我们报告了一种量化肌肉面积的方法，该方法是测定肌肉质量的间接手段 果蝇 成年个体。我们通过分析成年个体的间接飞行肌来展示本方法的应用 果蝇 强直性肌营养不良症疾病模型。
本文内容
摘要
摘要
肌肉质量减少，即肌肉萎缩，是一种常见的表型 黑腹果蝇 神经肌肉疾病模型。我们以果蝇的间接飞行肌（IFMs），特别是背纵肌（DLM）作为实验对象，用于测量由不同遗传因素引起的萎缩表型。在本方案中，我们描述了如何包埋果蝇胸部肌肉以进行半薄切片，如何获得肌肉与周围组织之间良好的对比度，以及如何处理光学显微镜图像以实现可量化数据的半自动获取与分析。我们介绍了该方法流程的三个具体应用：第一，展示该方法可用于量化强直性肌营养不良果蝇模型中的肌肉退变；第二，通过测量肌肉横截面积有助于鉴定促进或抑制肌肉萎缩和/或肌肉退变的基因；第三，该方案可用于判断候选化合物是否能够显著改变由致病突变诱导的特定萎缩表型 或由环境因素触发。
引言
果蝇的胸部包含两类不同的飞行肌，它们在功能、生理和解剖结构上均具有显著差异。这两类肌肉分别为：间接飞行肌（IFM），由背纵肌（DLM）和背腹肌（DVM）组成（图1），以及同步飞行控制肌1,2。这些肌肉共同产生飞行所需的高机械功率。间接飞行肌的大小、分布及其头尾方向的排列方式，使其易于进行横切面取样3（图2A）。基于此，我们选择这些肌肉作为研究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）肌肉萎缩的模型。
图1. 果蝇胸部示意图，显示间接飞行肌（IFMs）的排列结构。（左图）为胸部侧视图，（右图）为胸部横切面。间接飞行肌由背纵肌（DLM，红色）和背腹肌（DVM，绿色）组成。
保持组织结构的完整性以及控制组织学切片背腹轴方向的取向，对于准确评估肌肉横截面积至关重要。为保持肌肉结构，我们采用了一种经 Tomlinson 改良的固定液混合物 等4 此外，由于肌肉是内部组织，其不透性 果蝇果蝇的外骨骼会阻碍固定液渗透到目标组织。为解决这一问题，我们移除了果蝇的头部、足、翅膀以及腹部最后两个体节，以形成孔洞，使固定液能够进入。在固定程序中，我们加入了四氧化锇（OsO₄）处理步骤。4)5，因其能够固定脂肪（包括甘油三酯）而被广泛使用。OsO4 能极好地保存大多数结构，尤其在细胞学水平上，同时为图像提供良好的对比度。固定后 果蝇 胸部样品用树脂包埋，以进行横切面半薄切片（1.5 µm）。为增强对比度，组织可用甲苯胺蓝进行复染。使用10倍物镜拍摄完整的胸部图像，通过ImageJ软件对尺寸相同的图像进行二值化处理，并量化代表肌肉组织（黑色像素）的像素占总像素的百分比，以测定肌肉面积。
本方案中对组织制备和固定液成分的改进，例如提高四氧化锇（OsO4）和戊二醛溶液的浓度，实现了肌肉组织的独特保存效果。这是因为该方案避免了组织的降解和形变，使得即使在与强直性肌营养不良症（Myotonic Dystrophy, DM）等神经肌肉退行性疾病相关的严重萎缩条件下，样本的后续分析仍更为可靠。在最常见的类型——DM1型中，这种罕见的遗传性疾病由myotonic dystrophy protein kinase（DMPK）转录本中扩增的CUG重复序列引起。突变型DMPK RNA会聚集形成核内核糖核蛋白焦点（ribonuclear foci），进而隔离肌肉盲样核RNA结合蛋白（MBNL1-3；在Drosophila中称为Muscleblind, Mbl）6。