利用类群特异性rDNA引物对水生大型无脊椎动物进行肠道内容物遗传分析的实验室方案

摘要

对大型无脊椎动物肠道内容物的分析大多采用视觉检测方法。这类方法需要研究者具备关于猎物生物形态多样性的深入知识，且无法检测到软体猎物，同时由于猎物被严重破碎，使得某些生物（包括钩虾）的鉴定几乎无法进行。本文提供了针对钩虾食性中大型无脊椎动物猎物鉴定的详细且新颖的遗传学方法。

摘要

分析食物网对于更好地理解生态系统至关重要。例如，外来物种的入侵可能导致食物网相互作用发生严重变化。然而，在许多情况下，准确鉴定野外捕食者与猎物之间的相互关系十分困难。这类分析通常依赖于对肠道内容物的视觉评估或稳定同位素比值（δ¹⁵N 和 δ¹³C）的分析。这些方法需要对各个猎物生物的形态多样性或同位素特征有全面了解，从而在准确鉴定猎物生物时面临障碍。尤其是视觉肠道内容物分析往往会低估软体猎物生物，因为猎物的破碎、摄食和消化过程使得特定物种的鉴定变得困难。因此，基于聚合酶链式反应（PCR）的策略，例如使用类群特异性引物组，为研究食物网相互作用提供了强有力的工具。本文中，我们详细描述了利用核糖体脱氧核糖核酸（rDNA）的类群特异性引物组来研究野外大型无脊椎动物消费者肠道内容物的实验方案。DNA 可从整只标本（针对小型分类单元）或从野外采集个体的肠道内容物中提取。需使用靶向相应 DNA 亚基的通用引物组，直接从待测个体确认 DNA 模板的存在及其功能效率。我们还证明，通过使用未修饰的类群特异性引物进行 PCR 扩增，并结合后续的单链构象多态性（SSCP）分析（采用聚丙烯酰胺凝胶），可将所摄食猎物进一步鉴定至物种水平。此外，我们展示，使用不同荧光染料作为标记，可通过自动化片段分析对多个肠道内容物样本中的不同猎物类群 DNA 片段进行并行筛查。

引言

捕食者-猎物相互作用构成了大多数营养级相互作用和食物网动态，是表征物质和能量在生态系统内部及之间食物网中流动的关键方面，这也是生态学的主要目标之一¹。确定碳和营养物质的来源及其流动路径，有助于深入理解生态系统之间的生态连通性²。然而，诸如河流及其流域等生态系统，不仅通过有机物和营养物质的通量相互连接，还通过生物体的移动实现连接³。因此，生境改变若中断了连接这些系统的资源流动，就可能强烈影响两个生态系统的食物网结构，这种影响不仅表现为直接效应，还可能通过改变捕食者-猎物群落的组成而产生间接效应。例如，已有研究表明食物网的变化与个别捕食者物种（如，虹鳟）的迁移行为相关⁴。此类变化可能威胁生物多样性以及水生生态系统的正常功能。因此，在野外分析捕食者-猎物相互作用，对于评估人类活动引起的环境变化（如水资源管理措施）对水生生态系统原生生物多样性的影响至关重要。

由于在复杂系统中追踪营养级联关系较为困难，目前已建立多种方法以实现对野外摄食相互作用的评估⁵。传统上，野外摄食关系的研究依赖于对解剖后肠道中猎物残余的视觉鉴定，且需要研究者具备关于猎物形态多样性的广泛知识。视觉肠道内容物分析已为多个消费者类群的资源利用提供了认识（例如，龙虾⁶以及鱼类^7,8的食性季节性变化，或桡足类的摄食偏好）。然而，消化的物理过程使得视觉肠道内容物分析变得困难，并通常会遗漏软体猎物生物⁹。对于通过液体摄食的物种，或某些在摄食前会将食物充分粉碎的无脊椎动物消费者（如端足类），其肠道内容物中的猎物种类无法通过视觉鉴定¹⁰。由于这些局限性，分子分析提供了一种有前景的替代方法。

分子分析现已成为一种常用工具，可实现对肠道内容物中猎物的快速且精确的检测。此类技术的种类多样：基于单克隆抗体或聚合酶链式反应（PCR）的策略因其高特异性和高灵敏度而被广泛使用¹¹。然而，新型单克隆抗体的开发耗时且成本高昂，因此在缺乏现成抗体的情况下，应用其他分子技术更具优势¹¹。另一种常见方法是利用通用引物组扩增大多数物种中都存在的脱氧核糖核酸（DNA）区域，例如核糖体核糖核酸（RNA）基因^12,13。使用该技术时，通常难以在混合来源的DNA中识别出全部范围的猎物生物¹⁴。为有效避免这一局限，可采用针对特定类群的特异性引物组进行遗传性肠道内容物分析。这类特异性引物被设计为仅扩增特定目标类群的DNA区域，同时排除所有其他物种^15,16，从而能够在指定类群的分类学水平上识别猎物生物，而无需耗时且昂贵的二次分析。然而，与所有肠道内容物分析一样，此类分析仅能提供摄食行为的瞬时快照。因此，将分子肠道内容物分析与时间整合型天然示踪剂（例如，稳定同位素）分析相结合被认为更具优势^1,2。

