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方法文章

被动CLARITY透明化小鼠卵巢血管结构的三维重建

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DOI：

10.3791/56141

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2017年12月10日

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种改良的被动CLARITY与三维重建方法，用于完整小鼠卵巢中卵巢血管系统及卵泡毛细血管的可视化观察。

摘要

卵巢是女性生殖系统的主要器官，对女性配子的产生以及内分泌系统的调控至关重要。然而，卵巢复杂的结构关系及其三维（3D）血管架构尚未被充分描述。为了可视化完整卵巢中血管的三维连接与结构，首要的关键步骤是使卵巢在光学上透明。为避免组织收缩，我们采用基于水凝胶固定的被动CLARITY（透明脂质交换-丙烯酰胺杂交刚性成像/免疫染色/原位杂交兼容组织水凝胶）技术对完整卵巢进行透明化处理。随后，结合免疫染色、先进的多光子共聚焦显微镜技术以及三维图像重建，实现对卵巢血管和卵泡毛细血管的可视化观察。通过该方法，我们发现卵泡毛细血管长度与卵泡壁体积之间存在显著的正相关关系（P <0.01）。

引言

卵泡是卵巢的基本结构和功能单位，其发育与卵巢内的血管系统密切相关。血管为卵泡提供营养物质和激素，因此在卵泡的生长和成熟过程中发挥着重要作用1。

多种技术的结合，包括选择性血管标记物、转基因小鼠模型以及药物开发，增进了我们对卵巢血管网络、血管生成以及血管在卵泡发生过程中功能的认识。卵巢被称为一个活跃的器官，因为在卵泡发生和排卵过程中，它会不断重塑各种组织和血管网络。这种血管在大小和结构上的活跃重塑，对于卵泡的发育和募集等生物学功能至关重要。

传统的卵巢组织切片和血管免疫标记的组织学及组织形态计量学方法仅能提供二维（2D）图像2。随着三维（3D）重建技术的发展，可通过叠加组织切片的二维图像构建三维结构，但该方法仍存在一些局限性——组织切片可能破坏微细结构，部分组织常有缺失，且从切片图像进行三维重建需要大量人力。利用共聚焦显微镜对完整组织进行三维成像可在很大程度上克服上述限制，但这些方法目前仅限于胚胎卵巢血管生成的评估3。采用CLARITY4等完整组织透明化方法可显著增加可视体积，从而解决出生后及成年卵巢中的上述问题，此类方法可在不引起结构变形的情况下实现卵巢的光学透明。对完整卵巢三维结构的成像可为图像分析软件（如本研究中使用的Imaris软件包）提供精确的图像数据库。

成年期卵巢的持续重塑是动态生理系统的一部分，这使得卵巢成为研究血管生成调控机制的理想模型。此外，通过全卵巢组织成像，可以研究卵巢血管在女性生殖系统病理状态（如多囊卵巢综合征或卵巢癌）中的作用。被动型CLARITY技术的发展以及先进图像分析软件的应用，已提供了关于血管与卵泡等卵巢结构之间空间关系的详细信息。

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方案

所有涉及动物实验的操作均遵循复旦大学上海医学院动物伦理委员会的指导方针（批准编号 20160225-013）。

1. 透明化小鼠卵巢的制备

  1. 溶液的配制
    1. 配制含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（1 M，pH 7.6）（PBST）。配制1 L 10倍浓缩PBS储存液：称取87 g NaCl、3.1 g NaH2PO4 · 2H2O 和28.7 g Na2HPO4 ·12H2O，加去离子水（dH2O）定容至1 L，搅拌约2小时。用1 N NaOH调节pH至7.4，室温保存。使用时将10倍浓缩液用dH2O按1:10稀释，再加入Triton X-100至终浓度为0.1%，制成PBST。
    2. 在冰上将4%（wt/vol）多聚甲醛（PFA）溶液、4%（wt/vol）丙烯酰胺、0.05%（wt/vol）双丙烯酰胺和0.25%（wt/vol）VA-044引发剂溶于双蒸水，配制pH 7.5的水凝胶溶液。
    3. 将含4%（wt/vol）十二烷基硫酸钠（SDS）的200 mM硼酸钠缓冲液溶于双蒸水，配制pH 8.5的透明溶液。
  2. 经心脏灌注及卵巢制备
    1. 所有操作过程中，所有溶液均需置于冰上。
    2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠溶液（0.35 mg/kg）麻醉成年雌性野生型C57BL/6小鼠。当小鼠对脚趾夹捏无反应时，表明已充分麻醉。
    3. 使用胶带将小鼠四肢伸展固定于平板泡沫板上。
    4. 用剪刀经剑突处切开皮肤、胸壁和骨骼，暴露心脏。
    5. 剪开动物右心房，以10 mL/min流速经左心室灌注20 mL冰浴的1×PBS。
    6. 以10 mL/min流速灌注至少20 mL水凝胶溶液。
    7. 用剪刀沿腹中线切开腹部皮肤，暴露整个腹腔，并移除肠道。同时取出卵巢和子宫，以保持卵巢形态的完整性。
    8. 在显微镜下清除卵巢周围的脂肪组织。
  3. 脱气处理
    1. 将卵巢置于10 mL水凝胶溶液中，4 °C固定3天。
    2. 将卵巢转移至5 mL离心管中，加满水凝胶溶液。用封口膜覆盖管口，并在管颈处缠绕封口膜密封。
      注意：确保封口膜与水凝胶溶液之间无气泡。
    3. 将离心管置于37 °C培养箱中的摇床上，振荡不超过3小时，使水凝胶充分聚合。
    4. 用刮勺取出卵巢，用纸巾小心去除周围多余的凝胶。用1×PBS洗涤卵巢4次。
  4. 被动透明化
    1. 将卵巢完全浸入10 mL透明溶液中，在37 °C、80 rpm轻柔振荡，开始透明化过程。
    2. 第一周内每3天更换一次溶液；一周后每周更换一次透明溶液，直至卵巢完全透明。该过程通常需要约2–3周。
      注意：卵巢可直接进行免疫染色，或在含0.02%叠氮化钠的PBS中4 °C保存数周后再进行免疫染色。