我们通过在肌肉特异性肌球蛋白重链启动子（Mhc-Gal4）驱动下表达250个CTG重复序列，构建了强直性肌营养不良症的Drosophila模型。该模型果蝇丧失飞行能力，表现出典型的“上举翅”表型，并在其间接飞行肌（IFMs）中出现严重的肌肉萎缩（图2B）。我们实验室先前的研究表明，测定IFMs的肌肉面积是量化不同化学或遗传因素对模型果蝇肌肉萎缩影响的可靠方法7。例如，在肌肉中表达250个CTG重复序列的果蝇中过表达Mbl的C亚型，可恢复肌肉面积，因为Mbl因被隔离而导致的功能缺失是DM1发病的关键触发因素8（图2C）。在用Abp1喂养DM模型果蝇后，肌肉面积也得到恢复；Abp1是一种已证实具有抗DM1活性的六肽9（图2D）。
图2. 树脂包埋成年胸部标本背腹切片的定量分析 (A-D) 间接飞行肌的 黑腹果蝇 具有指定的相关基因型。（A）对照果蝇（yw）。（B）在肌肉中表达250个非编码CTG重复序列（UAS-CTG(250)x） 与对照组果蝇相比，DLMs 的肌肉面积减少。（C）通过过表达 Muscleblind（MblC）（UAS-CTG(250)x UAS-MblC）以及（D）喂食六肽 Abp1（UAS-CTG(250)x Abp1）可挽救该肌肉萎缩表型。所有图像中背侧均位于上方。转基因通过肌球蛋白重链启动子（Mhc）-Gal4 驱动至肌肉组织。（E）相对于对照组果蝇的肌肉面积百分比定量分析证实差异具有显著性。柱状图显示均值 ± 标准误（S.E.M.）**p<0.01 和 *p<0.05（Student's t-test）。比例尺： 200 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
本文所报道的方法将有助于专注于肌肉发育、维持与衰老、疾病病理学及药物测试的研究人员，因为它能够提供关于肌肉组织如何响应内源性和外源性因素的可靠信息。
方案
1. 固定与树脂包埋
- 使用二氧化碳（CO2）或冰块进行低温麻醉以麻醉果蝇。使用解剖显微镜（低倍镜以观察整只果蝇）和剪刀去除果蝇的腿、翅膀、头部以及腹部末端部分，以促进固定剂的渗透。此步骤中需小心操作尸体，避免胸部发生形变。
注意：每种基因型至少从12只果蝇开始，以确保在实验结束时获得足够数量处理得当的个体。 - 将尸体转移至含有200 µL溶液1的1.5 mL离心管中（每管最多放置6只），并置于冰上。
注意：尸体在溶液1中停留时间不得超过20分钟。- 溶液1的配制方法：按体积比1:1:1:1混合以下组分：4%多聚甲醛、8%戊二醛、0.2 M Na2HPO4 和 0.2 M NaH2PO4。
- 加入200 µL溶液2，在冰上孵育30分钟。
- 溶液2：将溶液1与OsO4按1:1（v/v）比例混合。
警告：OsO4具有极高毒性，操作时必须在通风橱中进行，并采取适当的安全防护和废弃物处理措施。
- 溶液2：将溶液1与OsO4按1:1（v/v）比例混合。
- 移除全部液体，加入200 µL溶液2，在冰上孵育1–2小时。
- 移除溶液，并通过梯度乙醇系列对样品进行脱水处理：依次在30%、50%、70%、90%乙醇中各处理一次，在无水乙醇中处理两次，每次5分钟。每次加入1 mL乙醇以完全覆盖样品。
注意：一旦组织进入90%乙醇，后续步骤可在室温下进行。 - 用丙烯酸甲酯处理样品两次，每次孵育10分钟。
警告：丙烯酸甲酯具有毒性，应在通风橱中使用。 - 用环氧树脂与丙烯酸甲酯按1:1（v/v）比例配制的混合液替换丙烯酸甲酯，室温孵育过夜。
