使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

摘要

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential E8（E8）培养基进行。

摘要

无异源成分且完全明确的培养条件是稳定、可重复地生成均一的人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的关键参数。在饲养细胞或成分未明确的基质上维持hiPS细胞，易受批次差异、病原体污染以及免疫原性风险的影响。使用明确的重组人层粘连蛋白521（LN-521）基质，结合无异源成分且成分明确的培养基体系，可降低变异性，实现hiPS细胞的稳定生成。仙台病毒（SeV）载体是一种非整合型RNA载体系统，因此避免了整合型载体可能对基因组完整性造成的破坏性影响。此外，这类载体在皮肤成纤维细胞重编程中已显示出相对较高的效率。同时，采用酶法进行单细胞传代，有助于在无需大量干细胞培养经验的前提下，实现hiPS细胞的均一化维持。本文介绍了一种经过广泛测试和优化的实验方案，重点强调其可重复性和操作便捷性，为从成纤维细胞生成成分明确且无异源成分的人hiPS细胞提供了一种稳健而实用的方法。

引言

自高桥等人首次建立hiPS细胞系以来 等^1,2，人诱导多能干细胞为疾病建模、药物发现以及作为再生医学中细胞治疗的来源材料提供了有用的工具³. hiPS细胞培养长期以来一直依赖于与成纤维细胞饲养层细胞的共培养^4,5 或在Matrigel上⁶ 并且使用含有胎牛血清（FBS）的培养基配方。由于这些培养条件的成分未明确定义，批次间的差异是常见结果，导致不可预测的变异，这是这些实验方案不可靠的主要原因。⁷. 化学成分明确的培养基（如Essential 8（E8））的开发⁸ 以及定义明确的细胞培养基质，例如 LN-521⁹，有助于建立高度可重复的实验方案，并促进均一性人诱导多能干细胞的稳定生成与维持^7,8,9,10.

非整合型重编程技术的发展是一个重大进步。最初，重编程依赖于逆转录病毒载体，这些载体随机整合到基因组中，对基因组完整性产生破坏性影响¹¹。重编程方法的进展包括基于RNA的载体的开发。与基于DNA的重编程方法相比，RNA载体具有优势，因为不会发生通过基因组重组导致的意外整合¹²。副黏病毒（SeV）载体通过单链RNA实现外源因子的高效且瞬时表达，无需DNA阶段¹¹。通过SeV递送的重编程载体在细胞扩增过程中逐渐被稀释，并最终从培养体系中消除，从而实现无痕迹的重编程。此后，多能性的维持依赖于多能性基因的内源性表达²。

随着基于人诱导多能干细胞（hiPS细胞）的前沿疗法逐步进入临床试验阶段，标准化批次、可重复性及安全性成为亟需解决的关键问题¹³。因此，应避免使用动物来源的产品。例如，异种来源产品的使用已被证实存在非人源病原体污染的风险。此外，研究表明，在含有动物来源培养成分的条件下培养的细胞会将非人源的唾液酸整合入细胞膜中，可能导致所获得的细胞具有免疫原性¹⁴。因此，任何未来临床应用都必须消除异种来源产品的使用。本实验方案采用无异种成分且成分明确的培养体系来维持hiPS细胞，使其更接近临床应用的要求。

本方案描述了一种稳定、高度可重复且易于使用的标准化方法，可从成纤维细胞生成人诱导多能干细胞（hiPS细胞）。同时提供了一种用户友好的培养体系，用于已建立的hiPS细胞的维持。该方案已在瑞典卡罗林斯卡学院国家人源iPS细胞核心设施中用于建立超过300个人iPS细胞系，其中部分细胞系此前已有报道^15,16。

方案

采集患者样本并建立hiPS细胞系已获得斯德哥尔摩伦理审查委员会批准，批准日期为2012年3月28日，注册编号：2012/208-31/3。除非另有说明，细胞培养操作均应在生物安全柜中进行。处理细胞时务必采用无菌操作技术。实验开始前，应使培养基、培养板和试剂恢复至室温。细胞置于37 ᵒC、5% CO₂、高湿度条件下培养。

