本实验方案的总体目标是演示如何向对长链表皮信息素产生反应的Drosophila嗅觉受体神经元进行单感器记录时，递送低挥发性气味物质。
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本文内容
摘要
摘要
昆虫依赖嗅觉来引导一系列对其生存至关重要的行为，例如觅食、躲避天敌、产卵和交配。已有大量具有不同挥发性的化学物质被鉴定为能够激活昆虫嗅觉受体神经元（Olfactory Receptor Neurons, ORNs）的天然气味分子。然而，由于传统气味递送方法难以有效呈现低挥发性气味物质，对这类气味分子的嗅觉响应研究一直受到限制。本文介绍了一种可用于体内单感器记录（in vivo Single-Sensillum Recording, SSR）中有效递送低挥发性气味物质的实验方法。通过缩短气味源与靶组织之间的距离，该方法使得一些具有生物学意义但此前难以接触的气味分子得以应用，包括棕榈油酸——一种已被证实可激活与求偶及交配行为相关ORNs的兴奋性信息素1。因此，本方法为研究昆虫嗅觉及信息素通讯中多种低挥发性气味物质的功能提供了新的途径。
引言
Drosophila 的嗅觉感受神经元（ORNs）可响应大量气味分子，这些气味分子具有不同长度的碳链以及多种官能团，包括酯类、醇类、酮类、内酯类、醛类、萜类、有机酸、胺类、含硫化合物、杂环化合物和芳香族化合物2,3。具有不同理化特性的气味分子其挥发性差异显著，这可通过化合物的蒸气压来体现。值得注意的是，对 Drosophila melanogaster 具有生物学意义的气味分子在挥发性上存在巨大差异。例如，Ir92a 嗅觉神经元响应氨气4，该物质高度挥发，20 °C 时蒸气压为 6,432 mmHg。相比之下，Or67d 嗅觉神经元响应一种雄性信息素 cis-十三碳烯乙酸酯（cVA）5,6，其在 20 °C 时的蒸气压为 43 mmHg。
研究低挥发性气味物质的嗅觉反应时，使用传统的气味递送方法尤为困难，这类方法通过载气气流在相对较远的距离上传递气味物质（即 数厘米）。因此，对于同一种低挥发性气味物质，所报告的嗅觉反应可能会因气味递送系统的设计不同而存在显著差异。例如，Or67d 嗅觉受体神经元对高剂量气味物质的报告反应 cVA 范围约为 ~407 - >200 赫兹6此外，递送效率低下 c采用常规递送方法进行VA可能产生假阴性结果，从而导致解读为 c单独的VA不足以激活Or67d ORNs8这一解释随后受到另一项研究的质疑，该研究采用了一种近距离气味递送方法。9因此，开发一种可靠的递送系统以有效呈递低挥发性气味物质显得至关重要。
最近，我们鉴定出几种长链表皮脂肪酸是Or47b嗅觉神经元（ORNs）的配体，这些神经元位于4型触角毛状感器（at4）中。在这些长链脂肪酸气味分子中，我们发现棕榈油酸可作为促性信息素，通过激活Or47b嗅觉神经元促进雄性求偶行为。1然而，在另一项使用传统气味递送方法的研究中，月桂酸甲酯被发现能够引发Or47b嗅觉神经元的反应，而当棕榈油酸从相同距离递送时则未引发任何反应10与……相比 cVA，长链脂肪酸的挥发性更低，在25 °C时的蒸气压小于0.001 mmHg11长链脂肪酸气味物质本身挥发性极低，难以通过常规气味递送系统有效传递至触角，这可能是导致假阴性结果的原因。10这种不一致性凸显了传统气味递送系统在递送低挥发性气味物质方面的不足。先前研究已表明，果蝇表皮气味的有效递送需要气味源与靶组织之间保持近距离。6因此，为了在模拟果蝇在自然环境中可能感知到生物活性信息素的距离的同时，全面表征这些信息素的作用效果12,13我们一致认为，在操作过程中必须高度重视最小距离的要求。
我们的方法具有更多优势，包括与标准电生理设备和实验技术的兼容性。现有的设备配置只需进行极少的修改即可适配本实验方案，且大多数皮肤电导反应（SSR）步骤仅需微小调整。这使得熟悉SSR技术的研究人员能够轻松采用我们的方法。此外，我们的技术能够呈现低挥发性气味物质，并具有快速的起始和终止特性，从而将刺激呈现与神经元反应精确关联。最后，该硬件布局支持气味 cartridges 的快速更换，有助于在目标剂量范围内加快数据采集速度。