警告：液态环氧树脂具有极高毒性。环氧树脂以四种组分（A、B、C和D）的形式提供。- 配制环氧树脂：在一次性烧杯中加入54 g树脂（A）、44.5 g固化剂（B）、2.5 g加速剂（C）和10 g增塑剂（D）。所有树脂组分均需在通风橱中混合。将树脂分装后储存于-20 °C（可保存长达6个月）或-80 °C（可保存数年）。
- 废弃树脂时，需在70 °C烘烤24小时，因固化的树脂无毒性。所有先前的溶液应根据适当的国际规程归入重金属类废弃物处理，因其可能含有OsO4残留。
- 用100%环氧树脂替换前一步的混合液，孵育样品4小时。
- 将尸体转移至含有新鲜树脂的塑料模具中（每个孔中放置一只尸体）。使用尖头木棒或针将尸体转移并调整其在孔中的方向，随后在70 °C的巴斯德烘箱中使树脂过夜聚合。
注意：为确保尸体在后续修块和切片过程中具有合适的方向，应使尸体侧卧，且其前端应非常靠近孔的边缘。
2. 区块的修整与切片
- 从模具中取出聚合后的树脂块。使用剃刀片修剪树脂，使围绕尸体的部分呈梯形，并在切片机中进行适当定向。从所有尸体的横缝之后开始切片，以获得可比较的结果。
注意：为了正确修剪样品，切片必须垂直于DLMs的前后轴（ 图3）。
图 3。强直性肌营养不良模型果蝇成虫胸部包埋树脂后的背腹切片。 在（A）中，样本修块不正确，因为图像右背侧部分的切面未完全与肌肉垂直，导致右上侧的三个肌束看起来比左侧的大。该错误将导致肌肉面积被高估。（B）来自正确修块的树脂块的切片。比例尺：200 µm。
- 使用超薄切片机切割1.5 µm厚的切片，并将切片转移至涂有明胶的载玻片上的水滴中。
- 为获得可比结果，所有样品均应取自中胸节段。
- 将带有切片的载玻片置于70–80 °C的加热板上，直至H2O完全蒸发。此时，样品可在锇酸（OsO4）染色对比下进行观察（图4A）。
3. 染色 IFM 切片
- 在加热板上用足量的甲苯胺蓝染色液覆盖切片，染色约 30 秒。
- 配制甲苯胺蓝染色液：将 1% 甲苯胺蓝和 1% 硼砂溶于 H2O 中。
- 用 H2O 冲洗切片，并将切片置于温热的加热板上使水分蒸发。若需增强对比度，可重复进行甲苯胺蓝染色（图 4B）。
图 4．经不同对比染色处理的树脂包埋成年胸部背腹切片。 两个图均显示了以 Abp1 饲喂的 DM1 模型果蝇的图像，饲喂条件如图 2D所示。（A）经 OsO4 对比染色的切片图像。（B）经甲苯胺蓝染色的切片可更清晰地显示肌束结构。比例尺：200 µm。
4. IFM 切片的封片
- 将载玻片置于加热板上干燥，直至 H2O 完全蒸发。
- 在切片上滴加 1 至 2 滴封片剂，然后加盖盖玻片。
注意：此步骤应在通风橱中进行，因为封片剂具有毒性。
5. 图像采集与肌肉面积定量分析
- 以低倍镜拍摄图像，确保整组DLM肌肉均处于焦点范围内。我们通常使用10倍物镜。
- 每个果蝇至少采集5张连续图像，每个实验组至少分析5只果蝇。
- 选择包含完整肌肉的图像（图 5A）。检查切片的轴向或方向，弃用方向不合适的样本，因其会扭曲结果（比较图3A与图3B，分别区分方向不良和方向良好的切片）。
- 使用 ImageJ 软件选择仅包含 DLMs 的区域（以像素为单位）图5A/5B）。为了比较不同实验组，应始终选择肌肉最大的果蝇作为参考区域。在所有待比较的不同基因型图像中，选取与参考区域尺寸相同的DLM区域图5B).
- 使用 Image-J 命令对图像进行二值化处理： 过程/二进制/生成二进制 并删除不对应于目标肌肉的区域或像素（图5C).
