本实验方案的总体目标是演示如何向对长链表皮信息素产生反应的Drosophila嗅觉受体神经元进行单感器记录时，递送低挥发性气味物质。
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本文内容
摘要
摘要
昆虫依赖嗅觉来引导一系列对其生存至关重要的行为，例如觅食、躲避天敌、产卵和交配。已有大量具有不同挥发性的化学物质被鉴定为能够激活昆虫嗅觉受体神经元（Olfactory Receptor Neurons, ORNs）的天然气味分子。然而，由于传统气味递送方法难以有效呈现低挥发性气味物质，对这类气味分子的嗅觉响应研究一直受到限制。本文介绍了一种可用于体内单感器记录（in vivo Single-Sensillum Recording, SSR）中有效递送低挥发性气味物质的实验方法。通过缩短气味源与靶组织之间的距离，该方法使得一些具有生物学意义但此前难以接触的气味分子得以应用，包括棕榈油酸——一种已被证实可激活与求偶及交配行为相关ORNs的兴奋性信息素1。因此，本方法为研究昆虫嗅觉及信息素通讯中多种低挥发性气味物质的功能提供了新的途径。
引言
Drosophila 的嗅觉感受神经元（ORNs）可响应大量气味分子，这些气味分子具有不同长度的碳链以及多种官能团，包括酯类、醇类、酮类、内酯类、醛类、萜类、有机酸、胺类、含硫化合物、杂环化合物和芳香族化合物2,3。具有不同理化特性的气味分子其挥发性差异显著，这可通过化合物的蒸气压来体现。值得注意的是，对 Drosophila melanogaster 具有生物学意义的气味分子在挥发性上存在巨大差异。例如，Ir92a 嗅觉神经元响应氨气4，该物质高度挥发，20 °C 时蒸气压为 6,432 mmHg。相比之下，Or67d 嗅觉神经元响应一种雄性信息素 cis-十三碳烯乙酸酯（cVA）5,6，其在 20 °C 时的蒸气压为 43 mmHg。
研究低挥发性气味物质的嗅觉反应时，使用传统的气味递送方法尤为困难，这类方法通过载气气流在相对较远的距离上传递气味物质（即 数厘米）。因此，对于同一种低挥发性气味物质，所报告的嗅觉反应可能会因气味递送系统的设计不同而存在显著差异。例如，Or67d 嗅觉受体神经元对高....
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方案
1. at4 记录硬件的准备
- 使用拉针仪制备电极，采用硅酸铝玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.64 mm）。用精细镊子略微钝化参比电极的尖端，以便插入果蝇的唇基（i.e. 位于果蝇头部前端、口器上方的圆形板状结构）。
注意：本研究使用 7 日龄的野生型雄性果蝇（Berlin 品系）。两个电极均使用 AHL 生理盐水溶液14 作为电解液。 - 配制 1 L AHL 溶液：将 900 mL 去离子水与 6.312 g NaCl、0.373 g KCl、0.337 g NaHCO3、0.1120 g NaH2PO4、1.892 g 海藻糖ּ2H2O、3.423 g 蔗糖、1.192 g HEPES 以及 8.2 mL 1 M MgCl2 混合。用去离子水定容至 1 L，用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.4，并使用真空驱动过滤系统对溶液进行灭菌。长期储存时，将 AHL 分装后保存于 4 °C。
注意：棕榈油酸的稳定递送依赖于各 cartridges 之间的一致性。每个 cartridge 必须以可重复的方式组装，这一点至关重要。 - 使用剃须刀片从 200 µL 移液器吸头尖端切去 0.9 cm，制成第一段 cartridge，长度为 4.1 cm；具体尺寸....
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结果
本技术已成功用于测定棕榈油酸的反式（图5A）与顺式（图5B）异构体的相对功效。代表性数据表明，与顺式异构体相比，反式-棕榈油酸对Or47b嗅觉受体神经元（ORNs）具有更强的配体活性（图5C）。每只果蝇记录一个神经元，每条剂量-反应曲线记录12只果蝇，共记录24只果蝇。所有数据来自三次独立重复实验，每次实验记录8只果蝇。误差线表示标准误（s.e.m.）。
值得注意的是，气味盒开口与果蝇头部之间的距离对记录结果具有显著影响。为了在 Or47b 嗅觉受体神经元（ORNs）中引发对棕榈油酸的显著反应，我们将气味刺激物以约 4 mm 的近距离施加于触角处1（
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讨论
本文介绍了一种可稳健诱导并记录Or47b嗅觉受体神经元（ORNs）对棕榈油酸反应的实验方法。我们对传统的远距离气味递送方法2,7,10进行了改进，以解决信息素气味递送不足的问题。针对气味物质挥发性低的难题，我们采用气味 cartridges 进行递送，并将cartridge开口置于样品附近数毫米处。只要确保每个气味cartridge的结构和位置保持一致，该方案即可成为一种可重复地递送原本难以接触的气味物质的有效方法。
本文所述的近距离气味呈递方法相较于现有的气味递送技术具有重要意义。该方法可实现多种未来应用，包括不仅可用于筛选存在于毛形感器中的嗅觉受体神经元（ORNs）对其他低挥发性气味物质的响应，还可用于检测存在于任何类型感器中的嗅觉受体神经元的响应1。该方法通过气流脉冲实现信息素气味物质的高效递送，而无需通过物理移动携带气味物质的玻璃毛细管靠近触.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢叶 Zhang 在样本轨迹方面的帮助，以及张天祺在图片方面的协助。本工作获得了Ray Thomas Edwards基金会早期职业奖以及美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01DC015519）对C.-Y.S.的支持，以及美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01DC009597 和 R01DK092640）对J.W.W.的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 准备设置 &和杂项材料 | |||
