基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

摘要

本文介绍了一种高效筛选方案，用于鉴定可促进胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞分化的 小分子化合物。该检测方法基于一种干细胞分化报告系统，其中增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的表达由人源GFAP启动子驱动。

摘要

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且致死率最高的原发性脑肿瘤，仅在美国每年就导致约14,000人死亡。即使在最大程度的手术切除、放疗和替莫唑胺化疗后，确诊后的中位生存期仍不足15个月。开发更有效GBM治疗方法所面临的挑战日益凸显，包括其顽固的侵袭性、对标准治疗的耐药性、遗传复杂性和分子可塑性，以及存在一群在表型上与正常干细胞相似的GBM细胞亚群，本文中称之为胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）。由于GSCs是肿瘤生长和进展所必需的，基于分化的疗法为这些无法治愈的肿瘤提供了一种可行的治疗策略。

以下方案描述了一套用于建立高通量筛选平台的流程，旨在鉴定能够促进胶质瘤干细胞（GSC）向星形胶质细胞分化的 小分子化合物。该系统的核心是一种胶质纤维酸性蛋白（GFAP）分化报告基因构建体。本方案包含以下主要步骤：（1）建立GSC分化报告细胞系；（2）检测并验证该报告系统与GSC自我更新能力/克隆形成能力的相关性；（3）基于高通量流式细胞术的药物筛选。

该筛选平台提供了一种简单且经济的方法，用于鉴定可促进胶质瘤干细胞（GSCs）分化的 小分子化合物。此外，利用经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物文库，有望快速发现可用于新适应症的药物。同时，促进肿瘤干细胞分化的疗法预计可与当前的“标准治疗”方案产生协同作用，后者已被证实主要靶向并清除分化程度较高的肿瘤细胞。

引言

近期研究表明，肿瘤中含有少量细胞，称为癌症干细胞（CSCs）或肿瘤起始细胞，这些细胞负责肿瘤的进展、转移以及对化疗和放疗的耐药性^1,2。肿瘤内癌症干细胞及其更分化的子代细胞的存在被认为是促进肿瘤内异质性的重要因素，因此构成了癌症治疗中的主要障碍³。由癌症干细胞理论提出的肿瘤细胞层级结构，推动了新型癌症治疗策略的发展⁴。靶向癌症干细胞的一种方法是识别并抑制在受累器官胚胎发育过程中必需的信号通路。事实上，我们及其他研究者此前已发表多篇论文，描述了Sonic Hedgehog和Notch等与神经干细胞相关的信号通路在胶质母细胞瘤中持续发挥作用^5,6,7。这些研究为多项胶质母细胞瘤（GBM）临床试验提供了理论依据。靶向癌症干细胞的第二种方法是促进其分化。该策略因使用维甲酸（ATRA，一种维生素A类似物）治疗急性早幼粒细胞白血病的临床前和临床研究取得良好效果而获得广泛支持。在此治疗中，ATRA被发现可解除成熟阻滞，促进癌细胞分化⁸。最近，Piccirillo及其同事精巧地证明，BMP-4可在体外和体....

方案

注意：星形胶质细胞和神经元慢病毒报告系统购自预包装的浓缩型慢病毒制剂。操作者需具备流式细胞术的基本知识。此外，为完整实施本方案，使用者需要能够使用具有高通量检测能力的流式细胞仪（可接受96孔板作为样品来源）。

1. 慢病毒转录报告系统

注意：在所有流式细胞术分析中，应使用亲本未转导细胞或载体转导（非荧光）细胞来确定基础荧光水平。此外，在所有需要机械吹打的步骤中，请务必轻柔操作。剧烈吹打可能导致大量脆弱的胶质瘤干细胞（GSCs）死亡，从而影响流式细胞术结果。

1. 在6孔板中，每孔加入2 mL完全神经干细胞培养基，接种1×10⁶个细胞。
2. 以感染复数（moi）为5的慢病毒报告载体转导细胞。
3. 加入2 µL聚凝胺，使终浓度为8 µg/mL。
4. 将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。
5. 次日，更换培养基以去除未结合的病毒，并将培养板放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续培养24小时。
6. 收集总体积中的0.5 mL；将细胞在15 mL锥形管中以360 × g离心5分钟（室温），吸除上清液；向剩余细胞中加入0.5 mL新鲜神经干细胞培养基，放回培养箱继续扩增。
7. 加入200 µL消化试剂，于37 °C孵育5分钟。
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结果