本文介绍了一种基于PCR的详细方法，用于研究捕食者-猎物相互作用，该方法采用针对核糖体DNA（rDNA）区域的类群特异性引物组，并可与同一样本的稳定同位素分析相结合。我们描述了通过琼脂糖凝胶电泳检测单一猎物类群DNA的方法。此外，当需要比引物特异性更高的分类学分辨率时，本文还提供了一种对这类类群特异性引物扩增的PCR产物进行后续下游分析的可行方案。由于单链DNA（ssDNA）片段会形成由其一级序列决定的三级构象¹⁷，因此此类类群特异性引物扩增出的片段即使存在微小变异，也会导致构象变化。这种变化可通过聚丙烯酰胺凝胶的单链构象多态性（SSCP）分析检测到^17,18，从而实现对猎物生物更精确的鉴定（可达到物种水平）。

尽管琼脂糖凝胶电泳是一种常见且经济的用于观察DNA片段并确定其大致长度的工具¹⁹，但其分辨率取决于DNA的量以及所使用的染色染料²⁰。通常，在处理纯DNA样品时，可视化过程较为直接；然而，消费者消化道内容物中可能存在的猎物DNA含量较低，这会使琼脂糖凝胶电泳结果的判读变得复杂。尽管如此，该检测方法仍适用于对来自野外的少量消费者样本进行一种或少数几种猎物类群的筛查；但由于判读上的困难，若需对大量样本进行多种猎物分类单元的筛查，则会极为耗时，因而不具可行性。一种更为灵敏的检测方法是通过毛细管电泳进行片段的自动化分析，该方法还可进一步精确测定片段的实际长度²¹。已有多个基于微卫星的研究表明，通过使用不同的荧光染料作为标记，可在自动化片段分析中检测并区分长度相近的不同片段^22,23,24。因此，本文还提供了一项详细的实验方案，介绍如何利用带有荧光标记的类群特异性引物组进行PCR扩增，并通过自动测序仪进行自动化片段分析，从而实现对多个猎物类群DNA的并行检测。此外，我们还展示了一项案例研究的结果，证明通过自动化片段分析检测猎物DNA的方法同样能够实现对摄食猎物的相对定量。