我们首先介绍参考电极和记录电极、成年果蝇血淋巴样溶液（AHL 溶液）、气味递送 cartridge 以及相应嗅觉仪的制备方法。随后讨论棕榈油酸气味溶液的配制，以及用于记录的果蝇准备工作。接着探讨选择用于记录的毛形感器的标准，并在展示本方法获得的代表性数据之前，更详细地检查气味 cartridge 的定位。最后，我们总结该技术的一些有用应用、常见问题及其解决方案。
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方案
1. at4 记录硬件的准备
- 使用拉针仪制备电极，采用硅酸铝玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.64 mm）。用精细镊子略微钝化参比电极的尖端，以便插入果蝇的唇基（i.e. 位于果蝇头部前端、口器上方的圆形板状结构）。
注意：本研究使用 7 日龄的野生型雄性果蝇（Berlin 品系）。两个电极均使用 AHL 生理盐水溶液14 作为电解液。 - 配制 1 L AHL 溶液：将 900 mL 去离子水与 6.312 g NaCl、0.373 g KCl、0.337 g NaHCO3、0.1120 g NaH2PO4、1.892 g 海藻糖ּ2H2O、3.423 g 蔗糖、1.192 g HEPES 以及 8.2 mL 1 M MgCl2 混合。用去离子水定容至 1 L，用 1 N NaOH 调节 pH 至 7.4，并使用真空驱动过滤系统对溶液进行灭菌。长期储存时，将 AHL 分装后保存于 4 °C。
注意：棕榈油酸的稳定递送依赖于各 cartridges 之间的一致性。每个 cartridge 必须以可重复的方式组装，这一点至关重要。 - 使用剃须刀片从 200 µL 移液器吸头尖端切去 0.9 cm，制成第一段 cartridge，长度为 4.1 cm；具体尺寸参见 图 1A。取另一个 200 µL 移液器吸头，从其尖端切去 1.7 cm，从底端切去 1.5 cm，制成第二段 cartridge，长度为 1.8 cm（图 1A）。使用尺子确保操作的可重复性。
- 使用 ⅛" 打孔器从滤纸中切割出圆片。
- 用镊子将滤纸圆片放置于第二段 cartridge 的尖端。目视确认 cartridge 尖端存在通气孔，允许空气通过。
- 将第一段和第二段 cartridge 按 图 1A 所示方式连接在一起。将第二段 cartridge 向下倾斜，以便对准准备好的样本（图 1B）。
- 将 cartridge 与气味递送管连接，后者安装在微操作器上。
注意：该设计允许 cartridge 向外旋转，便于更换（图 1C）。 - 设置一个质量控制器中的恒定加湿气流为 2 L/min，另一个质量控制器中的气味气流为 500 mL/min。
- 使用软件（参见 材料表），编程设定程序以递送持续 500 ms 的气味脉冲。
2. 棕榈油酸气味溶液的制备与递送
注意：Or47b 嗅觉受体神经元对cis-和trans-棕榈油酸均有响应。由于棕榈油酸在室温下不稳定，因此储备液需保存在 -20 °C，并在开封后一个月内使用。乙醇是溶解棕榈油酸的首选溶剂。
- 使用涡旋混合器将10 µL的cis-或trans-棕榈油酸储备液或稀释液与90 µL的100%乙醇在1.7 mL微量离心管中充分混合，进行十倍系列稀释。实验前每天新鲜配制棕榈油酸稀释液，并在当日内使用完毕。
注意：对于不溶于乙醇的气味物质，建议使用玻璃小瓶并配合其他类型的有机溶剂来配制气味稀释液。 - 使用P10移液器，将5 µL所需稀释浓度的cis-棕榈油酸溶液加入对应 cartridge 中的滤纸片上。
注意：最高剂量（10-1）含有450 µg化合物。对于trans-棕榈油酸溶液，应加入4.5 µL，以确保最高剂量（10-1）同样含有450 µg化合物。 - 为完全蒸发溶剂，将含棕榈油酸的cartridge置于真空干燥器中，在室温及7.59 mmHg压力下处理1小时。
注意：cartridge在室温下最多可使用4小时。
3. 准备 果蝇 用于便捷接触 at4 感觉刺 体内 电生理记录
注意：野生型果蝇（Berlin）在标准玉米粉培养基中，于25°C、12小时光照-12小时黑暗循环条件下培养。羽化后，果蝇按性别每十只一组进行分离，并以此分组方式饲养至7日龄 成年。雄性和雌性果蝇中的Or47b ORN均对棕榈油酸有反应。为简化实验，本研究仅检测了雄性果蝇。
