本方案描述了一种在水相环境中利用自组装肽与氨基酸溶液组合来溶解疏水性化合物的临床适用方法。我们的方法解决了疏水性治疗药物面临的一个主要局限，即缺乏安全、高效的溶解和递送手段以应用于临床环境。
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摘要
摘要
自组装肽（SAPs）是递送疏水性治疗药物用于临床应用的有前景载体；其两亲性特性使其能够在人体水性环境中溶解疏水性化合物。然而，自组装肽溶液的血液相容性较差（例如，低渗透压）限制了其通过静脉给药的临床应用。我们近期开发了一种通用型疏水性药物递送平台，该平台将自组装肽（SAPs）与氨基酸溶液（SAP-AA）结合，以提高药物溶解度并增加制剂的渗透压，从而满足临床应用的要求。该制剂策略已在三种结构不同的疏水性化合物——PP2、rottlerin 和姜黄素——中进行了系统验证，以展示其广泛适用性。此外，我们通过分析6种不同的自组装肽、20种天然氨基酸在高低浓度下的影响，以及两种不同助溶剂二甲基亚砜（DMSO）和乙醇的作用，考察了制剂组分变化对性能的影响。结果表明，该策略能够有效优化特定疏水性药物的组分，且所制备的抑制剂PP2在体内表现出明确的治疗功能 体外 和 体内本文概述了我们使用SAP-AA组合制备疏水性化合物的通用配方方法，并对溶解度进行分析，作为将这些配方用于更深入功能研究的初步步骤。我们提供了疏水性化合物姜黄素配方的代表性溶解度结果，并讨论了该方法如何作为未来生物学研究和疾病模型的通用平台。
引言
SAPs 是一类生物材料，已在再生医学中作为三维支架被广泛研究1,2,3,4然而，近年来由于其独特的生物学特性，它们被开发作为治疗药物递送的载体5,6,7,8SAPs 可自然组装成稳定的纳米结构9，从而为药物的包封和保护提供了一种手段。SAPs 具有两亲性，由特定排列的疏水性和亲水性氨基酸重复序列组成，可驱动其自发组装9,10 并使其能够在疏水和亲水环境之间起到媒介作用。因此，在疏水性药物的临床递送中——由于在水相环境中溶解度极低，这类药物在体内的生物利用度和吸收率通常非常低11,12 – 自组装多肽作为递送载体具有广阔的应用前景。此外，其序列模式还表明，可通过合理设计和工程化手段优化自组装多肽，以最大限度地与特定药物或化合物相容即，基于官能团）并进一步促进溶解性。
SAP 已被用作多种体外（in vitro）和体内（in vivo）环境中的有效药物递送载体13,14,15,16。它们还表现出良好的安全性和生物相容性。然而，由于 SAP-药物制剂的渗透压较低，无法用于临床环境中的静脉注射13。鉴于这一限制，我们近期开发了一种策略，将 SAP 与氨基酸溶液联合使用，以减少有毒共溶剂的使用并提高制剂的渗透压，从而增强其临床相关性。我们选择氨基酸是因为它们是 SAP 的基本组成单元，已在临床上被接受，并且与 SAP 联合使用时，可提高疏水性药物的溶解度，同时减少所需 SAP 的用量17,18。
我们通过构建一个多步骤筛选流程，并以Src抑制剂PP2作为疏水性化合物的模型，系统研究了SAP-AA组合作为疏水性药物增溶及递送的通用平台。在此过程中，我们考察了制剂中各组分变化的影响——最终测试了6种不同的SAP、全部20种氨基酸在两种不同浓度（低浓度和高浓度；低浓度基于现有临床应用中的浓度，高浓度则为每种氨基酸在水中最大溶解度的2倍、3倍或5倍）下的效果，以及两种不同的共溶剂——并筛选出能够溶解PP2的组合用于进一步分析。该药物制剂在细胞培养体系中表现出良好的递送效果，并在采用气管内和静脉注射的in vivo模型中同样有效。此外，我们的研究还涉及SAP-AA组合在水环境中增溶多种结构不同的疏水性化合物的广泛适用性；具体包括rottlerin和姜黄素18等药物。本文详细阐述了SAP-AA制剂的制备方法，并以姜黄素溶解度分析为例，展示了我们筛选流程中的首要步骤。本实验方案提供了一种简单、可重复的方法，用于筛选可溶解任意特定疏水性化合物的最佳SAP-AA组合。
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方案
1. 氨基酸溶液的制备
- 为每种氨基酸准备并标记两个50 mL锥形离心管（分别用于"低"和"高"浓度）。
- 准备一个盛有纯化水（25 °C时电阻率为18.2 MΩ·cm）的大体积2 L烧瓶。
- 计算达到目标浓度所需的每种氨基酸质量（以克为单位），并使用药匙将相应量的氨基酸称量至对应的50 mL离心管中。
注意：对于两种带负电荷氨基酸的"高"浓度溶液，使用PBS代替水。由于这两种氨基酸在水中的溶解度较低，无法进一步提高其浓度，而使用PBS有助于维持较低的pH值。此外，氨基酸溶液的最终体积按40 mL计算。所有氨基酸的浓度详见表3。在不同氨基酸之间转移时，务必清洗药匙以避免交叉污染。建议先用水冲洗，再用70%乙醇擦拭。 - 使用移液管向每个50 mL离心管中加入40 mL纯化水（或PBS）。盖紧管盖后涡旋振荡或剧烈摇动，直至完全溶解。也可使用水浴超声（室温，130 W，40 kHz）辅助溶解。
