本文详细介绍了利用碳纤维电极和酶法生物传感器技术进行固定电位安培记录,以在雌性仓鼠自然奖赏行为期间高时间分辨率地测量多巴胺和谷氨酸的释放。
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本文详细介绍了利用碳纤维电极和酶法生物传感器技术进行固定电位安培记录,以在雌性仓鼠自然奖赏行为期间高时间分辨率地测量多巴胺和谷氨酸的释放。
在快速时间尺度上测量神经递质释放的能力,使得神经传递模式能够与特定行为或实验干预相关联,这对于揭示潜在的机制和神经环路具有重要意义。尽管脑内微透析技术已使用数十年,可用于测量几乎任何感兴趣的分析物,但其时间分辨率有限。相比之下,快速扫描循环伏安法具有高时间精度和极高灵敏度;然而,由于该技术操作难度较高,且依赖于目标分析物的电化学活性,因此无法检测非电活性物质(例如,神经递质谷氨酸)。本文详细描述了一种即用型系统,该系统结合了固定电位安培法与酶法生物传感技术,可实现对电活性和非电活性神经递质的高时间精度测量。这两种强大技术的结合,使得张力性和时相性神经传递的测量变得更加简便,并支持多种神经递质的同时记录。本论文旨在展示在雌性仓鼠中,利用自然奖赏行为(即,性行为)在体测量多巴胺和谷氨酸神经传递的过程,最终目标是证明该检测方法在研究其他行为和实验范式中的技术可行性。
在清醒活动的动物体内测量神经递质释放的能力,使研究人员能够将特定行为与神经递质传递在空间和时间上的动态模式联系起来——这是实时研究自然行为和操作性行为背后机制与神经环路的有力工具。传统上,微透析技术被用于测量脑内细胞外环境中具有电化学活性和非活性的物质1。该技术通过微透析探针,以持续流动的方式灌注一种离子组成与细胞外液相似的水溶液,探针由一根细小的套管构成,其尖端为一段半透性的中空纤维膜2。探针植入脑内后,感兴趣的神经递质或其他分析物可通过被动扩散穿过半透膜,随后在设定时间点被收集,并利用高效液相色谱法(HPLC)进行后续分析。HPLC 是一种常用的分析化学技术,可用于分离、鉴定和定量复杂混合物中的各组分3。
尽管微透析是一种灵敏的技术,几乎可用于测量任何感兴趣的分析物,但其时间分辨率较低,最高采样速率仅为数分钟至数十分钟量级1,2。快速扫描循环伏安法(FSCV)的发明弥补了这一不足,该技术依赖于电活性物质的氧化还原电位,能够揭示细胞外液中目标分析物近乎瞬时的浓度变化。简而言之(详见Robinson et al.4 的综述),通过电极在短时间内以三角波形式快速升高和降低电压4。当电压处于适当范围时,目标化合物会反复发生氧化和还原反应。这种氧化与还原过程导致电子移动,从而产生微弱的交变电流。扫描速率在亚秒级进行,化合物的氧化与还原反应在微秒内完成。通过从测得的电流中减去探针产生的背景电流,可以获得每种化合物特有的电压-电流曲线。由于电压振荡的时间尺度已知,这些数据可用于计算电流随时间变化的曲线。因此,只要已知每次氧化和还原反应中转移的电子数,即可确定该化合物的相对浓度4。
这种化学特异性和高时间分辨率使FSCV成为检测化学浓度动态变化的有力技术 体内然而,尽管具有这些多种优势,该技术需要丰富的专业技术知识以及昂贵的设备和装置。此外,非电活性神经递质(例如,谷氨酸)无法通过该技术进行检测。幸运的是,电化学领域的技术进步5,以及这些发明的商业化,引入了一种相对简单的方法,可在不牺牲时间精度的前提下,在清醒活动动物中检测非电活性神经递质——该技术称为酶法生物传感器技术。该技术利用酶促反应将目标非电活性神经递质转化为两种底物,其中一种为具有电活性的过氧化氢,可通过施加电位产生安培氧化电流进行检测5. 可商业获取的生物传感器探针(参见 图1通过竞争性降低内源性干扰物的贡献,选择性地检测目标分析物。以谷氨酸为例,通过将抗坏血酸(AA)氧化酶共定位在传感器的活性酶表面,可竞争性减少常见干扰物抗坏血酸对检测电流的贡献,将AA转化为无电化学活性的脱氢抗坏血酸和水。此外,在酶层下方的带负电荷的Nafion聚合物层可排除内源性阴离子化合物。
这种相同的生物传感器实验装置可以像FSCV一样检测电活性神经递质,但其采用的是固定电位记录6。与FSCV中施加的振荡电压不同,在固定电位记录中,电压保持在目标分析物的氧化还原电位。尽管由于多种神经递质可能具有相同的氧化还原电位,该方法在化学选择性上不如FSCV,但在主要以某一种神经递质为主的脑区,该方法操作简便的优势超过了化学特异性不足的缺点。
能够近乎实时地测量电活性和非电活性神经递质的释放,并将其与特定行为事件相关联,为研究多种神经递质的协同释放提供了机会。本文详细描述了该系统在清醒活动的仓鼠中,用于探究多巴胺和谷氨酸神经传递对自然奖赏反应的应用。本论文的目的是详述在雌性仓鼠性行为过程中测量此类神经递质释放的方法,以证明该技术在研究其他行为及实验范式中的可行性。
仓鼠是进行电化学记录的理想模型
