此处，我们展示了纵向研究的实用性 体内 小鼠激光诱导脉络膜新生血管形态学改变随访中的成像
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
激光诱导的脉络膜新生血管形成（CNV）是模拟年龄相关性黄斑变性（AMD）湿性形式的一种成熟模型。本方案不仅旨在指导读者了解如何通过激光诱导产生病灶以触发新生血管过程的技术要点，更着重于阐述通过多模态纵向分析所能获取的丰富信息 体内 随访期间的全程成像。
激光诱导的小鼠CNV模型通过半导体激光照射建立。多模态 体内 采用影像学技术监测脉络膜新生血管（CNV）的诱导、进展与消退。首先，在激光照射后立即进行谱域光学相干断层扫描（SD-OCT），以确认布鲁赫膜（Bruch's membrane）的破裂。随后 体内 使用荧光素眼底血管造影（FA）成像，通过脉络膜层面获取的一系列图像确认了Bruch膜损伤成功。在激光处理后的第5、10和14天，采用SD-OCT和FA对脉络膜新生血管（CNV）的增殖与消退进行纵向随访观察。基于FA图像对渗漏性CNV病灶进行简单且可靠的分级评估是 呈现。通过自动分割测量视网膜总厚度，结合在CNV部位手动应用标定测量视网膜厚度，可无偏倚地评估水肿的存在。最后，通过在脉络膜铺片上使用凝集素GS-IB4染色对CNV进行组织学验证。对染色图像进行阈值处理，并使用ImageJ计算凝集素阳性区域面积。
该方案在需要对CNV病理进行高通量式筛选的治疗学研究中尤为有用，因为它能够快速、多模态且可靠地对CNV病理及视网膜水肿进行分类。此外，高分辨率SD-OCT能够记录其他病理特征，例如视网膜下或视网膜内液体的积聚。然而，该方法无法实现从SD-OCT图像中自动分析CNV体积，后者必须通过人工完成。
引言
近三十年前，首次成功尝试利用氪激光在Long-Evans大鼠中模拟人类脉络膜新生血管（CNV）的病理特征1。此后，氪激光被用于破坏最常用的小鼠品系C57BL/6J的Bruch膜2,3,4。CNV诱导的成功率通过荧光素血管造影（FA）和组织学染色得以验证。光学相干断层扫描（OCT）等无创成像技术的快速发展推动了啮齿类动物临床前模型领域的进步。能够在同一只眼睛的多个时间点监测视网膜形态学变化，显著减少了实验动物的使用数量，并提高了实验研究的效率。CNV病灶的组织学评估相对直接，需要对激光照射部位周围的异常血管生长进行标记，获取图像，并使用图像分析软件进行面积/体积估算。相比之下，体内成像技术则引入了对CNV病理及其解释更为复杂的分析方法。
本文介绍了一种简单且相对快速的方法，利用荧光素血管造影（FA）、谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）以及自动化分割方法，在小鼠激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）模型中对CNV的诱导、进展和消退进行分级评估。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物均按照《眼科与视觉研究中动物使用 ARVO 声明》以及关于动物实验的欧盟指令 86/609/EEC 的规定进行处理，相关实验方案经芬兰动物实验委员会批准并实施监督。
1. 激光诱导的小鼠脉络膜新生血管模型 5
- 宏观检查动物眼睛是否存在任何异常。
- 称量小鼠体重。
- 根据动物体重计算并配制适量的麻醉剂，例如：右美托咪定（1 mg/kg）、氯胺酮（75 mg/kg）和蒸馏水（0.9% NaCl溶液）按1:1.5:2.5的比例混合，或氯胺酮（40–75 mg/kg）、赛拉嗪（5 mg/kg）和蒸馏水（0.9% NaCl溶液）按1:2.5:1的比例混合；对于20 g的小鼠，注射0.1 mL混合液。
- 通过腹腔注射麻醉剂。
- 将小鼠放回笼中，等待其进入麻醉状态。通过足底反射消失确认小鼠已充分麻醉。
- 确保使用激光安全个人防护装备。
- 打开裂隙灯和532 nm半导体激光器。
- 将小鼠从笼中取出，放置于加热垫上。
- 滴加一滴托吡卡胺以扩大瞳孔。等待3–5分钟，直至瞳孔完全散大（约3 mm）。
- 将小鼠置于裂隙灯载物台上。
- 在盖玻片上滴加一滴眼科用液体凝胶，用于压平角膜。
- 调整小鼠眼球位置，使视神经乳头位于中心。
- 将激光功率设为100 mW，持续时间设为100 ms，光斑大小设为50 µm。
- 将激光束聚焦于视网膜色素上皮（RPE）。
- 在避开视网膜血管的前提下，于视神经周围的4点、8点和12点位置分别对单眼进行三次激光照射。完成所有激光照射后检查眼底，确认无视网膜出血。对侧眼作为未激光照射的对照。
- 丢弃盖玻片，并将小鼠重新放回加热垫上。
- 在双眼各滴加一滴PEG凝胶滴眼液。
2. SD-OCT 6,7
- 将小鼠放入啮齿类动物定位装置中，并固定头部。
- 校准 SD-OCT 系统的镜头例如，Bioptigen/Leica Envisu R2200）对准眼睛以 体内 使用X轴和Y轴载物台控制器进行成像。
- 进行谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）以确认布鲁赫膜破裂：当SD-OCT完成对整个眼球的扫描后，手动将参考线移至激光照射部位。在激光照射区域，布鲁赫膜的破裂应清晰可见（参见 图1).