注意：以下氨基酸溶液对光敏感，应使用铝箔包裹避光：色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸（均含有芳香环结构）以及半胱氨酸（含有反应性-SH基团）。
2. SAP-AA 溶液的制备
- 为自组装肽准备 20 mL 闪烁瓶。针对每种自组装肽，每种配制好的氨基酸溶液各准备一个瓶子（每种组合均在单独的瓶子中进行）。
- 使用高精度分析天平（读数精度达 0.1 mg 或更高），将约 1 ± 0.2 mg 的肽称量至每个瓶子底部。称量后盖上瓶盖，并在瓶盖上记录肽的精确质量。
- 用移液器将适量的氨基酸溶液（按第 1 节配制）加入各含肽的瓶子中，以达到目标浓度的自组装肽（对于长度为 16 个氨基酸的长肽，浓度为 0.1 mg/mL；对于长度为 8 个氨基酸的短肽，浓度为 0.2 mg/mL）。
- 在室温下将瓶子置于水浴超声仪（130 W，40 kHz）中进行 10 分钟超声处理，确保瓶内溶液完全浸没于水浴中。
3. 药物-DMSO 或药物-乙醇储备液的制备
- 将1 mg药物（本实验中为姜黄素）与100% DMSO混合，另取1 mg与100%乙醇混合，制备两种储备液。
注意：由于姜黄素在不同溶剂中的溶解度不同，我们分别加入200 µL DMSO和400 µL乙醇，制得浓度分别为5 mg/mL和2.5 mg/mL的DMSO-姜黄素和乙醇-姜黄素储备液；但需注意，储备液的浓度应根据目标疏水性药物的性质进行调整。药物溶解度和有效生物浓度等因素在确定该浓度时至关重要。此外，请注意储备液在与SAP-AA溶液混合时（见第4节），DMSO和乙醇体系中的稀释倍数分别为100倍和50倍。根据所需制剂的数量，可能需要制备更大体积的储备液——此时应使用超过1 mg的药物。储备液可储存于-20 °C；使用前置于冰上解冻，并涡旋混匀。 - 涡旋振荡小瓶15秒，使药物完全溶解。
4. 药物制剂的制备
- 为每种配方准备干净的1.5 mL离心管。务必在管上标记预期的自组装肽、氨基酸（及其浓度）以及共溶剂。
- 向相应的离心管中加入10 µL药物-DMSO储备液，或20 µL药物-乙醇储备液。
- 向含有药物-DMSO储备液的已标记离心管中加入990 µL SAP-AA酸溶液，向含有药物-乙醇储备液的管中加入980 µL。由此制备出含1% DMSO或2%乙醇的1 mL药物制剂。
注意：根据本方案，所有姜黄素制剂的最终浓度均为0.5 mg/mL。若使用其他疏水性化合物和/或起始储备液浓度不同，则最终浓度会有所变化（见步骤3.1）。 - 剧烈涡旋振荡30秒，随后让制剂静置30分钟。
5. 溶解度测试
- 静置后，再次剧烈涡旋振荡30秒。
- 在14,220 × g条件下离心1分钟。
- 观察微量离心管底部是否有沉淀生成（通过肉眼观察）。
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结果
对于疏水性药物姜黄素，我们采用20种天然存在的氨基酸在低浓度下与一种自组装肽EAK16-II组合，制备了多种制剂，以验证该策略的可行性。我们还测试了以DMSO和乙醇作为共溶剂的制剂配方。总计制备了40种不同的姜黄素制剂，每种制剂含有不同的组分。需要指出的是，在此前使用Src抑制剂PP2的研究中，我们纳入了更多自组装肽（共6种）和氨基酸浓度（包括临床浓度及更高浓度）的选项，共产生了480种不同制剂。本研究中选择EAK16-II作为自组装肽时，已综合考虑了前述研究的结果趋势。各组分的浓度详见 表1, 表 2，以及 表3 作为参考。所有疏水性药物制剂均通过目视观察筛选药物溶解度，若溶液经离心后完全澄清且无任何沉淀物，则视为可溶。图1）。如果药物沉淀至管底，则视为不溶，不再进行后续测试。此外，溶解度需由两名不同操作者各自进行三次重复实验；若结果无法重现，则该制剂也被认为并非真正溶解。
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讨论
在制剂过程中，存在多个关键步骤和需要考虑的故障排除要点。首先，由于涉及多种组分和浓度，整个方案中多次进行涡旋振荡，以确保所有浓度均一且准确。某些高浓度的疏水性氨基酸溶液在涡旋后可能仍未完全溶解，此时可手动剧烈震荡以辅助溶解。同样，SAP-AA 溶液必须进行步骤 2.4 中所述的超声处理，因为自组装肽（SAP）本身容易发生聚集，而超声有助于打散 SAP 聚集体，从而获得更均一的溶液。其次，对于特定的疏水性药物，其在 SAP-AA 制剂中的储备浓度和终浓度应依据该化合物在生物学环境中的有效浓度来确定。因此，应相应调整本方案以反映该活性浓度。此外，药物载药能力也是一个需要考虑的重要因素；不同药物采用此策略时可能具有不同的载药能力，且每种 SAP-AA 组合根据其相容性可能支持不同量的药物负载。这凸显了筛选特定化合物最优 SAP-AA 组合的重要性。