方案

1. 从野外采集大型无脊椎动物并制备样本以进行遗传性肠道内容物分析。

1. 在每个采样点采集大型无脊椎动物，将目标消费者物种的个体分拣至单独的离心管中，并立即用液氮或干冰速冻，以防止肠道内容物排空及DNA降解。
   注意：避免将样本保存在酒精中，因为某些大型无脊椎动物在酒精致死前容易发生反刍。
2. 仅使用中等和大型（约 >3 mm）大型无脊椎动物物种的胃肠道组织进行遗传学肠道内容物分析，以便保留标本其余部分用于其他实验程序（例如，稳定同位素分析）。注意，此步骤不适用于研究水螨等体型极小的类群，因此可跳过步骤1.2.1和1.2.2。
   1. 将个体略微解冻，并在体视显微镜下使用精细的不锈钢镊子小心解剖其胃肠道组织。操作时确保不刺破胃肠道，以防内容物丢失。
   2. 每次完成胃肠道组织制备后，使用去污染溶液清洗镊子，以去除DNA和RNA污染。具体操作为：将镊子在去污染溶液中孵育10分钟，随后用无菌水冲洗以去除残留物，并用无绒纸巾擦干。
   3. 将解剖得到的胃肠道组织转移至含有440 µL（若使用多通道移液器可为450 µL）盐提取缓冲液[SEB；0.4 M 氯化钠（NaCl）、10 mM 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）pH 8.0，以及2 mM 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）pH 8.0]的2.0 mL防漏反应管中。立即将制备好的样本储存于−20 °C，直至进行DNA提取。确保在数日内完成DNA提取。
3. 采用改良的高盐提取法²⁵进行DNA提取。
   1. 从冰箱中取出样本。使用镊子向每个样本管中加入一颗5 mm的不锈钢珠，将冷冻样本置于室温（RT）下自然解冻。使用珠磨机以15 Hz频率均质化样本1分钟。
   2. 短暂离心使样本沉降至管底。使用微量移液器加入90 µL（若使用多通道移液器可为100 µL）10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液和5 µL 10 mg/mL蛋白酶K。
   3. 充分涡旋混匀样本，并在恒温混匀仪中于60 °C孵育1小时，同时以400 rpm持续振荡。每隔10分钟再次充分涡旋一次，以促进细胞裂解。
   4. 短暂离心后，使用微量移液器加入350 µL 5 M NaCl溶液，充分涡旋约0.5–1分钟。随后在5 °C条件下以16,200 × g离心40分钟。
      注意：若需连续处理多批样本，应适当提高离心机温度设定（不超过10 °C），因为温度过低可能导致SDS絮凝。
   5. 使用微量移液器将约600 µL上清液转移至新的1.5 mL反应管中。操作时注意避免触及沉淀物。
   6. 将不锈钢珠从反应管中倾倒至不锈钢滤网中，用流动水清洗后，放入培养皿中用去污染溶液孵育10分钟。随后用无菌水彻底冲洗干净，并将清洁后的钢珠储存于乙醇（>99%，分析纯级）中或干燥保存，以备重复使用。
      注意：钢珠的清洗不必在此步骤立即完成，可在后续步骤中的等待时间内进行。
   7. 使用微量移液器向上述上清液中加入600 µL冰冻异丙醇（分析纯级），轻轻翻转离心管数次混匀。将样本在−20 °C过夜保存。
   8. 从冰箱中取出样本，在室温下以16,200 × g离心20分钟。小心弃去上清液，并用无绒纸巾小心吸干管壁。注意：若环境温度较高（超过25 °C），建议在5 °C条件下离心，以防弃上清时沉淀滑脱。
   9. 用70%乙醇洗涤含有DNA的沉淀。具体操作为：加入200 µL冰冻乙醇（70%，分析纯级），在室温（或必要时在5 °C）下以16,200 × g离心10分钟。小心弃去上清液，并用无绒纸巾小心吸干管壁。使用调至约8 µL的10 µL移液器小心吸除残留上清液，注意勿扰动沉淀。
   10. 将沉淀在60 °C或室温下干燥5–20分钟，直至乙醇完全蒸发。
   11. 将沉淀溶解于50–100 µL无核酸酶水（经蒸汽灭菌和DEPC处理的ddH₂O）中，静置至少1小时（若在4 °C过夜孵育效果更佳）。