1. 从皮肤活检中分离人成纤维细胞

1. 培养基制备，消化酶配制，培养皿包被及解剖工具准备。
   1. 制备成纤维细胞培养基：44.5 mL Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）、5 mL 胎牛血清（FBS）和500 µL 青霉素/链霉素（PEST）（参见 表1），4 °C 保存。
   2. 以1 mg/mL的工作浓度配制消化酶：分别称取4 mg分散酶（dispase）和I型胶原酶（collagenase type I）粉末，置于两个15 mL离心管中，各加入4 mL DMEM/F12 + 1% PEST溶解。将酶溶液经0.22 µm滤器过滤除菌。每次均需新鲜配制酶溶液。
   3. 每个分离的活检组织样本使用一个6孔组织培养板（或35 mm组织培养皿），每孔加入1 mL含0.1%明胶的磷酸盐缓冲液（DPBS）进行包被。室温孵育30分钟。
   4. 每次活检时，为解剖准备一套经高压灭菌的手术剪和镊子。
2. 活检样本处理
   注意：取材后应尽快处理活检样本。样本可在含1% PEST的PBS中4 °C保存，最长不超过48小时。活检组织直径应为2–4 mm，并符合伦理许可要求。
   1. 将活检组织转移至一个35 mm培养皿中。将活检组织移至一个新的35 mm培养皿，加入2 mL 70%乙醇浸泡30秒。
   2. 将活检组织转移至第三个35 mm培养皿中，用1 mL添加了1% PEST的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤。
   3. 将活检组织转移至第四个35 mm培养皿中，加入1 mL新配制的0.1% dispase溶液。
   4. 将皮肤活检组织切成 1 - 2 mm³ 使用手术剪和镊子将培养皿中的组织块剪碎，然后将包含dispase溶液的活检组织块转移至15 mL离心管中。再加入2 mL dispase溶液。
   5. 用1 mL dispase溶液冲洗35-mm培养皿，并转移至15-mL离心管中。
   6. 将活检样本在 4 °C 下孵育过夜。
   7. 加入4 mL 0.1% I型胶原酶至离心管中，37 °C孵育4 h。
   8. 将消化后的细胞以300 × g离心3分钟，吸除上清液，并将沉淀物重悬于2 mL成纤维细胞培养基中。
   9. 从6孔组织培养板中移除明胶溶液。将细胞悬液（包括任何残留的组织块）转移至预先用含0.1%明胶的DPBS包被的6孔组织培养板（或35 mm组织培养皿）中。
   10. 每隔三天更换一次培养基。
3. 人成纤维细胞的扩增
   注意：成纤维细胞已准备好传代至T25（25 cm²）培养瓶中。²80% 汇合度时的组织培养瓶图2B成纤维细胞通常在7天内达到80%融合度。然而，所需时间可能差异较大，但不应超过4周。
   1. 吸弃培养基，用 2.5 mL DPBS 洗涤一次。
   2. 移除DPBS，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育5分钟，或直至细胞边缘变圆并开始脱落。
   3. 如有必要，加入2 mL成纤维细胞培养基，冲洗细胞以确保细胞充分解离。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在300 × g下离心3分钟。
   4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL成纤维细胞培养基中，接种成纤维细胞至未经包被的T25细胞培养瓶中。在此步骤后扩增成纤维细胞时，按上述方法进行消化，并接种12 × 10⁶细胞³ 细胞/厘米²².
   5. 待细胞生长至融合状态并准备冻存时，可进行扩增或铺板以开展重编程实验。在启动任何重编程操作之前，应先冻存两轮成纤维细胞（冻存步骤详见下一部分）。较低传代次数的成纤维细胞通常具有更高的重编程效率，以第2至第4代细胞为最佳。然而，使用本方案也已成功实现对传代数高达第10代的成纤维细胞的重编程。
4. 成纤维细胞的冻存与复苏
   1. 制备新鲜的成纤维细胞冻存液：90% FBS + 10% 二甲基亚砜（DMSO），4 °C 保存表1待细胞长满后，可将T25培养瓶中的细胞分装至三个冻存管中冻存。每冻存一支冻存管，需准备500 µL成纤维细胞冻存液。
   2. 为冻存细胞，按照步骤1.3所述方法消化细胞，使用血细胞计数板计数细胞，并将每份3 × 10⁶个细胞转移至冻存管中⁵ 将细胞转移至15 mL离心管中。以300 x g离心3分钟。吸除上清液。
   3. 将细胞沉淀重悬于 500 µL 4 ˚C 的成纤维细胞冻存液中，转移至冻存管。将冻存管放入冻存盒中，于 -80 °C 培养 24 h，随后转移至液氮中进行长期保存。
   4. 将冻存管底部浸入37 °C水中以解冻细胞。待完全溶解后，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，并加入5 mL成纤维细胞培养基。以300 × g离心3分钟。
   5. 移去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL成纤维细胞培养基中。将细胞转移至未包被的T25培养瓶中，在37 °C下孵育。