3. 荧光素眼底血管造影 7,8,9
- 将小鼠连同固定器一并取出，放置于FA系统上（例如，海德堡Spectralis HRA2）。
- 在眼底的激光灼伤区域聚焦，使用红外反射模式，并将视神经乳头置于视野窗口中央。
- 为一只20 g的小鼠皮下或腹腔注射0.1 mL的5%荧光素钠盐溶液。
- 聚焦于脉络膜层面。
- 从脉络膜焦点层面拍摄图像。
- 重新对焦至视网膜层面并拍摄图像。
- 等待30秒，然后重复步骤3.4-3.6。
- 将小鼠从固定器中取出，放置于加热垫上。
- 通过给予α2-拮抗剂阿替美唑（0.5 mg/kg，腹腔注射）逆转右美托咪定的麻醉作用，或等待动物自行从麻醉中恢复。
- 重复 在 在随访第5、10和14天对麻醉动物进行活体SD-OCT和FA成像。
4. CNV 分级
- 根据激光处理后第0天立即拍摄的OCT图像和脉络膜荧光素血管造影（FA）图像，对Bruch膜的损伤程度进行分级，标准如下：
0 - Bruch膜未受损
1 - Bruch膜成功损伤 - 根据视网膜荧光素血管造影（FA）系列图像中荧光信号动态变化所观察到的激光斑点渗漏情况，对脉络膜新生血管（CNV）的存在进行分级，标准如下：
0 - 视网膜外观正常
0.5 - 渗漏呈轻微染色
1.0 - 存在渗漏性CNV区域
注：可使用OCT成像进一步确认CNV的存在，或在FA结果不明确时进行辅助判断；若OCT图像中出现视网膜内液，则提示应进行CNV分级。
5. 视网膜厚度测量
- 使用自动分割软件进行视网膜厚度测量。应考虑总视网膜厚度，即从神经纤维层到RPE的各层厚度（健康测量位点），或到围绕损伤部位（激光处理位点）RPE所连成的假想线的厚度（另见图7）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
激光治疗后立即出现的气泡或视网膜下出血并不总是可见的。因此，谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对于确认布鲁赫膜的损伤尤为重要。 图1 展示了激光给药后不同时间点的OCT成像示例。
图1：眼底OCT en face视图（VIP图像）显示三个由白色、绿色和红色圆圈标出的激光区域。 OCT B-scan图像分别在激光前（基线）、激光后即刻（0天，箭头指向Bruch膜破裂部位）以及激光后5天、10天和14天...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
多模态成像为脉络膜新生血管（CNV）病理学评估提供了有价值的工具。本文介绍了一种包括荧光素血管造影（FA）、谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）和自动分割技术的成像方案，可用于快速、可重复且可靠的CNV病理学评估。激光处理后，可确认布鲁赫膜出现断裂。此外，该阶段使用SD-OCT还可立即可视化可能存在的视网膜内和视网膜下出血，这些因素可能干扰结果的判读。视网膜渗漏程度根据FA图像中的荧光素信号进行分级。SD-OCT的应用提供了对CNV病理更详细的描述。此外，在随访期间不同时间点进行的纵向SD-OCT分析揭示了仅依靠FA难以发现的病理变化的时间差异。
使用自动分割法测量总视网膜厚度。在脉络膜新生血管（CNV）诱导部位的视网膜厚度通过人工方式进行测量。通过组织学方法评估脉络膜平铺标本，并使用图像分析软件Image J测量新生血管化区域的面积。
视觉轴的适当透明度对于本方案的成功实施至关重要。角膜干燥和白内障形成是主要的干扰因素。因此，小鼠麻醉后，应持续使用人工泪液或凝胶对眼睛进行保湿，以维持角膜的正常水合状态。建议在麻醉诱导后10分...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者 Symantas Ragauskas 博士是 Experimentica 公司的雇员（研究科学家）和股东，该公司提供使用本文所述的临床前 CNV 模型的合同研究服务。
作者 Eva Kielczewski 是生产本文所用 SD-OCT 系统的徕卡显微系统公司（Leica Microsystems）的雇员（研究应用工程师，OCT）。
作者 Joseph Vance 是生产本文章所用 SD-OCT 系统的徕卡显微系统公司（Leica Microsystems）的员工（北美 OCT 销售总监）。Joseph Vance 同时也是 Spective, LLC 的总裁兼执行董事。
作者 Simon Kaja 博士是 Experimentica 公司的顾问首席科学官及股东。Experimentica 是一家临床前合同研究组织，提供合同研究服务，包括本文所使用的临床前 CNV 模型。Simon Kaja 博士同时也是 K&P Scientific, LLC 的首席执行官，这是一家生命科学咨询公司；此外，他担任芝加哥洛约拉大学斯特里奇医学院眼科约翰·P·穆尔卡希博士与特蕾丝·E·穆尔卡希捐赠讲席教授。该安排的相关条款已根据芝加哥洛约拉大学的利益冲突政策进行审查并获得批准。
作者 Giedrius Kalesnykas 博士是 Experimentica Ltd. 的雇员（首席执行官）和股东，该公司提供使用本文所述的临床前 CNV 模型的合同研究服务。