与其它方法相比，使用本技术具有一系列优势；更具体而言，相较于仅使用自组装肽（SAP）进行化合物包封和潜在递送的传统方法，本技术具有显著优越性。如前所述，氨基酸已获得临床认可，将其添加至SAP配方中可提高渗透压，从而降低溶血活性，使得在临床场景...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院资助，资助项目编号为 MOP-42546 和 MOP-119514。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EAK16-I | CanPeptide Inc. | 定制多肽 | 序列：AEAKAEAKAEAKAEAK，N端乙酰化，C端酰胺化，>95% HPLC纯度 |
| EAK16-II | CanPeptide Inc. | 定制多肽 | 序列：AEAEAKAKAEAEAKAK，N端乙酰化，C端酰胺化，>95% HPLC纯度 |
| EAK16-IV | CanPeptide Inc. | 定制多肽 | 序列：AEAEAEAEAKAKAKAK，N端乙酰化，C端酰胺化，>95% HPLC纯度 |
| EFK8-II | CanPeptide Inc. | 定制多肽 | 序列：FEFEFKFK，N端乙酰化，C端酰胺化，>95% HPLC纯度 |
| A6KE | CanPeptide Inc. | 定制多肽 | 序列：AAAAAAKE，N端乙酰化，C端酰胺化，>95% HPLC纯度 |
| P6KE | CanPeptide Inc. | 定制多肽 | 序列：PPPPPPPKE，N端乙酰化，C端酰胺化，>95% HPLC纯度 |
| 丙氨酸 | Sigma-Aldrich | A7469-100G | L-丙氨酸 |
| 异亮氨酸 | Sigma-Aldrich | I7403-100G | L-异亮氨酸 |
| 亮氨酸 | Sigma-Aldrich | L8912-100G | L-亮氨酸 |
| 甲硫氨酸 | Sigma-Aldrich | M5308-100G | L-甲硫氨酸 |
| 脯氨酸 | Sigma-Aldrich | P5607-100G | L-脯氨酸 |
| 缬氨酸 | Sigma-Aldrich | V0513-100G | L-缬氨酸 |
| 苯丙氨酸 | Sigma-Aldrich | P5482-100G | L-苯丙氨酸 |
| 色氨酸 | Sigma-Aldrich | T8941-100G | L-色氨酸 |
| 酪氨酸 | Sigma-Aldrich | T8566-100G | L-酪氨酸 |
| 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G8790-100G | L-甘氨酸 |
| 天冬酰胺 | Sigma-Aldrich | A4159-100G | L-天冬酰胺 |
| 谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G8540-100G | L-谷氨酰胺 |
| 丝氨酸 | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-丝氨酸 |
| 苏氨酸 | Sigma-Aldrich | T8441-100G | L-苏氨酸 |
| 组氨酸 | Sigma-Aldrich | H6034-100G | L-组氨酸 |
| 赖氨酸 | Sigma-Aldrich | L5501-100G | L-赖氨酸 |
| 精氨酸 | Sigma-Aldrich | A8094-100G | L-精氨酸 |
| 天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A7219-100G | L-天冬氨酸 |
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G8415-100G | L-谷氨酸 |
| 半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C7352-100G | L-半胱氨酸 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | DMSO |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 277649-100ML | 无水 |
| 姜黄素 | Sigma-Aldrich | 08511-10MG | 疏水性药物，姜黄素 |
| rottlerin | EMD Millipore | 557370-10MG | 疏水性药物，rottlerin |
| PP2 | Enzo | BML-EI297-0001 | 疏水性药物，PP2 |
| 闪烁计数小瓶 | VWR | 2650-66022-081 | 硼硅酸盐玻璃，带螺旋盖，20 mL。用于称量多肽。 |
| Falcon 50 mL 圆锥形离心管 | VWR | 352070 | 聚丙烯，无菌，50 mL。用于氨基酸溶液。 |
参考文献
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