2. 使用SeV载体对成纤维细胞进行重编程

1. 载体分装的制备
   注意：须在生物安全二级防护条件下操作 SeV。请参考制造商提供的方案及当地相关指南¹⁷病毒滴度在不同批次间存在差异。
   1. 在制备分装样品前，计算转染 5 x 10⁶ 感受态细胞所需的载体量⁴ 细胞，按照制造商的说明书进行操作（例如，CytoTune 2.0）。病毒滴度通常在 8 x 10⁷ - 1.5 × 10⁸解冻并混合载体，比例为5:5:3（KOS MOI = 5，hc-myc MOI = 5，hKlf4 MOI = 3）。分装出用于重编程5 × 10⁵细胞的计算用量⁴ 将细胞转入已灭菌的1.5 mL离心管中。用成纤维细胞培养基将病毒分装液稀释至终体积250 µL，用于重编程。
      注意：每瓶试剂仅适用于24孔组织培养板中一个孔的重编程，细胞数量为5 x 10⁴ 成纤维细胞。将病毒分装样品储存在 -80 °C。
2. SeV 载体转导
   1. 吸弃细胞培养基，加入1 mL DPBS洗涤。吸弃DPBS，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA。于37 °C孵育5 min，或直至细胞脱落。
   2. 加入2 mL成纤维细胞培养基，重悬细胞后转移至15 mL离心管中。300 × g离心3分钟。
   3. 吸除上清液，并将沉淀重悬于2 mL成纤维细胞培养基中。
   4. 使用血细胞计数板对成纤维细胞进行计数，并接种 5 x 10⁴ 24孔组织培养板中一个孔的细胞，于37 °C孵育过夜。
   5. 吸弃细胞培养基，加入250 µL SeV溶液，于37 °C孵育过夜。
   6. 每天更换为新鲜的成纤维细胞培养基。将转导后的细胞培养7天，然后传代至LN-521包被的培养板中。在传代前一天制备LN-521包被板。包被步骤详见2.3.1。
3. 转导成纤维细胞的重铺板
   1. LN-521 包被培养皿的制备：将 LN-521 用 DPBS 稀释至终浓度为 0.63 µg/cm²²每60 mm组织培养皿中加入2 mL LN-521溶液。用封口膜密封60 mm组织培养皿，4 °C孵育过夜。
   2. 制备Essential 8培养基（E8）分装液以便于操作：48.5 mL E8培养基、1 mL E8添加剂和500 µL PEST表1).
   3. 转导7天后，将细胞传代至LN-521包被的60 mm组织培养皿中。加入250 µL胰蛋白酶-EDTA（0.05%），37 °C孵育5分钟，或直至细胞完全脱落。加入2 mL成纤维细胞培养基，300 × g离心3分钟。
   4. 吸弃上清液。用2 mL成纤维细胞培养基重悬细胞沉淀，并用血细胞计数板计数细胞。从预包被的培养板中吸弃LN-521溶液，接种4 × 10⁴个细胞。⁴ 在LN-521包被的60 mm培养皿中，加入5 ml成纤维细胞培养基悬浮细胞。添加Rho激酶抑制剂Y-27632（ROCKi），使其终浓度为5 µM。37 °C孵育过夜。
   5. 重要的是，次日将培养基更换为 E8 培养基，并每日更换 E8 培养基。hiPS 细胞集落将在 2–3 周内出现。

3. 克隆挑选与 hiPS 细胞扩增

注意：以下步骤在生物安全柜外的体视显微镜下进行。建议佩戴发网和手术口罩。操作时需小心，避免污染细胞培养物。

1. 在挑取细胞前一天准备LN-521包被的组织培养24孔板。用DPBS将LN-521稀释至0.63 µg/cm²。向24孔组织培养板的每个孔中加入250 µL LN-521溶液。用封口膜密封板子，在4 °C下孵育过夜。
   注意：当克隆直径达到>1 mm时即可进行挑取。克隆应具有清晰的边缘，并以均一的单层形式生长（图2D）。
2. 吸除LN-521溶液，并向24孔组织培养板的一个孔中加入500 µL E8培养基。
3. 在体视显微镜下用手术刀以网格状模式将克隆切割成较小的片段。用机械方法将细胞片从培养皿上刮下，并使用200 µL移液器将细胞片转移至已准备好的孔中（图2D-2E）。将不同克隆分别挑取至不同的孔中。
4. 让细胞贴壁，48小时内不更换培养基。此后每天更换E8培养基。
5. 当克隆生长至直径>5 mm时，用酶法将细胞以单细胞形式传代至新的LN-521包被孔中。
6. 吸除细胞培养液，并用250 µL DPBS洗涤一次。
7. 吸除DPBS，加入250 µL解离试剂，在37 °C下孵育3分钟。
8. 观察细胞是否开始变圆。通过数次冲洗使细胞从培养板上脱离。
9. 在15 mL离心管中加入500 µL E8培养基。将含有解离试剂的细胞转移至该管中，以300 x g离心3分钟。
10. 吸除LN-521包被孔中的LN-521溶液，加入500 µL室温E8培养基。
11. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于500 µL E8培养基中。
12. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将2.5 x 10⁴ - 5 x 10⁴ 个细胞接种至已准备好的LN-521预包被孔中（即1.25 x 10⁴ - 2.5 x 10⁴ 个细胞/cm²）。可根据实验需求轻松扩大培养规模。
13. 加入ROCKi至终浓度为10 µM。将细胞在37 °C下孵育。
14. 每天更换E8培养基。细胞通常在4–6天后即可传代。当细胞融合度约为90%时，按上述方法以单细胞形式进行酶法传代。
    注意：重编程载体在hiPS细胞扩增过程中逐渐被稀释，在第12代后无法检测到。部分重编程的细胞通常在第6–10代左右停止增殖，或失去典型的多能干细胞形态（图3B）。
15. hiPS细胞的冻存与复苏
    1. 冻存细胞时，按上述方法将细胞酶解为单细胞，使用血细胞计数板计数后，将2.5 x 10⁵个细胞转移至含有1 mL E8培养基的15 mL离心管中，以300 x g离心3分钟，吸除上清液。
    2. 将细胞沉淀重悬于250 µL 4 °C的PSC冻存液中，转移至冻存管。将冻存管放入程序降温盒中，于-80 °C孵育24小时后，转移至液氮中长期保存。
    3. 复苏细胞时，先准备一个LN-521预包被的24孔组织培养板孔：吸除LN-521溶液，加入250 µL E8培养基。将冻存管底部浸入37 °C水浴中，直至仅剩少量冰晶。
    4. 向冻存管中加入250 µL E8培养基，将细胞悬液转移至15 mL离心管中，再加入1 mL E8培养基。以300 x g离心3分钟。
    5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于250 µL室温E8培养基中。将细胞悬液转移至已准备好的孔中，并添加1%细胞活力增强剂或10 µM ROCKi。将组织培养板置于37 °C孵育。