   12. 按照制造商说明书，使用微量分光光度计测定各样本中的DNA含量。将各样本稀释为工作浓度，使DNA浓度约为2–10 ng/µL。原液保存于冰箱冷冻室，工作液保存于冰箱冷藏室，并确保尽快进行后续样本处理。

2. 验证DNA提取物的功能效率以用于后续检测近期摄食的猎物。

1. 为确保模板的存在及其功能效率，使用适用于相应食物来源的通用引物组对每份DNA提取物（步骤1.1至1.3.11）进行检测例如， 无脊椎动物^16,26）这些引物靶向与用于后续猎物检测的特异性引物相同的核亚基^25,27以下步骤涉及通用引物组 NSF1419/20 和 NSR1642/16 的使用。¹⁶ 以及 LSU D1,D2 fw1 与 LSU D1,D2 rev2 或 LSU D1,D2 rev4²⁶为证明PCR反应成功且未发生污染，应使用一个含有已成功扩增的DNA的阳性对照，以及一个含有ddH₂O的阴性对照。₂O 而非 DNA 进行每轮 PCR 扩增。
   1. 为制备含有引物终浓度为 10 µM 的引物工作液，用移液器吸取适量的相应引物原液和 ddH₂O₂O（根据母液浓度而定）使用微量移液器加入新的1.5 mL离心管中。
   2. 加入引物、脱氧核苷酸混合物（dNTPs）、反应缓冲液、Taq DNA聚合酶和ddH₂O₂在1.5或2.0 mL（根据待处理样本数量而定）离心管中，然后涡旋混匀该混合物。10 µL PCR反应的标准反应体系详细体积如下所示 表1 （有关所用化学品的详细信息，请参见 材料表).
   3. 使用微量移液器将每1 µL DNA提取物转移至PCR管（或PCR板的孔）中含9 µL标准反应混合液的体系内。封闭反应管或反应板孔（使用管盖条）。
   4. 设定热循环仪程序：NSF1419/20 和 NSR1642/16 的标准方案¹⁶ 引物组的程序为：94 °C 变性 4 分钟，随后进行 30 个循环，每个循环为 94 °C 30 秒、50 °C（退火温度）30 秒、72 °C 90 秒，最后在 72 °C 延伸 10 分钟。针对 LSU 引物组²⁶，采用以下程序：94 °C 预变性 4 分钟，随后进行 45 个循环，每个循环为 94 °C 变性 20 秒、52.5 °C 退火 20 秒、72 °C 延伸 90 秒，最后在 72 °C 下终延伸 8 分钟。
   5. 将PCR管或PCR板放入热循环仪中，盖上循环仪盖子，启动相应的程序。
   6. 使用含有Tris碱、硼酸和EDTA（TBE缓冲液）的缓冲溶液和琼脂糖制备1.5%琼脂糖凝胶。制备1.5%琼脂糖凝胶时，采用尺寸为10 cm × 7.5 cm × 3 cm的凝胶制备模具，称取0.45 g琼脂糖加入锥形瓶中，用量筒量取30 mL 1×TBE缓冲液（89 mM Tris，pH 7.6，89 mM硼酸和2 mM EDTA，pH 8.0）倒入锥形瓶中。将混合物放入微波炉中加热。当出现大量气泡时暂停微波加热，小心旋转锥形瓶，直至溶液变为均一单相。
   7. 将烧瓶置于水浴中轻轻摇动，使溶液冷却至约 60 °C。迅速将溶液倒入凝胶制备板中，除去气泡并插入梳子。静置约 20 分钟，直至凝胶完全凝固。
   8. 将电泳装置中加入0.5x TBE缓冲液，并放入含有琼脂糖凝胶的制胶托盘。确保凝胶孔内无气泡。
   9. 使用小型（板式）离心机的短时离心模式离心PCR产物。用微量移液器将每3 µL PCR产物与1 µL 6x上样缓冲液（40%蔗糖和0.25%溴酚蓝）混匀，然后上样至琼脂糖凝胶的加样孔中。用微量移液器向每行的一个加样孔中加入1.5 µL 100 bp DNA Marker作为分子量标准。正确盖上电泳槽盖，并将电极导线连接至电源。以100 V/cm电压电泳35分钟。
   10. 准备染色液时，将1,000 mL的1×TBE缓冲液倒入一个避光的方形塑料盒中。用微量移液器加入50 µL溴化乙锭，盖紧塑料盒盖子并轻轻摇晃，以确保溴化乙锭均匀分布。
   11. 将凝胶从电泳仪中取出，放入染色缸中染色约10分钟。然后将凝胶从染色缸中取出，置于凝胶成像系统中，按照说明书进行成像观察。
   12. 仅分析在琼脂糖凝胶中显示阳性结果（可见适当大小片段）的样品，以检测近期摄食猎物的存在及其功能效率。

