种进行遗传性肠道内容物分析，以便将标本的剩余部分用于其他实验步骤（例如， 稳定同位素分析）。需要注意的是，在研究水螨等非常小的分类单元时，此步骤不适用，因此可跳过步骤1.2.1和1.2.2。
   1. 轻微解冻个体，在体视显微镜下使用精细不锈钢镊子小心解剖其胃肠道。注意避免刺穿胃肠道，以防内容物丢失。
   2. 每次消化道样本制备后，使用去污溶液清洁镊子以去除DNA和RNA污染。将镊子在去污溶液中孵育10分钟，随后用无菌水冲洗以去除残留物，并用无尘纸巾擦拭。
   3. 将解剖得到的胃肠道组织转移至含有 440 µL (450 µL 可使用多通道移液器）盐提取缓冲液（SEB；0.4 M 氯化钠（NaCl）、10 mM 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）pH 8.0 和 2 mM 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）pH 8.0）。将制备好的样品保存于 −20 °C 立即保存，直至进行DNA提取。确保在几天内完成DNA提取。

结果

我们已成功将本方案中所述步骤应用于不同研究的饮食分析。在本节中，我们将举例说明该方案各个部分的适用性。

例如，为了展示作者建立的组特异性引物组的有效性²⁸ 以及通过SSCP分析对PCR产物进行进一步下游分析的潜力，开展了一项摄食实验。个体 Dikerogammarus villosus 作为捕食者和 Caenis 以莱茵河及卡尔斯鲁厄（德国）附近回水区采集的spp.幼虫作为猎物。在实验室中，捕食者与猎物分类群分别饲养于过滤的溪水水体中，温度为 20 °C 并饥饿处理36小时。实验时，将每只端足类动物标本单独置于含有100 mL过滤溪水的烧杯中，喂食两到三条 Caenis 幼虫处理30分钟，随后在液氮中冷冻。每条幼虫的胃肠道 D. villosus 解剖后，按照方案1所述方法提取DNA。使用适用于检测的Caep28S引物组对DNA提取物.......