- 如果在肌肉以外的区域出现伪影黑点，请使用以下命令将其删除 绘图工具 并选择橡皮擦符号。
图 5．用于肌肉面积测定的图像分析流程。 （A）强直性肌营养不良1型模型果蝇胸部的横切面，矩形框内包含DLM。（B）选定区域，仅显示间接飞行肌和肠道（*）。（C）二值化图像。黑色区域对应目标肌肉。为准确量化肌肉面积，已将肠道部分擦除。比例尺：200 µm。
- 使用命令：分析/测量，并选择面积分数选项，定量分析肌肉组织（黑色像素）占总像素的百分比。该面积百分比即为每只果蝇DLM肌肉质量的估算值。
结果
为了定量分析MblC的过表达或Abp1的施用是否对强直性肌营养不良果蝇模型的萎缩表型产生任何影响，我们聚焦于间接飞行肌（IFMs）中的DLMs（图1）。我们发现，通过肌球蛋白重链（Myosin heavy-chain）启动子（Mhc）-Gal4在整个肌肉组织中驱动表达250个非编码CTG重复序列的模型果蝇，其肌肉面积比对照果蝇减少了50%。相比之下，使用相同驱动子共同表达MblC和扩增的CTG重复序列可显著抑制该表型，横截面肌肉面积达到对照（正常）果蝇的70%。在培养基中施用Abp1六肽同样抑制了萎缩表型，摄取该化合物的模型果蝇其肌肉面积约为正常果蝇的60%（而典型的DM1果蝇仅为50%；图2E）。对于这些样本的定量分析，我们采用甲苯胺蓝染色切片以增强对比度（图4和图5）。
我们注意到，在操作过程中，一些技术问题可能会显著影响最终的定量结果。常见的问题之一是树脂块修整不当，可能导致样品方向错误，从而对背长肌（DLM）进行斜切。其结果是，某些背长肌在一侧看起来比对侧更大（例如参见图3），这会为最终定量引入显著误差。另一个可能出现的错误是固定剂未能充分渗透肌肉组织（图6），导致组织降解和变形，使得肌肉面积的准确量化无法进行。
讨论
已有研究表明，Drosophila melanogaster 是研究人类神经肌肉疾病的一个有效模型7,10,11，包括以肌肉萎缩为特征的强直性肌营养不良症。本文所介绍的方案是一种用于量化果蝇模型中特定疾病发生或进展所导致的肌肉退变的有效工具。例如，通过在不同年龄的果蝇中进行此项分析，还可实现对肌纤维退变过程的追踪与定量评估。
该实验方案中存在若干关键步骤。在固定果蝇之前，解剖操作所需时间必须尽量缩短，以避免组织降解。为了使固定液充分渗透至肌肉组织（图6），必须去除果蝇的头部、翅膀和足部，以确保溶液能够进入果蝇体内。获取横切面时，必须确保目标肌肉完全可见。在对样本进行量化分析时，二值化处理尤为关键，需注意所选像素（黑色像素）应准确对应目标组织，并完整选中整个目标区域。
图6. 成年 Drosophila 胸部组织，由于固定液未能充分渗透肌肉（*），导致样品处理过程中组织发生降解和变形。比例尺：200 µm。
本方案中使用的一种试剂是OsO4，可极好地保存大多数结构，尤其在细胞学水平上，同时为图像提供对比度5然而，该方法的一个重要缺点是OsO₄的毒性4，必须始终在通风橱中使用，并需要安全操作和处置。该方案不仅通过固定和包埋步骤实现了对肌肉组织的准确定量，还可用于其他应用，例如电镜（EM）样品制备。然而，其存在固有局限性，即所获得的组织切片无法用于后续实验，如免疫组织化学检测。
最后，该方法还经过优化，可检测较小的肌肉面积差异，从而能够在基因或化学筛选中可靠地鉴定出修饰因子8,9。然而，肌肉面积增加并不一定意味着肌肉功能改善，因此横截面积的测定 ideally 应与飞行实验等功能性检测方法相结合12。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢转化基因组学组成员以及 Kathryn J Hanson 对本方案提出的反馈意见和改进建议。本项目由西班牙经济与竞争力部授予 R.A. 的研究基金 SAF2015-64500-R 资助，该基金包含欧洲区域发展基金。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Image-J 软件 | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 超薄切片机 | Leica | Leica UC6 | |
| 显微镜 | Leica | Leica MZ6 | 明场技术。 |
| 剃须刀片 | 电子显微科学公司 | 71970 | 存在多种替代供应商。 |
| 剪刀 | 世界精密仪器公司 | 14003 | 存在多种替代供应商。 |
| 包埋模具 | 电子显微科学公司 | 70900 | 存在多种替代供应商。 |
| 戊二醛 | Fluka (Sigma) | 49624 | 有毒。 |
| OsO4 | Polyscience | 0972A | 剧毒。 |
| 环氧丙烷 | Sigma Aldrich | 82320-250ML | 剧毒。 |
| 树脂（Durcupan） | Sigma Aldrich | 44611-44614 | 未聚合时具有致癌性。 |
| 甲苯胺蓝 | Panreac | 251176 | 有毒。 |
| 封片介质（DPX） | Sigma Aldrich | 44581 | 危险。 |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148-500G | 有害。 |
| Na2HPO4 | Panreac | 122507 | 0.2 M 稀释液。 |
| NaH2PO4 | Panreac | 121677 | 0.2 M 稀释液。 |
| 硼砂 | Panreac | 3052 | 有毒。 |
参考文献
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