传统上,大鼠和小鼠模型被用于性行为研究。这些啮齿类动物具有动态的交配序列,其中包括多种雌性求偶行为,例如跳跃、快速移动和耳朵抖动,以引诱雄性追逐并最终骑跨雌性7。雄性骑跨(无论是否伴有阴道插入)仅持续数秒,在此期间雌性呈现其特有的性行为姿势(称为lordosis),该姿势同样仅维持数秒,随后便恢复活跃的求偶行为。这种行为模式表现为高度活动与短暂静止交替出现,给在行为动物中测量神经递质释放带来了困难。首先,安培法记录中可能出现与神经活动无关的运动伪迹。其次,运动本身会引发特定脑区中某些神经递质的释放。例如,已有研究发现背侧和腹侧纹状体中的多巴胺释放与运动活动相关8,9,这一发现也成为利用微透析技术在给予精神兴奋剂后测量多巴胺水平的基础10。由于大多数啮齿类动物典型的雌性求偶行为涉及高强度的运动活动,并且在10分钟性行为测试中占据主要时段,因此很难将神经递质释放的变化归因于那些总持续时间仅几分钟的明确性行为成分。
为了分析雌性性行为的神经化学特征,本实验室选择了一种在性行为过程中伴随极少运动活动的物种。叙利亚仓鼠(Syrian hamsters)的交配序列Mesocricetus auratus由于不会表现出大鼠和小鼠中常见的诱发性行为,因此非常适合用于神经化学记录11因此,雌性仓鼠在10分钟的测试过程中会进入并保持超过9分钟的性接受姿态(lordosis posture)。12由于雌性个体缺乏额外的运动行为, 体内 可获得与雄性个体性互动过程中相关组分的电化学记录。
仓鼠的交配行为
将雄性刺激动物引入测试箱后,雄性会首先对雌性进行肛门生殖区探查(AI),然后尝试骑跨雌性(图2A)。雄性要成功骑跨,雌性必须采取一种称为“脊柱前凸”的接受性性姿势,即弓起背部并侧偏尾巴,以便骑跨的雄性能将阴茎插入其阴道。雄性用双前爪抓住雌性的后躯(图2B),开始往复抽动,试图实现阴茎插入(图2C)。在最终达到射精之前,雄性会多次骑跨雌性(无插入)并完成若干次插入动作。这一系列导致射精的骑跨与插入行为称为一次"交配周期"。雄性在一次交配过程中通常会经历多个交配周期。
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本研究所述所有操作程序均经明尼苏达大学机构动物照护与使用委员会(IACUC)批准,并符合《实验动物照护与使用指南》13 的规定。
1. 动物与插管手术
2. 生物传感器与碳纤维测试
3. 处死与灌注
4. 行为编码
5. 示例数据分析
注意:分别采用固定电位碳纤维和酶促记录方法,可实现对多巴胺和谷氨酸电化学释放的紧张性与时相性模式的测量。本实验室使用一套免费的商用采集系统和软件,以记录信号并将其从模拟信号转换为数字信号(偏压 0.600 V,采样率 = 1 Hz)。
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利用上述电化学与行为编码方法,本实验室已开始表征在性行为的在体记录过程中多巴胺和谷氨酸的紧张性与时相性波动。由于该方法具有时间上的精确性,我们能够更准确地刻画性行为期间的神经递质传递,并将释放模式的特定变化归因于交配过程中相应的紧张性变化,以及雌性在接受雄性个体交配行为(例如,插入、射精)时出现的相应瞬时波动。
具体而言,我们采用该方法学重点测量不同动物伏隔核(NAc)中多巴胺和谷氨酸的释放模式。NAc 是参与奖赏处理的关键脑区22,并被描述为性行为奖赏特征中的一个核心区域23。
我们观察到,在性行为过程中,雌性个体在交配阶段会出现伏隔核核心区多巴胺能水平的紧张性升高(
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尽管该技术相对简单直接,但在使用过程中仍可能出现一些问题。首先,探针的立体定位放置必须精确:与微透析技术能够采集探针周围较广范围的细胞外环境样本不同,该技术仅能检测直接接触到探针的神经递质。其次,在使用碳纤维记录探针时,由于纤维直径较小,容易发生断裂,因此探针插入时必须格外小心。对于谷氨酸生物传感器而言,若未在保证有效的3周时间内使用,可能发生酶活性降解。幸运的是,上述所有问题均可通过适当的谨慎操作和细致注意加以解决并完全避免。
在固定电位碳纤维记录的特异性方面可能存在一个潜在的问题。由于多巴胺的施加电位与其他单胺类物质(如去甲肾上腺素)的电位重叠,如果在同时释放这两种神经递质的脑区进行记录,则这种化学特异性不足的情况可能会限制对结果的解释。但在伏隔核(NAc)中,这一问题并不严重,因为多巴胺是该区域主要的儿茶酚胺类神经递质24。由于NAc中约98%的细胞为中等棘状神经元,这些细胞对多巴胺能神经传递有反应24,因此信号更倾向于检测多巴胺,从而有利于采用这种更即用型的技术方法。
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢本科生 Daniel Korus 在运行 Matlab 代码方面的帮助,以及本科生 Alex Boettcher 在开展行为实验中的协助。本项目由 NSF IOS 1256799(资助对象:R.L.M.)以及美国国立卫生研究院国家药物滥用研究所资助奖项编号 T32DA007234 支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 戊巴比妥钠 | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | 注射用戊巴比妥钠,USP。本实验室使用剂量为每100克体重8.5 mg,腹腔注射。 |