- 组装果蝇记录载玻片：在玻璃载玻片上，用少量橡皮泥将一块盖玻片（18 × 18 mm2）固定，使其与载玻片形成约3°的夹角。在盖玻片内侧边缘以及载玻片正下方区域贴上双面胶带。每次记录当天均需更换新胶带（图2A）。
- 使用果蝇吸取器15将目标果蝇吸入导管中，然后将200 µL移液器吸头套在导管末端。同时向前轻弹导管并吹气，使果蝇移至移液器吸头末端。使用剃须刀片在果蝇身体下方稍低处以及果蝇上方约两个头长的位置切断。
- 用橡皮泥压实移液器吸头底部，推动果蝇向上移动，直至触角和唇基完全暴露（图2B）。为避免杀死果蝇，仅需加入足够暴露触角和触角芒的橡皮泥，以防止果蝇腹部受压。此外，应缓慢且轻柔地添加橡皮泥，避免突然收缩。通过观察触角或喙的运动来确认果蝇是否存活。
- 使用镊子操控容纳果蝇的移液器吸头，调整果蝇头部方向，使唇基朝向观察者的右侧。使用精细镊子沿盖玻片调整样本位置，直至触角的侧面紧贴带胶的盖玻片表面（图2B）。
- 将固定杆置于触角芒上，以将触角固定在双面胶带上，防止移动（图2B）。
注意：固定杆由硼硅酸盐玻璃毛细管经拉管仪拉制而成，并用橡皮泥固定位置（图2A）。 - 将样本置于记录装置的载物台上（图2C）。通过显微镜确认刚毛型感器清晰可见，位于触角第三节远端外侧边缘。
注意：理想情况下，感器应与背景形成清晰的轮廓，便于识别并利于记录（图3）。在此制备样本中，大多数可及的刚毛型感器属于at4型。 - 保持样本处于持续的加湿气流中（气流速率为2 L/min），气流通过独立的送气管从距离样本约2 cm处输送，方法如前所述2,15（图4）。
4. 记录 at4 刚毛中 Or47b 嗅觉受体神经元对棕榈油酸刺激的 at4 感觉器活性
- 将参考电极插入唇基（图3A）。为避免组织损伤，应迅速而平稳地将电极插入表面下方，使其接触角质层下的血淋巴。
- 缓慢降低记录电极，直至其进入目标感器的同一视野平面（图3B）。使用50倍物镜进行记录。
注意：由于刚毛状角质层较为坚硬，需将记录电极插入感器基部，该区域较宽，可提供更大的目标面积，从而降低电极被偏转的可能性（图3B，插图）。 - 在对感器施加气味刺激之前，需满足以下筛选标准；任何不符合这些标准的刚毛状感器均应舍弃，并选择其他感器替代。
- 观察到较高的信噪比（示例见图3C）。
- 观察到at4A和at4C神经元的可识别峰电位（图3C）。
注意：值得注意的是，at4B的峰电位振幅与at4A非常相似10，在无气味刺激的情况下难以区分。 - 观察到at4A神经元的基础放电频率约为或低于20 Hz。
注意：此标准专用于at4A，因为该神经元的基础放电频率高于锥形嗅觉受体神经元（basiconic ORNs）2。若基础放电频率显著升高，则提示在插入电极过程中神经元可能已受损。
- 将药筒连接至气味递送管。首先使用溶剂对照，然后按浓度由低到高的顺序依次使用气味物质。使用显微操作器将药筒移向样本，并确保药筒正对样本头部。从几毫米远处目视确认药筒正对触角（图4）。
注意：目标是使药筒开口正对触角，并将其置于目标组织附近。 - 确保气味药筒与右侧的记录电极相距1–2 mm，与下方果蝇样本载玻片相距约1 mm。
注意：在本实验所描述的装置中，气味药筒紧邻记录电极、参考电极和果蝇样本载玻片（图4）。
注意：注意药筒与记录/参考电极之间的距离，建议距离约为4 mm1。意外接触可能导致信号中断，并损坏记录电极尖端，从而损伤当前神经元并影响后续记录。
注意：考虑药筒与果蝇样本载玻片之间的距离。若触碰盖玻片，也可能导致记录电极移位，干扰记录。 - 在数据采集软件中按下"记录"按钮以开始记录。
注意：每次10秒的记录中，会向触角直接递送一次持续500毫秒的气味脉冲，具体操作如步骤1.9所述。 - 施加气味物质后，在更换为下一较高浓度的药筒前，应小心回撤当前药筒。重复此过程，直至完成整个剂量范围的测试。
注意：建议每只果蝇仅记录一个Or47b嗅觉受体神经元（ORN），以避免可能的适应效应。 - 每日记录结束后，用蒸馏水彻底冲洗记录电极。
- 使用市售的离线分析软件对数据进行分析和绘图。
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结果