致谢
作者谨此感谢 Yuliya Naumchuk（芝加哥洛约拉大学）和 Agne Žiniauskaitė（Experimentica 公司）在技术及视频拍摄方面提供的出色支持。Kaja 博士的研究项目得到了芝加哥洛约拉大学眼科 John P. 和 Therese E. Mulcahy 捐赠讲席教授基金的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 美托咪定（商品名 Domitor） | Orion | Vnr 01 56 02 | 麻醉剂 |
| 氯胺酮 | Intervet | Vnr 51 14 85 | 麻醉剂 |
| 0,9% NaCl | B Braun | 357 0340 | 麻醉剂 |
| 赛拉嗪（商品名 Rompun vet） | Bayer | vnr 14 89 99 | 麻醉剂 |
| 托吡卡胺 | Santen | Vnr 04 12 36 | 散瞳剂 |
| Viscotears | Alcon | Vnr 44 54 81 | 润滑剂 |
| Systane | Alcon | - | 润滑剂 |
| 5% 荧光素钠盐 | Sigma Aldrich | F6377-100G | 荧光剂 |
| 阿替美唑（商品名 Antisedan） | Orion | Vnr 47 19 53 | 麻醉剂 |
参考文献
- Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
- Tobe, T., et al. Evolution of neovascularization in mice with overexpression of vascular endothelial growth factor in photoreceptors. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 180-188 (1998).
- Seo, M. S., et al. Dramatic inhibition of retinal and choroidal neovascularization by oral administration of a kinase inhibitor. Am. J. Pathol. 154, 1743-1753 (1999).
- Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Prog. Retin. Eye Res. 29, 500-519 (2010).
- Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization. J Vis Exp. (106), e53502(2015).
- Giani, A., et al. In vivo evaluation of laser-induced choroidal neovascularization using spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 3880-3887 (2011).
- Gong, Y., et al. Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model in Mice. PloS One. 10, e0132643(2015).
- Sheets, K. G., et al. Neuroprotectin D1 attenuates laser-induced choroidal neovascularization in mouse. Mol. Vis. 16, 320-329 (2010).
- Hoerster, R., et al. In-vivo and ex-vivo characterization of laser-induced choroidal neovascularization variability in mice. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. Albrecht Von Graefes Arch. Klin. Exp. Ophthalmol. 250, 1579-1586 (2012).
- Sulaiman, R. S., et al. A Simple Optical Coherence Tomography Quantification Method for Choroidal Neovascularization. J. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. Ther. Off. J. Assoc. Ocul. Pharmacol. 31, 447-454 (2015).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