将三个独立的患者来源的神经球细胞系用慢病毒星形胶质细胞报告系统转导，该病毒编码与Zeocin抗性盒同框融合的绿色荧光蛋白（GFP），并由人GFAP启动子元件驱动（图1）。随后，通过在96孔板中以每孔0.7个细胞的密度接种来分离单个克隆（图2），接着通过流式细胞术测定表达GFP的细胞百分比（图3）。由单细胞衍生的神经球克隆中，GFP阳性细胞比例≤5%的被称为GL（GFAP低表达），而GFP阳性细胞比例≥75%的被称为GH（GFAP高表达），后者相较于GL亚克隆被认为具有更高的分化程度（图4）。

为了鉴定可能调控胶质瘤干细胞（GSCs）中星形胶质细胞分化的药物及信号通路，我们使用两套NIH临床化合物库进行了小分子药物筛选.......

讨论

尽管以往大多数关于GSC的研究主要关注定义这些细胞的标志物，但本研究中我们采用了相反的策略。我们主要关注GSC产生的分化后代（例如表达星形胶质细胞和神经元标志物的细胞）。在此，我们展示了基于人源GFAP启动子驱动GFP表达的细胞水平高通量药物筛选系统的应用。所有实验均采用患者来源的神经球型胶质母细胞瘤细胞系进行。有关这些细胞系分离与扩增的详细实验方案见Galli et al¹⁷。

该系统不仅帮助我们鉴定了能够诱导胶质瘤干细胞（GSCs）发生细胞分化的活性小分子，还通过比较GSC频率，明确证实了星形胶质细胞分化标志物GFAP的表达决定了单个胶质母细胞瘤（GBM）细胞的克隆形成能力。ELDA检测法由Yifang Hu和Gordon K. Smyth开发。建议读者阅读相关论文，以深入理解该检测方法的优势与局限性¹⁵。集落形成评分步骤高度依赖于细胞类型，可能需要根据所使用的细胞系进行相应调整。此外，通常情况下，我们以神经球直径≥100 µm作为判断其起源于具有克隆形成能力的GS.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ESGRO 完全型 Accutase	EMD Millipore	SF006
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
HBSS（Hank's 平衡盐溶液）	Sigma Aldrich	H6648
人 GFAP 分化报告基因（pGreenZeo，病毒）	SBI (System Biosciences)	SR10015VA-1
50 ml 无菌一次性试剂储液槽	Corning	4870
6 孔板	Thermo Fisher Scientific	130184
96 孔板	Falcon	353072
Biolite T25 cm² 透气培养瓶	Thermo Fisher Scientific	130189
Biolite T75 cm² 透气培养瓶	Thermo Fisher Scientific	130190
15 ml 离心管	Celltreat	229411
1.5 ml 微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129
Ovation 多通道移液器，12 通道，0.5 - 20 µL	VistaLab Technologies	1060-0020
Ovation 多通道移液器，12 通道，5-250 µL	VistaLab Technologies	1060-0250
Multi 12 通道移液器吸头 25 μl	VistaLab Technologies	4060-1002
Multi 12 通道移液器吸头 250 μl	VistaLab Technologies	4060-9025
Guava easyCyte 5HT 台式流式细胞仪	EMD Millipore	0500-4005
NIH 临床化合物库 1 和 2 小分子文库	Evotec
名称	公司	目录编号	备注
神经干细胞培养基的配制（500 mL）			终浓度
牛血清白蛋白（BSA）	GoldBio.com	A-421-250	0.20%
DMEM/F12 10X	Corning	90-091-PB	1X
肝素钠盐	Sigma Aldrich	H3149	0.0002%
HEPES 1M	Sigma Aldrich	H4036	5.4 mM
胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS-G）（100X）	Life Technologies	41400-045	1X
NaHCO3	Sigma Aldrich	S-5761	14.5 mM
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）100X	Gibco	15140-122	1X
孕酮	Sigma Aldrich	P8783	16 nM
腐胺	Sigma Aldrich	P5780	4.8 µM
碱性成纤维细胞生长因子（FGF2），人源	GoldBio	1140-02-50	10 ng/ml
表皮生长因子（EGF），人源	GoldBio	1150-04-100	20 ng/ml
瓶顶滤器，150 ml，33 mm，0.22 µm，聚醚砜，无菌独立包装	Corning	431160	用于过滤除菌培养基