本技术已成功用于测定棕榈油酸的反式（图5A）与顺式（图5B）异构体的相对功效。代表性数据表明，与顺式异构体相比，反式-棕榈油酸对Or47b嗅觉受体神经元（ORNs）具有更强的配体活性（图5C）。每只果蝇记录一个神经元，每条剂量-反应曲线记录12只果蝇，共记录24只果蝇。所有数据来自三次独立重复实验，每次实验记录8只果蝇。误差线表示标准误（s.e.m.）。
值得注意的是，气味盒开口与果蝇头部之间的距离对记录结果具有显著影响。为了在 Or47b 嗅觉受体神经元（ORNs）中引发对棕榈油酸的显著反应，我们将气味刺激物以约 4 mm 的近距离施加于触角处1（
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讨论
本文介绍了一种可稳健诱导并记录Or47b嗅觉受体神经元（ORNs）对棕榈油酸反应的实验方法。我们对传统的远距离气味递送方法2,7,10进行了改进，以解决信息素气味递送不足的问题。针对气味物质挥发性低的难题，我们采用气味 cartridges 进行递送，并将cartridge开口置于样品附近数毫米处。只要确保每个气味cartridge的结构和位置保持一致，该方案即可成为一种可重复地递送原本难以接触的气味物质的有效方法。
本文所述的近距离气味呈递方法相较于现有的气味递送技术具有重要意义。该方法可实现多种未来应用，包括不仅可用于筛选存在于毛形感器中的嗅觉受体神经元（ORNs）对其他低挥发性气味物质的响应，还可用于检测存在于任何类型感器中的嗅觉受体神经元的响应1。该方法通过气流脉冲实现信息素气味物质的高效递送，而无需通过物理移动携带气味物质的玻璃毛细管靠近触...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢叶 Zhang 在样本轨迹方面的帮助，以及张天祺在图片方面的协助。本工作获得了Ray Thomas Edwards基金会早期职业奖以及美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01DC015519）对C.-Y.S.的支持，以及美国国立卫生研究院（NIH）资助（R01DC009597 和 R01DK092640）对J.W.W.的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 准备设置 &和杂项材料 | |||
| 拉针仪 | Sutter Instruments 加利福尼亚州诺瓦托，美国 | P97 | 拉针仪 |
| 硼硅酸盐玻璃毛细管 | World Precision Instruments 萨拉索塔，佛罗里达州，美国 | 1B100F-4 | 用于制作固定杆 |
| 铝硅酸盐玻璃毛细管 | Sutter Instruments 加利福尼亚州诺瓦托，美国 | AF100-64-10 | 制作电极 |
| Superfrost 显微镜载玻片 | Fisher Scientific<昆虫依赖嗅觉来引导一系列对其生存至关重要的行为，例如觅食、躲避天敌、产卵和交配。已有大量具有不同挥发性的化学物质被鉴定为能够激活昆虫嗅觉受体神经元（Olfactory Receptor Neurons, ORNs）的天然气味分子。然而，由于传统气味递送方法难以有效呈现低挥发性气味物质，针对此类物质的嗅觉响应研究一直受到限制。本文介绍了一种可在活体单感器记录（Single-Sensillum Recording, SSR）实验中有效递送低挥发性气味物质的操作流程。通过缩短气味源与目标组织之间的距离，该方法可成功应用一些具有生物学意义但此前难以触及的气味物质，例如棕榈油酸——一种已被证实可激活与求偶及交配行为相关ORNs的兴奋性信息素¹。因此，本方法为研究昆虫嗅觉及信息素通讯提供了检测多种低挥发性气味物质的新途径。> 宾夕法尼亚州匹兹堡 美国 | 12-550-143 | 用于果蝇准备工作站 |
| 永久性双面胶带 | 苏格兰威士忌 美国明尼苏达州圣保罗 | NA | 用于果蝇准备工作站 |
| 直立显微镜 | Olympus 日本东京新宿 | BX51 | 用于记录装置 |
| Plastalina 油泥 | Van Aken 美国南卡罗来纳州北查尔斯顿 | B0019QZMQQ | 用于准备站并固定持握杆 |