结果

从活检组织到人诱导多能干细胞

从活检组织到获得不含重编程载体、可用于表征的稳定人诱导多能干细胞（hiPS细胞）的整个过程大约需要16周（图1）。更详细的时间线见图2A。建立并扩增成纤维细胞培养物大约需要4周时间。在使用仙台病毒载体转导约三周后，开始出现首批hiPS细胞克隆。克隆通过机械法进行首次挑取传代，之后以单细胞形式进行酶消化传代。

建立人成纤维细胞培养

当人成纤维细胞培养物生长至融合状态并呈现公认的形态时，先进行两代的扩增和冻存，然后接种用于转导（图2B

讨论

本方案预期结果是成功建立多个克隆来源的人诱导多能干细胞（hiPS）细胞系。重要的是，本文所述的已建立hiPS细胞的维持与扩增方法可靠，即使缺乏干细胞培养经验的操作者也能顺利完成。已知采用ROCK抑制剂（ROCKi）进行酶法单细胞传代，结合LN-521基质，可使细胞保持正常的核型、多能性以及良好的分化能力，同时避免因克隆集落传代可能引发的异质性^10,19,20。在LN-521基质上培养的hiPS细胞可在不添加ROCKi的情况下以单细胞形式传代¹⁰，但添加ROCKi可使操作对经验较少的操作者更为简便，并缩短hiPS细胞系建立所需时间。

采用本方案进行重编程时，效率通常不是问题；SeV 载体对成纤维细胞的重编程效率相对较高，可达 > 1%¹¹。预期会出现大量克隆集落（<20）。建议挑取所需数量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dispase	Life Technologies	171105-041	组织活检消化
Collagenase	Sigma	C0130	组织活检消化
明胶	Sigma	G1393	成纤维细胞基质
IMDM	Life Technologies	21980002-032	成纤维细胞培养基
FBS	Invitrogen	10270106	成纤维细胞培养基
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070-063	抗生素
Essential 8 培养基	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS 细胞培养培养基
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS 细胞培养基质
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	解离试剂
Rho-激酶抑制剂 Y27632	Millipore	SCM075	Rho-激酶抑制剂 (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 重编程试剂盒	Life Technologies	A1377801	仙台病毒重编程载体
35 mm 组织培养皿	Sarstedt	83.3900.300	细胞培养
60 mm 组织培养皿	Sarstedt	83.3901.300	细胞培养
24 孔组织培养板	Sarstedt	83.3922.300	细胞培养
T25 组织培养瓶	VWR	734-2311	细胞培养
15 mL 离心管	Corning	430791	离心管
1.5 mL 离心管	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL 离心管
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	冷冻容器
DMSO	Sigma	D2650-100ml	成纤维细胞冷冻
1.8 mL 冻存管	VWR	479-6847	冻存管
PSC 冻存试剂盒	Gibco	A2644601	PSC 冻存培养基 RevitaCell 添加剂
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	成纤维细胞解离酶
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	消化酶稀释液
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	组织活检制备
血细胞计数板	Sigma	BRAND, 718920	细胞计数
Parafilm	VWR	291-1213	储存用板密封材料