PCR混合液	工作液浓度	10 µl PCR反应体系配制量	PCR中终浓度
正向引物（Primer FW）	10 µM	0.5 μl	0.5 µM
反向引物（Primer RW）	10 µM	0.5 μl	0.5 µM
反应缓冲液（终浓度为20 mM Tris-HCl, pH 8.55, 16 mM (NH4)2SO4 和 2 mM MgCl2）	1 µM	1 μl	1 µM
dNTP	10 mM	0.25 μl	0.25 mM
Taq DNA聚合酶（Taq polymerase）	5 U	0.1 μl	0.05 U
ddH20		6.65 μl
反应混合物体积总计		9 μl
DNA模板		1 μl

表1：配制10 µL PCR反应体系标准反应混合液的详细方案。

3. 使用凝胶电泳和特异性引物组检测近期摄食的猎物/食物成分。

1. 使用DNA提取物的工作溶液（按步骤1.1至1.3.11制备）和特异性引物组（未标记， 即， 无需修改）适用于目标猎物类群，具体操作如步骤2.1.1至2.1.3所述（针对不同引物组的反应体系变化，参见表2）。使用步骤2.1.4中提供的标准程序进行PCR扩增（各引物组的退火温度参见表2）。
   1. 每次PCR运行中，使用来自相应目标群体样本的纯DNA作为阳性对照，以及使用来自消费者物种的纯DNA作为阴性对照。
2. 使用步骤 2.1.6 至 2.1.11 中描述的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 反应结果。若观察到适当长度的条带（参见 表 2阳性对照可见，而阴性对照不可见。若上述任一或两个条件未满足，则需重复 PCR。
3. 使用琼脂糖凝胶电泳（如步骤2.1.6至2.1.11所述），检测不同被测消费者个体是否摄食了猎物组（通过判断是否可见适当长度的条带）。务必注意不要遗漏视觉分辨率较低的条带。
4. 若在24小时内进行后续分析，将PCR产物保存在4 °C；若稍后进行分析，则保存在-20 °C。