| 拉针仪 | Sutter Instruments 加利福尼亚州诺瓦托，美国 | P97 | 拉针仪 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments 萨拉索塔，佛罗里达州，美国 | 1B100F-4 | 用于制作固定杆 |
| 铝硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instruments 加利福尼亚州诺瓦托，美国 | AF100-64-10 | 制作电极 |
| Superfrost 显微镜载玻片 | Fisher Scientific<昆虫依赖嗅觉来引导一系列对其生存至关重要的行为，例如觅食、躲避天敌、产卵和交配。已有大量具有不同挥发性的化学物质被鉴定为能够激活昆虫嗅觉受体神经元（Olfactory Receptor Neurons, ORNs）的天然气味分子。然而，由于传统气味递送方法难以有效呈现低挥发性气味物质，针对此类物质的嗅觉响应研究一直受到限制。本文介绍了一种可在活体单感器记录（Single-Sensillum Recording, SSR）实验中有效递送低挥发性气味物质的操作流程。通过缩短气味源与目标组织之间的距离，该方法可成功应用一些具有生物学意义但此前难以触及的气味物质，例如棕榈油酸——一种已被证实可激活与求偶及交配行为相关ORNs的兴奋性信息素¹。因此，本方法为研究昆虫嗅觉及信息素通讯提供了检测多种低挥发性气味物质的新途径。> 宾夕法尼亚州匹兹堡 美国 | 12-550-143 | 用于果蝇准备工作站 |
| 永久性双面胶带 | 苏格兰威士忌 美国明尼苏达州圣保罗 | NA | 用于果蝇准备工作站 |
| 直立显微镜 | Olympus 日本东京新宿 | BX51 | 用于记录装置 |
| Plastalina 油泥 | Van Aken 美国南卡罗来纳州北查尔斯顿 | B0019QZMQQ | 用于准备站并固定持握杆 |
| 带SFCA膜的快速流动一次性无菌过滤装置，0.45 mm | Nalgene 美国纽约州罗切斯特 | #156-4045 | 以灭菌AHL溶液 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| cartridge 材料 | |||
| 200 µL型移液器吸头 | VWR Radnor PA 美国 | 53508-810 | 制作气味 cartridges 和果蝇准备 |
| 滤纸 | 沃特曼 英国肯特郡梅德斯通 | 740-E | 制作气味 cartridges |
| 真空干燥器 | Cole-Parmer 美国伊利诺伊州弗农山 | VX-06514-30 | 挥发乙醇溶剂 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 气味物质材料 | |||
| 顺式-棕榈油酸 | Cayman Chemical 美国密歇根州安娜堡 | #10009871（CAS # 373-49-9） | Or47b 气味物 |
| trans-棕榈油酸 | Cayman Chemical 美国密歇根州安娜堡 | #9001798（CAS # 10030-73-6） | Or47b 气味物 |
| 乙醇 | Spectrum Chemical MFG. 新泽西州新不伦瑞克 美国 | E1028-500MLGL | 稀释棕榈油酸 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 仪器设置材料 | |||
| 气味剂盒微操作器 | Siskiyou 格兰茨帕斯 俄勒冈州 美国 | MX130R | 用于定位嗅觉仪 |
| Flow Vision 软件 | Alicat 图森，亚利桑那州，美国 | FLOWVISIONSC | 用于控制流速的软件 |
| 质量控制器 | Alicat 图森，亚利桑那州，美国 | MC-2SLPM-D | 控制加湿空气的流速 |
| 质量控制器 | Alicat 图森，亚利桑那州，美国 | MC-500SCCM-D | 控制气味刺激的流速 |
| Clampex | Molecular Devices 美国加利福尼亚州森尼韦尔 | Ver. 10.4 | 数据采集软件 |
| 空气输送管 | Ace Glass 美国新泽西州维尼兰 | 8802-936 | 输送加湿空气 |
| 50X物镜 | Olympus 日本东京新宿 | LMPLFL50X | 记录装置 |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA 美国 | Ver. 10.4 | 用于峰电位分析的软件 |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics 美国俄勒冈州莱克奥斯韦戈 | Ver. 6.37 | 用于数据分析的软件 |
| 音频监测器 | ALA科学仪器公司 美国纽约州法明代尔 | NPIEXB-AUDIS-08B | 听觉报告单个峰电位 |
| 细胞外放大器 | ALA科学仪器公司 美国纽约州法明代尔 | NPIEXT-02F | 以增强电信号的幅度 |
| 阀门控制器 | Warner Instruments | VC-8 | 控制气味刺激阀门的开启 |
| 记录电极显微操作器 | Sutter Instruments 美国加利福尼亚州诺瓦托 | MP-285 | 放置记录电极 |
| 前置放大器 | ALA科学仪器公司 美国纽约州法明代尔 | EQ-16.0008 | 以增强电信号的幅度 |
| 示波器 | Tektronix 美国俄勒冈州比弗顿 | TDS2000C | 单个峰电位的可视化报告 |
参考文献
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al.
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