2. 免疫染色

  1. 在第1天，将卵巢在PBST中于37 °C摇床上洗涤两次。
  2. 在第2–3天，于37 °C摇床上用一抗/PBST溶液（表1）孵育卵巢。本研究中使用的一抗分别为血小板-内皮细胞黏附分子1（CD31）和酪氨酸羟化酶，它们在PBST中的稀释比例分别为1:10和1:50。
    注意：若使用两种或以上的一抗，需确保其来源于不同动物。
  3. 在第4天，于37 °C摇床上用PBST缓冲液洗去一抗。
  4. 在第5–6天，于37 °C摇床上用PBST中的合适二抗孵育卵巢。本研究中使用的二抗分别为针对酪氨酸羟化酶的Alexa Flour 488和针对CD31的Alexa Flour 594，均以1:50的比例稀释于PBST中。
  5. 在第7天，于37 °C摇床上用PBST缓冲液洗去二抗。
  6. 在第8天，将组织转移至折射率匹配溶液中以实现折射率均一化。将组织置于带网格线的纸上，通过观察是否能看清网格线来检查其透明度。当组织完全透明后，即可进行成像。
  7. 制作一个刚好能包围组织的橡皮泥圆柱体，然后将其塑造成马蹄形，并将外缘紧密压在载玻片上，以形成一个密封空间。橡皮泥的高度应略高于卵巢。
  8. 小心将透明化的卵巢置于橡皮泥中央，并加入折射率匹配溶液。将玻璃底培养皿紧密盖在橡皮泥上，并用橡皮泥固定培养皿。

3. 共聚焦显微镜

  1. 使用共聚焦显微镜成像时，在 "Ni-E" 面板中选择具有合适工作距离（此处为 2.0 mm）的物镜（此处为水浸 25X 物镜，1.1-NA，2 mm-WD）。
  2. 在 "Acquisition" 面板中，选择通道数量。此处使用三个通道。
    1. 首先，使用 "eye port" 选项卡和 XY 控制摇杆，通过显微镜目镜观察，将组织移动至视野中心。
    2. 关闭快门光源后，点击 "live" 选项卡，分别调节每个通道的 "laser power"、"HV (Gain)" 和 "offset。较高的激光功率和 HV 可产生更强的信号，而较高的 offset 可降低背景噪声。
    3. 选择合适的 "Scan size" 和 "Count"。使用 1024 x 1024 µm2 的扫描尺寸和 4 到 8 的计数。
  3. 在 "Z intensity correction" 面板中设置图像质量以定义组织深度，并将物镜定位至卵巢最顶层（组织中心），调整顶层的采集参数后，点击 "plus" 按钮以定义顶层。
    1. 将物镜向下移动，为组织底部设置适当的 HV 和激光功率，并将最底层信息添加到 Z-intensity correction 表中。点击 "To ND" 以将设置同步至 "ND acquisition" 面板。
  4. 在 "ND acquisition" 面板中，首先设置扫描步数，然后勾选 "Z" 和 "Large Image" 选项。
    1. 进入 "Scan large image" 窗口，借助目镜观察组织形态，根据组织边界定义视野大小。返回 "ND acquisition" 面板，输入扫描区域的大小（"fields"），并选择 10% 至 15% 的重叠率。
    2. 点击 "Run Z correction"，而非 "Run now"，以自动为每一层设置合适的 HV、激光功率和 offset，然后等待图像处理完成。