4. 随后通过聚丙烯酰胺凝胶的单链构象多态性分析进一步确定下游被摄食的猎物。

1. 制备用于SSCP电泳的9%丙烯酰胺凝胶。在实验室通风橱中配制工作液。
   1. 为配制200 mL丙烯酰胺工作液，用量筒量取20 mL 10x TBE（将109 g Tris碱、55 g硼酸和40 mL 0.50 M EDTA，pH 8.0，溶于1000 mL去离子H₂O中）溶液，另取一量筒量取45 mL 40%（29:1）丙烯酰胺混合液。将TBE和丙烯酰胺混合液倒入容量瓶中（也可使用带200 mL刻度线的刻度玻璃瓶），再加入去离子H₂O至200 mL刻度线。将工作液保存于冰箱（4 °C）中，待用时取出。工作液使用不得超过一周。
   2. 称取0.1 g过硫酸铵（APS；使用精度至少为0.01 g的天平）至1 mL容量瓶中，加去离子H₂O至刻度线，溶解后配制成10% APS储备液。将储备液分装成若干等份（每份约350 µL）至新的反应管中。
      注：每块聚丙烯酰胺凝胶需使用一份APS溶液。剩余分装液应储存于-20 °C，仅在使用前短暂解冻。
   3. 组装凝胶夹心装置，包括两块玻璃板（一块为平整玻璃板，另一块为带缺口的玻璃板，尺寸均为20 cm × 20 cm），两板之间在两侧插入1.5 mm厚的垫片。在左右两侧各使用三个回折夹（32 mm）固定凝胶夹心装置（图1）。
   4. 在锥形瓶中加入5 g琼脂糖和250 mL 1x TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶溶液。按照步骤2.1.6和2.1.7所述方法加热并冷却混合液。迅速将溶液倒入方形塑料盒（21 cm × 6.5 cm × 5 cm）中，并将凝胶夹心装置（步骤4.1.3）的底端插入琼脂糖溶液中。调整凝胶夹心装置底端的回折夹高度，使其恰好置于方形塑料盒边缘上（图1）。静置约20–30分钟，直至琼脂糖塞完全凝固。
   5. 用量筒量取60 mL丙烯酰胺工作液（步骤4.1.1），倒入烧杯中。使用微量移液器加入300 µL一份APS储备液（步骤4.1.2），随后加入37.5 µL四甲基乙二胺（TEMED）。迅速将混合液注入凝胶夹心装置的两块玻璃板之间。也可使用100 mL一次性注射器（前端连接1,000 µL移液器吸头）将溶液注入玻璃板之间。
   6. 在玻璃板上端小心插入一把1.5 mm厚的标准梳子，确保梳子完全浸没于聚丙烯酰胺溶液中。静置约1小时，直至聚丙烯酰胺凝胶完全聚合。聚合过程中应尽量避免通风，以免延长凝胶聚合所需时间。
      注：灌制完成的凝胶可在密封塑料袋中加入湿润纸巾后，于冰箱中保存最多3天。

图1：展示聚丙烯酰胺凝胶制备过程的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 将已制备好的聚丙烯酰胺凝胶置于凝胶盒中，放入垂直电泳装置内。根据电泳装置的类型，加入适量的 0.5× TBE 缓冲液，并使用制冷循环器将装置冷却至 10 °C。
3. 进行 DNA 变性时，将热块仪或 PCR 仪预热至 96 °C。配制变性缓冲液：含 95% 甲酰胺（分析纯，99.5%）和 5% 的水溶液，其中水溶液含有 0.25% 溴酚蓝和 40%（w/v）蔗糖。
4. 从冰箱或冷冻柜中取出 PCR 产物并解冻。使用小型离心机（或板式离心机）的短时离心程序离心 PCR 产物。然后，将每 4 µL PCR 产物与 4 µL 变性缓冲液混合。在 96 °C 加热 5 分钟，随后立即置于冰水中冷却 10 分钟。
   注意：此步骤完成后应立即进行聚丙烯酰胺凝胶上样（步骤 4.5）。
5. 从聚丙烯酰胺凝胶（步骤 4.1.6）中取出梳子，使用移液器将每个样品完全加载至凝胶加样孔中。以每块凝胶 8 W 的功率进行电泳，同时持续冷却电泳装置至 10 °C。所需电泳时间取决于待分离片段的大小。对于约 210 bp 的片段，电泳时间约为 3.5 小时较为合适。
6. 配制染色液时，将 1,000 mL 的 1× TBE 缓冲液倒入一个避光的方形塑料盒中，使用微量移液器加入 30 µL 染色染料（适用于单链 DNA 染色）。盖上盖子并轻轻摇晃，确保染料均匀分布。
7. 从电泳槽中取出凝胶盒，小心地将带凹槽的玻璃板与凝胶分离。将聚丙烯酰胺凝胶从空白玻璃板上滑入染色液中。将染色盒置于摇床上，持续摇动染色 20 至 30 分钟。
8. 小心地将凝胶从染色液中取出，放置于成像系统的紫外透射台上。
   注意：由于凝胶较为脆弱，建议由两人协作完成此步骤。一人将染色盒置于紫外台旁，另一人用双手从下方托住凝胶，将其取出并平稳滑至紫外台上。
9. 关闭成像系统的盖子或门，按照制造商的操作手册进行拍照。

