使用层粘连蛋白521基质无整合方法建立人诱导多能干细胞

摘要

通过使用非整合型仙台病毒（SeV）载体介导的皮肤成纤维细胞重编程，成功实现了人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的高效获得。hiPS细胞的维持和克隆扩增采用无异源成分且化学成分明确的培养条件，使用重组人源层粘连蛋白521（LN-521）基质和Essential E8（E8）培养基进行。

摘要

无异源成分且完全明确的培养条件是稳定、可重复地生成均一的人诱导性多能干细胞（hiPS细胞）的关键参数。在饲养细胞或成分未明确的基质上维持hiPS细胞，易受批次差异、病原体污染以及免疫原性风险的影响。使用明确的重组人层粘连蛋白521（LN-521）基质，结合无异源成分且成分明确的培养基体系，可降低变异性，实现hiPS细胞的稳定生成。仙台病毒（SeV）载体是一种非整合型RNA载体系统，因此避免了整合型载体可能对基因组完整性造成的破坏性影响。此外，这类载体在皮肤成纤维细胞重编程中已显示出相对较高的效率。同时，采用酶法进行单细胞传代，有助于在无需大量干细胞培养经验的前提下，实现hiPS细胞的均一化维持。本文介绍了一种经过广泛测试和优化的实验方案，重点强调其可重复性和操作便捷性，为从成纤维细胞生成成分明确且无异源成分的人hiPS细胞提供了一种稳健而实用的方法。

引言

自高桥等人首次建立hiPS细胞系以来 等^1,2，人诱导多能干细胞为疾病建模、药物发现以及作为再生医学中细胞治疗的来源材料提供了有用的工具³. hiPS细胞培养长期以来一直依赖于与成纤维细胞饲养层细胞的共培养^4,5 或在Matrigel上⁶ 并且使用含有胎牛血清（FBS）的培养基配方。由于这些培养条件的成分未明确定义，批次间的差异是常见结果，导致不可预测的变异，这是这些实验方案不可靠的主要原因。⁷. 化学成分明确的培养基（如Essential 8（E8））的开发⁸ 以及定义明确的细胞培养基质，例如 LN-521⁹，有助于建立高度可重复的实验方案，并促进均一性人诱导多能干细胞的稳定生成与维持^{7,8,9,10<....}

方案

采集患者样本并建立hiPS细胞系已获得斯德哥尔摩伦理审查委员会批准，批准日期为2012年3月28日，注册编号：2012/208-31/3。除非另有说明，细胞培养操作均应在生物安全柜中进行。处理细胞时务必采用无菌操作技术。实验开始前，应使培养基、培养板和试剂恢复至室温。细胞置于37 ᵒC、5% CO₂、高湿度条件下培养。

1. 从皮肤活检中分离人成纤维细胞

1. 培养基制备，消化酶配制，培养皿包被及解剖工具准备。
   1. 制备成纤维细胞培养基：44.5 mL Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）、5 mL 胎牛血清（FBS）和500 µL 青霉素/链霉素（PEST）（参见 表1），4 °C 保存。
   2. 以1 mg/mL的工作浓度配制消化酶：分别称取4 mg分散酶（dispase）和I型胶原酶（collagenase type I）粉末，置于两个15 mL离心管中，各加入4 mL DMEM/F12 + 1% PEST溶解。将酶溶液经0.22 µm滤器过滤除菌。每次均需新鲜配制酶溶液。
   3. 每个分离的活检组织样本使用一个6孔组织培养板（或35 mm组织培养皿），每孔加入1 mL含0.1%明胶的磷酸盐缓冲液（DPBS）进行包被。室温孵育30分钟。
   4. 每次活检时，为解剖准备一套经高压灭菌的手术剪....

结果

从活检组织到人诱导多能干细胞

从活检到获得不含重编程载体、可用于表征的稳定 hiPS 细胞系，整个过程大约需要 16 周（图 1）。更详细的时间线见 图 2A。建立和扩增成纤维细胞培养物大约需要 4 周时间。转导仙台病毒载体约三周后，开始出现第一批 hiPS 细胞克隆。克隆通过机械法挑选进行首次传代，随后以单细胞形式进行酶消化传代。

建立人成纤维细胞培养

当人成纤维细胞培养物生长至融合状态并呈现典型形态时，先进行两代扩增和冻存，然后再接种用于转导（图2B

讨论

本方案预期结果是成功建立多个克隆来源的人诱导多能干细胞（hiPS）细胞系。重要的是，本文所述的已建立hiPS细胞的维持与扩增方法可靠，即使缺乏干细胞培养经验的操作者也能顺利完成。已知采用ROCK抑制剂（ROCKi）进行酶法单细胞传代，结合LN-521基质，可使细胞保持正常的核型、多能性以及良好的分化能力，同时避免因克隆集落传代可能引发的异质性^10,19,20。在LN-521基质上培养的hiPS细胞可在不添加ROCKi的情况下以单细胞形式传代¹⁰，但添加ROCKi可使操作对经验较少的操作者更为简便，并缩短hiPS细胞系建立所需时间。

采用本方案进行重编程时，效率通常不是问题；SeV 载体对成纤维细胞的重编程效率相对较高，可达 > 1%¹¹。预期会出现大量克隆集落（<20）。建议挑取所需数量.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dispase	Life Technologies	171105-041	组织活检消化
Collagenase	Sigma	C0130	组织活检消化
明胶	Sigma	G1393	成纤维细胞基质
IMDM	Life Technologies	21980002-032	成纤维细胞培养基
FBS	Invitrogen	10270106	成纤维细胞培养基
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070-063	抗生素
Essential 8 培养基	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS 细胞培养培养基
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS 细胞培养基质
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	解离试剂
Rho-激酶抑制剂 Y27632	Millipore	SCM075	Rho-激酶抑制剂 (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 重编程试剂盒	Life Technologies	A1377801	仙台病毒重编程载体
35 mm 组织培养皿	Sarstedt	83.3900.300	细胞培养
60 mm 组织培养皿	Sarstedt	83.3901.300	细胞培养
24 孔组织培养板	Sarstedt	83.3922.300	细胞培养
T25 组织培养瓶	VWR	734-2311	细胞培养
15 mL 离心管	Corning	430791	离心管
1.5 mL 离心管	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL 离心管
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	冷冻容器
DMSO	Sigma	D2650-100ml	成纤维细胞冷冻
1.8 mL 冻存管	VWR	479-6847	冻存管
PSC 冻存试剂盒	Gibco	A2644601	PSC 冻存培养基 RevitaCell 添加剂
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	成纤维细胞解离酶
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	消化酶稀释液
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	组织活检制备
血细胞计数板	Sigma	BRAND, 718920	细胞计数
Parafilm	VWR	291-1213	储存用板密封材料