4. 卵泡及其血管系统的三维重建

  1. 首先，使用 ImageJ5 打开原始的 NIS 文件。点击 "Image" 按钮，选择 "Color" 和 "Split Channels"。然后点击 "File"，在 "Save as" 中选择 "Image Sequences" 选项，将各通道分别保存为 tiff 文件序列。
  2. 使用 Imaris 打开其中一个 tiff 文件序列。点击 "Edit" 按钮，选择 "Add channels" 以添加其余通道。通道的名称和颜色可在 "Display Adjustment" 选项卡中更改。组织的厚度可能需要在 "Edit" 下拉菜单中的 "Image Properties" 面板中进行校正。
  3. 对最终图像进行 3D 裁剪并去除多余部分时，点击 "Edit" 按钮，选择 "Crop 3D"。可通过拖动边框来调整视野大小。
  4. 要在 Surpass 面板中使用 Filaments 算法重建血管信号，点击 "Filaments" 按钮创建新的 Filament，然后点击下一步。
    1. 为定义血管的最大和最小直径，进入 "Slice" 面板并找到待追踪的血管。在血管最宽处选择两个点后，距离将自动显示在 "Measure" 面板上。
    2. 返回 "Surpass" 面板，输入测得的宽度，然后点击下一步。
  5. 调整起始点和种子点的阈值。在 "Camera" 面板中选择 "Select"。如果需要删除某些自动生成的球体，按住 Shift 键并点击该点。选择 "Navigate" 并移动鼠标，可旋转结构以确保所有正确点均被保留，然后点击下一步。
  6. 选择最高的局部对比度阈值，然后点击下一步。不要选择 "Detect Spines"，继续完成血管圆柱体的重建。可通过点击 "Color" 选项卡来编辑颜色。重建后的 Filament 的统计学数据可在 "Statistic" 面板中提取。多余部分可在 "Edit" 面板中删除。
    注：可使用其他算法测量总卵泡或卵泡壁的体积。本研究中，卵母细胞通过两种二抗的自发荧光进行标记。由于数据量较大，数据分析使用了工作站服务器。

5. 统计分析

注意：图像分析数据以均值 ± 标准误的形式表示。

  1. 使用独立样本 t 检验对卵泡进行比较，并采用 Pearson 相关性检验比较卵泡壁与毛细血管长度的相关系数。以 P <0.05 作为统计学显著性的判定标准。

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结果

我们将被动式CLARITY方法改进为一种快速简便的被动卵巢透明化方法，在保持卵泡和血管结构完整性的同时，最大限度地获得标记血管和卵泡的荧光信号。通过CD31免疫染色（内皮细胞标志物6）确定卵泡血管系统的三维结构。利用Filament算法追踪成年小鼠卵巢中的CD31染色，揭示了卵泡毛细血管与初级和次级卵泡之间的相互关系（图1）。

采用点变换（Spot transformation）和表面算法（Surface algorithms）检测酪氨酸羟化酶免疫染色的卵母细胞以及颗粒细胞层和膜细胞层，并计算卵泡的总体积7,8。由于卵泡排列紧密，部分被裁切的卵泡结构需通过半手动方式识别。在对各个卵泡体积和卵母细胞进行点变换处理后，对卵泡壁各层进行...

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讨论

在本研究中，我们采用三维成像技术来评估毛细血管与单个生长卵泡之间的关系。在之前的研究中，我们使用相同的方案9，探讨了大血管系统、卵泡间的相互作用以及卵泡在完整小鼠卵巢中的位置。采用被动CLARITY方法，使我们能够研究微血管和大血管系统、卵泡发生过程，以及黄体与卵泡之间的相互关系，并重建不同发育阶段的卵巢结构。

为了获得完整组织的三维图像数据，透明化处理是首要的重要步骤。目前主要有两种策略——脱水法和基于亲水性试剂的方法，例如被动式CLARITY10。由于脱水法常常导致荧光信号减弱，并产生有毒的有机溶剂废液，因此我们致力于简化被动式CLARITY方法中的若干步骤，以便适用于多种类型的组织样本。

透明化处理过程中的第一个关键步骤是经心灌注。在灌注过程中，心脏泵血对于 PBS 和水凝胶溶液在全身的循环起着重要作用，可有效清除血液，从而降低背景荧光。因此，灌注手术应准确且迅速地进行，以避免在水凝胶完全分布至全身之前动物过早死亡。所有试剂在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由博士后科学基金特别资助（编号 2014T70392，项目负责人：YF）、国家自然科学基金（编号 81673766，项目负责人：YF）、新教师启动基金、复旦大学作学基金以及上海市高峰学科发展计划—中西医结合项目（编号 20150407）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙烯酰胺Vetecv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
Alexa Fluor 488（稀释比例 1:50） Life TechnologiesA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
Alexa Fluor 594（稀释比例 1:50）Life TechnologiesA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
双丙烯酰胺Amresco172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
黑色壁玻璃底培养皿（Willco-Dish）Ted Pella14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
硼酸国药集团化学试剂10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4 12H2O）国药集团化学试剂10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
Parafilm 封口膜BemisPM996http://www.parafilm.com/products
多聚甲醛国药集团化学试剂80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1/CD31，血小板-内皮细胞黏附分子1（稀释比例 1:10）Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
光引发剂 VA044Wakova-044/225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
叠氮化钠SigmaS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US
氯化钠（NaCl）国药集团化学试剂10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
二水合磷酸二氢钠（NaH2PO4 2H2O）国药集团化学试剂20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
十二烷基硫酸钠国药集团化学试剂30166428http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428
氢氧化钠（NaOH）国药集团化学试剂10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
吐温 X-100国药集团化学试剂30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
酪氨酸羟化酶（TH，稀释比例 1:50）Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

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