5. 使用自动化片段分析并行检测多种近期摄食的猎物类群。

1. 使用表2中列出的16组特异性引物对肠道内容物DNA提取物进行分析，每组引物中的一条因标记有染色染料而被修饰（见表2中“修饰”一栏），并采用自动化测序仪进行并行检测。
   1. 使用DNA提取物的工作溶液（按照步骤1.1至1.3.11制备），针对每组引物分别进行独立的PCR扩增，操作方法如步骤2.1.1至2..1.5所述（反应体系中的变化见表2）。每次PCR运行中，至少设置一个含有属于相应目标类群的标本纯DNA的阳性对照，以及一个含有消费者物种纯DNA的阴性对照。
   2. 在热循环仪中运行PCR，采用步骤2.1.4中所述的标准PCR程序，并根据表2中各引物组对应的退火温度（及循环次数）进行调整。
      注意：对全部16组不同引物的PCR反应，应使用相同的反应孔DNA排布方式，以便于后续将PCR产物合并用于批量自动化片段分析。
   3. 将PCR产物储存于-20 °C，直至属于同一批次自动化片段分析的所有PCR反应（见表2）完成。PCR产物需避光保存，且在片段分析前存放时间不得超过1周。

表2： Koester et al. (2013) 建立的两组共15对类群特异性引物，以及新设计的Jae28S引物对，用于扩增16种目标水生大型无脊椎动物类群的18S或28S rDNA区域。f，正向引物；r，反向引物；18S，引物靶向18S rDNA亚基；28S，引物靶向28S rDNA亚基。“Hydrobiologia, Dikerogammarus villosus（甲壳纲，钩虾科）是莱茵河流域的‘杀手虾’吗？，768，2016，表S1，补充材料第2页，Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René，(© Springer International Publishing Switzerland 2015)” 经Springer授权使用。请点击此处查看本表的放大版本。

2. 为检测全部16对引物扩增的片段，请按照表2中给出的两批次进行自动化片段分析。使用内部大小标准（DNA大小标准试剂盒-400 [批次B] 和 -600 [批次A]，分别对应）以确定片段长度。按照以下步骤准备测序板和自动测序仪。请注意，如果使用的平台与材料表中列出的不同，该程序可能需要相应调整。
   1. 为运行每批样品，准备含有样品上样溶液（SLS）和相应大小标准的混合液。每份批次A的样品加入21.6 µL SLS和0.4 µL DNA Size Standard Kit - 600；每份批次B的样品则分别加入21.7 µL SLS和0.3 µL DNA Size Standard Kit - 400。
   2. 从冰箱中取出属于相应批次的8个PCR产物并解冻。确保操作过程中仍保持避光。
   3. 使用微量移液器将步骤5.2.1中所述的相应混合液各22 µL加入测序板中所需数量的孔中（即待分析样品的数量）。使用小型（板式）离心机的短时离心模式对这8个PCR产物进行离心。再用微量移液器将每个PCR产物各1 µL转移至测序板相应的孔中。
   4. 在测序板中轻轻使用小型板式离心机短时离心以沉降混合液，并在每个使用的孔上覆盖一滴矿物油。在缓冲液板的相应反应孔中加入250–300 µL DNA分离缓冲液。
   5. 使用毛细管测序仪的软件，根据制造商说明创建样品设置（Sample Setup）。为对照样品组分配相应方法，并确定用于数据处理的方法顺序（运行条件参见表3，适用于材料表中指定的大小标准）。请注意，样品在样品设置中的排列必须与测序板中的实际样品排列一致（包括阳性和阴性对照，见步骤5.1.1），并务必选择适用于相应大小标准的片段分析方法。
   6. 在润洗托盘中加入去离子水，然后将测序板、缓冲液板和润洗托盘插入毛细管测序仪。插入含有足量新鲜DNA分离胶的凝胶盒，使用已准备好的样品设置运行测序板。

	变性		分离		毛细管	进样
	温度	时间	电压	时间		电压	时间
片段大小标准品 600	90 °C	120 s	4.8 kV	60 min	50 °C 等待温度：是	2.0 kV	30 s
片段大小标准品 400	90 °C	120 s	6 kV	45 min	50 °C 等待温度：是	2.0 kV	30 s

表3：使用材料表中提供的大小标准，在自动测序仪上进行片段分析的特定条件。

3. 分析结果时，导出原始数据并将这些数据上传至片段分析软件。根据制造商的标准染料颜色顺序设置染料通道。
   1. 根据软件用户手册，在同一批次中针对各特异性引物组扩增的预期片段长度范围创建一个分析面板。
   2. 处理数据时，选择相应的面板、合适的标准片段大小、标准颜色和分析类型，然后运行分析程序。选择电泳图谱选项，以单线轨迹形式显示毛细管电泳仪器检测到的每种染料颜色的荧光信号强度。标记物/引物组将被显示，指示各自对应的片段范围，并自动高亮显示每个被识别峰中心所对应的检测片段的精确长度（在大多数软件中通过颜色或命名标识）。
   3. 对每个样本，计算其内部大小标准与所选标准片段大小的匹配程度，以确认片段大小判读的成功性。大多数片段分析软件均提供自动计算并可视化该匹配度的选项。若片段大小判读失败，应对相关样本重复进行片段分析。
   4. 目视重新检查每个样本的电泳图谱，并针对每个标记物/引物组单独确认或取消确认每个被识别的峰。根据所用软件的用户手册，手动添加符合标记物/引物组标准但未被识别的峰，或删除错误识别的峰。在“等位基因标签”中应用碱基对大小或分组名称。在“峰信息表”中计算并显示各峰的详细参数。