| 洛昔康镇痛剂 | Norbrook Laboratories | 6451603670 | 非甾体抗炎镇痛药,用于术后疼痛控制。通用名:美洛昔康。 |
| 恩诺氟沙星抗生素 | Norbrook Laboratories | 5552915411 | 氟喹诺酮类抗生素,用于预防术后感染。通用名:恩诺氟沙星。 |
| Beuthanasia-D | 默克动物保健 | 00061047305 | 戊巴比妥钠、苯妥英钠安乐死试剂。 |
| 骨螺钉 | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" 骨螺钉(每包16个),用于将颅骨帽固定于颅骨。 |
| 牙科丙烯酸树脂(Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | 自凝牙科丙烯酸树脂,用于构建颅骨帽,以固定套管和头部固定装置至颅骨。 |
| 硬件生物传感器系统套装 | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle为首次使用本公司的有线生物传感器系统的大鼠实验用户提供完整的硬件套件。套件包括换向器、前置放大器以及数据调理与采集系统。 |
| 基础视频计算机套装 | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | 基础计算机套装包含一台预配置计算机,具备充足的硬盘存储空间、高清显示器、键盘和鼠标、不间断电源以及所有必要连接线缆。 |
| Video EQ700 EverFocus 摄像头 套装 | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 具备夜视功能的盒式摄像头,配有独立红外光源,作为Pinnacle视频计算机套装的一部分提供。圆顶摄像头(9000-K9)和高清摄像头(9000-K11)也可选配。 |
| Sirenia 采集软件 | Pinnacle Technologies, Inc. | 免费——可从pinnaclet.com下载 | Sirenia 采集软件提供统一平台,用于记录来自任何Pinnacle硬件系统的数据。该软件支持所有数据流的同步、用户可配置设置、数据整合以及多种导出选项。此外,软件还包含用于生物传感器记录的基本回放与分析模块。Sirenia 提供免费的一体化软件,非常适合数据采集与回放。 |
| 大鼠有线 体外 校准套件 | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | 为将生物传感器测得的电流变化与分析物实际浓度变化相关联,必须在将传感器植入动物体内之前对其进行校准。该过程还可验证传感器的完整性与选择性。 校准套件包括20 mL夹套烧杯(#7058)、1/2" × 1/8" 磁力搅拌子(#7059)、直角夹(#7056)、双爪单调节夹(#7055)、4通道校准前置放大器(#7053)以及校准支架(#7051)。 |
| 搅拌器 | Corning | 6795-410D | Corning 数字搅拌器,5" × 7",120 VAC,用于在体外校准谷氨酸生物传感器时驱动夹套烧杯内的磁力搅拌子。 |
| 具备闭环循环功能的水浴锅 | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L 标准数字加热循环水浴锅,120VAC,通过塑料管路将夹套烧杯加热至生理温度。 |
| 带BASi大鼠套管的碳纤维传感器 | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | 用于记录多巴胺神经传递的碳纤维电极。 |
| Ag/AgCl参比电极 | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | 碳纤维记录所必需。 |
| 谷氨酸生物传感器 | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | 用于记录谷氨酸能神经传递的酶法生物传感器探针。 |
| BASi导向套管 | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | 植入目标脑区的导向套管,用于引导探针。 |
| BASi大鼠用塑料头帽 | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | 头部固定装置用于稳定探针并连接至恒电位仪。 |
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