| 带SFCA膜的快速流动一次性无菌过滤装置，0.45 mm | Nalgene 美国纽约州罗切斯特 | #156-4045 | 以灭菌AHL溶液 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| cartridge 材料 | |||
| 200 µL型移液器吸头 | VWR Radnor PA 美国 | 53508-810 | 制作气味 cartridges 和果蝇准备 |
| 滤纸 | 沃特曼 英国肯特郡梅德斯通 | 740-E | 制作气味 cartridges |
| 真空干燥器 | Cole-Parmer 美国伊利诺伊州弗农山 | VX-06514-30 | 挥发乙醇溶剂 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 气味物质材料 | |||
| 顺式-棕榈油酸 | Cayman Chemical 美国密歇根州安娜堡 | #10009871（CAS # 373-49-9） | Or47b 气味物 |
| trans-棕榈油酸 | Cayman Chemical 美国密歇根州安娜堡 | #9001798（CAS # 10030-73-6） | Or47b 气味物 |
| 乙醇 | Spectrum Chemical MFG. 新泽西州新不伦瑞克 美国 | E1028-500MLGL | 稀释棕榈油酸 |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
| 仪器设置材料 | |||
| 气味剂盒微操作器 | Siskiyou 格兰茨帕斯 俄勒冈州 美国 | MX130R | 用于定位嗅觉仪 |
| Flow Vision 软件 | Alicat 图森，亚利桑那州，美国 | FLOWVISIONSC | 用于控制流速的软件 |
| 质量控制器 | Alicat 图森，亚利桑那州，美国 | MC-2SLPM-D | 控制加湿空气的流速 |
| 质量控制器 | Alicat 图森，亚利桑那州，美国 | MC-500SCCM-D | 控制气味刺激的流速 |
| Clampex | Molecular Devices 美国加利福尼亚州森尼韦尔 | Ver. 10.4 | 数据采集软件 |
| 空气输送管 | Ace Glass 美国新泽西州维尼兰 | 8802-936 | 输送加湿空气 |
| 50X物镜 | Olympus 日本东京新宿 | LMPLFL50X | 记录装置 |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA 美国 | Ver. 10.4 | 用于峰电位分析的软件 |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics 美国俄勒冈州莱克奥斯韦戈 | Ver. 6.37 | 用于数据分析的软件 |
| 音频监测器 | ALA科学仪器公司 美国纽约州法明代尔 | NPIEXB-AUDIS-08B | 听觉报告单个峰电位 |
| 细胞外放大器 | ALA科学仪器公司 美国纽约州法明代尔 | NPIEXT-02F | 以增强电信号的幅度 |
| 阀门控制器 | Warner Instruments | VC-8 | 控制气味刺激阀门的开启 |
| 记录电极显微操作器 | Sutter Instruments 美国加利福尼亚州诺瓦托 | MP-285 | 放置记录电极 |
| 前置放大器 | ALA科学仪器公司 美国纽约州法明代尔 | EQ-16.0008 | 以增强电信号的幅度 |
| 示波器 | Tektronix 美国俄勒冈州比弗顿 | TDS2000C | 单个峰电位的可视化报告 |
参考文献
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546(2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
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