结果

我们已成功将本方案中所述步骤应用于不同研究中的饮食分析。在本节中，我们提供实例以说明本方案各个部分的适用性。

例如，为了展示作者建立的组特异性引物组的有效性²⁸ 以及通过SSCP分析对PCR产物进行进一步下游分析的潜力，开展了一项摄食实验。个体 Dikerogammarus villosus 作为捕食者和 Caenis spp. 幼虫作为猎物采自德国卡尔斯鲁厄附近的莱茵河及河畔回水区。在实验室中，捕食者和猎物分类群分别饲养于过滤的溪水（20 °C）中，并饥饿处理36小时。实验时，将片脚类个体置于含100 mL过滤溪水的烧杯中，每只喂食两至三条 Caenis 幼虫处理30分钟，随后在液氮中冷冻。每条幼虫的胃肠道 D. villosus 解剖后，按照方案1所述方法提取DNA。使用Caep28S引物组对DNA提取物进行检测，该引物组适用于检...

讨论

本文介绍一种基于PCR的简便且经济高效的方法，通过针对rDNA区域的类群特异性引物，从野外样本中确定捕食者-猎物关系，该方法还可与同一样本的其他非分子分析相结合。然而，该实验方案中存在若干关键步骤。首先，必须确保所用引物的特异性。其次，在胃肠道样本制备及后续DNA提取过程中，必须避免污染和消化道内容物的损失。样本间的交叉污染可能导致猎物DNA的假阳性检测，而消化道内容物的丢失则可能导致稀有摄食猎物物种的漏检。验证目标样本中是否存在相应rDNA亚基以及分析所用模板的功能有效性（方案第2节）对于获取代表性的猎物摄食信息至关重要。特别是当无法检测到消费者本应摄食的猎物类群DNA时，此步骤尤为重要^25,27。此外，在配制PCR反应体系（步骤3.1、5.1.1和5.1.2）时，所用反应混合物及程序必须严格符合相应引物针对特定分类群所设定的条件。否则，PCR反应中DNA扩增可能完全失败，或非目标分类群的DNA也可能被非特异性扩增。因此，每次PCR运行中必须设置阳性对照和阴性对照，以确认PCR反应的有效性并排除污染。同时，必须准确记录...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
液氮	任意	NA	用于将大型无脊椎动物野外样本运输至实验室。
1.5 ml 反应管 - Safelock	任意	NA	用于在野外采集消费者样本，并随后在液氮中保存；反应管不必须为PCR级洁净。为避免管体爆裂，应使用针头在管盖上穿刺小孔。
体视显微镜	任意	NA	确保放大倍数适合解剖目标消费者个体的胃肠道。
培养皿	任意	NA	用于在体视显微镜下解剖消费者样本的胃肠道。
不锈钢镊子：Dumont 镊子 No. 7	Bioform	B40d	这种弯曲的不锈钢镊子有时非常有助于将样本固定在弯曲部分之间，而不刺穿其胃肠道。
不锈钢镊子：Dumont 电子镊子 No. 5	Bioform	B40b	这种精细的不锈钢镊子非常适合用于消费者样本胃肠道的制备。
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	用于去除DNA和RNA污染的去污溶液。
无绒纸巾	任意	NA
实验室天平	任意	NA	精度至少需达到0.01 g。
微量移液器（0.5–10/10–100/50–200/100–1000 μL）	任意	NA
Safe-Lock 管 2.0 ml	VWR	211-2165	这些反应管必须无DNA、DNase、RNase及PCR抑制剂（即PCR级洁净）！
Safe-Lock 管 1.5 ml	VWR	211-2164	这些反应管必须无DNA、DNase、RNase及PCR抑制剂（即PCR级洁净）！
氯化钠 ≥99.5%，分析纯，ACS，ISO	carlroth	3957.3	用于配制盐提取缓冲液（SEB）和DNA提取所需的5M NaCl溶液。
三（羟甲基）氨基甲烷 Tris	carlroth	4855.2	用于配制盐提取缓冲液（SEB）和TBE缓冲液。
微量移液器（0.5–10/10–100/50–200/100–1000 μL）	carlroth	8043.1	用于配制盐提取缓冲液（SEB）和TBE缓冲液。
硼酸 ≥99.8%，分析纯，ACS，ISO	carlroth	6943.2	用于配制TBE缓冲液。若使用市售TBE缓冲液，则无需此试剂。
十二烷基硫酸钠（SDS）	carlroth	4360.1	用于DNA提取。
蛋白酶K 冻干粉	carlroth	7528.1	配制含10 mg/ml的使用液。
TissueLyser II	Quiagen	85300	珠磨式均质仪，用于样本均质化。
不锈钢珠，5 mm	Quiagen	69989	用于样本均质化。
加热振荡金属浴	任意	NA
涡旋混合器	任意	NA
冷冻离心机：himac CT 15 RE	Hitachi	NA	在DNA提取过程中（方案1）用于离心。
异丙醇	carlroth	6752.5
乙醇 99.8%，分析纯	任意	NA
分子生物学级水（ddH2O）	AppliChem	A7398,1000	无核酸酶（经蒸馏灭菌并用DEPC处理）的水，用于DNA重悬，以及文中所有提及ddH2O之处
未修饰的寡核苷酸	Eurofins MWG Operon	NA	未标记引物
修饰的寡核苷酸	Metabion International AG	NA	标记引物
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	用于PCR反应体系（含反应缓冲液Y和S、dNTPs及MgCl₂）。
Primus 96 advanced gradient 热循环仪 或 peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	引物组最初在Primus 96 advanced gradient热循环仪上建立。由于该仪器较旧，我们随后检测了在相同条件下使用peqStar96x（可模拟旧型号）时引物组的效率和特异性。但测试结果表明，我们的引物在不使用旧机型模拟的情况下仍具有良好扩增效果和特异性（参见Koester等，2013）。
标准96孔PCR板	VWR Peqlab	732-2879	用于PCR反应。
低轮廓0.15 ml管条及平盖条	VWR Peqlab	732-3223	用于封闭PCR板。
琼脂糖	Peqlab	35-1020	用于凝胶电泳。
微波炉	任意	NA
锥形瓶	任意	NA
量筒	任意	NA
水平电泳装置及相应带齿梳子	任意	NA	用于琼脂糖凝胶电泳。
电泳电源 PS3002	Life Technologies	NA
溴化乙锭溶液 1%	carlroth	2218.1	用于配制琼脂糖凝胶染色浴。
甲酰胺	carlroth	6749.1	用于SSCP分析的变性缓冲液。
溴酚蓝	AppliChem	A3640.0010	用于琼脂糖凝胶电泳的上样染料。
蔗糖	carlroth	4621.1	用于琼脂糖凝胶电泳的上样染料。
100 bp-DNA Ladder 扩展型	carlroth	T835.1	作为琼脂糖凝胶电泳的大小标准。
紫外成像系统	任意	NA	用于观察凝胶电泳结果。
Rotiphorese NF-丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 40%（29:1）	carlroth	A121.1	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
过硫酸铵	carlroth	9592.2	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
折叠夹（32 mm）	任意	NA	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
方形塑料盒（21 × 6.5 × 5 cm）	任意	NA	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
四甲基乙二胺（TEMED）	carlroth	23.67.1	用于配制聚丙烯酰胺凝胶。
烧杯	任意	NA
RC 10 数字制冷器	VWR	462-0138	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
垂直电泳装置 P10DS（OWL Separation Systems）	VWR	700-2361	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
带槽玻璃板	VWR	730-0261	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
空白玻璃板	VWR	730-0260	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
间隔片	VWR	730-0262	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
25齿梳子	VWR	730-0294	用于基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的SSCP分析。
摇床平台	任意	NA	用于染色浴的持续振荡。
GelStar 核酸染料（Lonza Rockland, Inc.）	Biozym	850535 (50535)	用于聚丙烯酰胺凝胶染色。
GenomeLab DNA 大小标准试剂盒 400bp	AB Sciex	608098	用于自动化片段分析。Batch B的大小标准。
GenomeLab DNA 大小标准试剂盒 600bp	AB Sciex	608095	用于自动化片段分析。Batch A的大小标准。
上样溶液（SLS）	AB Sciex	608082	用于自动化片段分析。
测序板 - 96孔聚丙烯PCR微孔板	Costar	6551	用于自动化片段分析。
板式离心机，PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	小型板式离心机，用于离心PCR产物。
缓冲板 - 96孔EIA/RIA透明平底未处理聚苯乙烯微孔板	Corning	9017	用于自动化片段分析。
GenomeLab 分离缓冲液	AB Sciex	608012	用于自动化片段分析。
分离胶 - LPAI	AB Sciex	608010	用于自动化片段分析。
测序仪 - CEQ8000 遗传分析系统	Beckman Coulter	NA	用于自动化片段分析。
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	用于分析自动化片段分析结果。