讨论

本文介绍一种基于PCR的简便且经济高效的方法，通过针对rDNA区域的类群特异性引物，从野外样本中确定捕食者-猎物关系，该方法还可与同一样本的其他非分子分析相结合。然而，该实验方案中存在若干关键步骤。首先，必须确保所用引物的特异性。其次，在胃肠道样本制备及后续DNA提取过程中，必须避免污染和消化道内容物的损失。样本间的交叉污染可能导致猎物DNA的假阳性检测，而消化道内容物的丢失则可能导致稀有摄食猎物物种的漏检。验证目标样本中是否存在相应rDNA亚基以及分析所用模板的功能有效性（方案第2节）对于获取代表性的猎物摄食信息至关重要。特别是当无法检测到消费者本应摄食的猎物类群DNA时，此步骤尤为重要^25,27。此外，在配制PCR反应体系（步骤3.1、5.1.1和5.1.2）时，所用反应混合物及程序必须严格符合相应引物针对特定分类群所设定的条件。否则，PCR反应中DNA扩增可能完全失败，或非目标分类群的DNA也可能被非特异性扩增。因此，每次PCR运行中必须设置阳性对照和阴性对照，以确认PCR反应的有效性并排除污染。同时，必须准确记录.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
液氮	任意	NA	用于将大型无脊椎动物野外样本运输至实验室。
1.5 ml 反应管 - Safelock	任意	NA	用于在野外采集消费者样本，并随后在液氮中保存；反应管不必须为PCR级洁净。为避免管体爆裂，应使用针头在管盖上穿刺小孔。
体视显微镜	任意	NA	确保放大倍数适合解剖目标消费者个体的胃肠道。
培养皿	任意	NA	用于在体视显微镜下解剖消费者样本的胃肠道。
不锈钢镊子：Dumont 镊子 No. 7	Bioform	B40d	这种弯曲的不锈钢镊子有时非常有助于将样本固定在弯曲部分之间，而不刺穿其胃肠道。
不锈钢镊子：Dumont 电子镊子 No. 5	Bioform	B40b	这种精细的不锈钢镊子非常适合用于消费者样本胃肠道的制备。
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	用于去除DNA和RNA污染的去污溶液。
无绒纸巾	任意	NA
实验室天平	任意	NA	精度至少需达到0.01 g。
微量移液器（0.5–10/10–100/50–200/100–1000 μL）	任意	NA
Safe-Lock 管 2.0 ml	VWR	211-2165	这些反应管必须无DNA、DNase、RNase及PCR抑制剂（即PCR级洁净）！
Safe-Lock 管 1.5 ml	VWR	211-2164	这些反应管必须无DNA、DNase、RNase及PCR抑制剂（即PCR级洁净）！
氯化钠 ≥99.5%，分析纯，ACS，ISO	carlroth	3957.3	用于配制盐提取缓冲液（SEB）和DNA提取所需的5M NaCl溶液。
三（羟甲基）氨基甲烷 Tris	carlroth	4855.2	用于配制盐提取缓冲液（SEB）和TBE缓冲液。
微量移液器（0.5–10/10–100/50–200/100–1000 μL）	carlroth	8043.1	用于配制盐提取缓冲液（SEB）和TBE缓冲液。
硼酸 ≥99.8%，分析纯，ACS，ISO	carlroth	6943.2	用于配制TBE缓冲液。若使用市售TBE缓冲液，则无需此试剂。
十二烷基硫酸钠（SDS）	carlroth	4360.1	用于DNA提取。
蛋白酶K 冻干粉	carlroth	7528.1	配制含10 mg/ml的使用液。
TissueLyser II	Quiagen	85300	珠磨式均质仪，用于样本均质化。
不锈钢珠，5 mm	Quiagen	69989	用于样本均质化。
加热振荡金属浴	任意	NA
涡旋混合器	任意	NA
冷冻离心机：himac CT 15 RE	Hitachi	NA	在DNA提取过程中（方案1）用于离心。
异丙醇	carlroth	6752.5
乙醇 99.8%，分析纯	任意	NA
分子生物学级水（ddH2O）	AppliChem	A7398,1000	无核酸酶（经蒸馏灭菌并用DEPC处理）的水，用于DNA重悬，以及文中所有提及ddH2O之处
未修饰的寡核苷酸	Eurofins MWG Operon	NA	未标记引物
修饰的寡核苷酸	Metabion International AG	NA	标记引物
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	用于PCR反应体系（含反应缓冲液Y和S、dNTPs及MgCl₂）。
Primus 96 advanced gradient 热循环仪 或 peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	引物组最初在Primus 96 advanced gradient热循环仪上建立。由于该仪器较旧，我们随后检测了在相同条件下使用peqStar96x（可模拟旧型号）时引物组的效率和特异性。但测试结果表明，我们的引物在不使用旧机型模拟的情况下仍具有良好扩增效果和特异性（参见Koester等，2013）。
标准96孔PCR板	VWR Peqlab	732-2879	用于PCR反应。
低轮廓0.15 ml管条及平盖条	VWR Peqlab	732-3223	用于封闭PCR板。
琼脂糖	Peqlab	35-1020	用于凝胶电泳。
微波炉	任意	NA
锥形瓶	任意	NA
量筒	任意	NA
水平电泳装置及相应带齿梳子	任意	NA	用于琼脂糖凝胶电泳。
电泳电源 PS3002	Life Technologies	NA
溴化乙锭溶液 1%	carlroth	2218.1	用于配制琼脂糖凝胶染色浴。
甲酰胺	carlroth	6749.1	用于SSCP分析的变性缓冲液。
溴酚蓝	AppliChem	A3640.0010	用于琼脂糖凝胶电泳的上样染料。
蔗糖	carlroth	4621.1	用于琼脂糖凝胶电泳的上样染料。
100 bp-DNA Ladder 扩展型	carlroth	T835.1	作为琼脂糖凝胶电泳的大小标准。
紫外成像系统	任意	NA	用于观察凝胶电泳结果。
Rotiphorese NF-丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 40%（29:1）	carlroth	A121.1	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
过硫酸铵	carlroth	9592.2	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
折叠夹（32 mm）	任意	NA	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
方形塑料盒（21 × 6.5 × 5 cm）	任意	NA	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
四甲基乙二胺（TEMED）	carlroth	23.67.1	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
烧杯	任意	NA
RC 10 数字制冷器	VWR	462-0138	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
垂直电泳装置 P10DS（OWL Separation Systems）	VWR	700-2361	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
带槽玻璃板	VWR	730-0261	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
空白玻璃板	VWR	730-0260	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
间隔片	VWR	730-0262	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
25齿梳子	VWR	730-0294	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
摇床平台	任意	NA	用于染色浴的持续振荡。
GelStar 核酸染料（Lonza Rockland, Inc.）	Biozym	850535 (50535)	用于聚丙烯酰胺凝胶染色。
GenomeLab DNA 大小标准试剂盒 400bp	AB Sciex	608098	用于自动化片段分析。Batch B的大小标准。
GenomeLab DNA 大小标准试剂盒 600bp	AB Sciex	608095	用于自动化片段分析。Batch A的大小标准。
上样溶液（SLS）	AB Sciex	608082	用于自动化片段分析。
测序板 - 96孔聚丙烯PCR微孔板	Costar	6551	用于自动化片段分析。
板式离心机，PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	小型板式离心机，用于离心PCR产物。
缓冲板 - 96孔EIA/RIA透明平底未处理聚苯乙烯微孔板	Corning	9017	用于自动化片段分析。
GenomeLab 分离缓冲液	AB Sciex	608012	用于自动化片段分析。
分离胶 - LPAI	AB Sciex	608010	用于自动化片段分析。
测序仪 - CEQ8000 遗传分析系统	Beckman Coulter	NA	用于自动化片段分析。
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	用于分析自动化片段分析结果。