光学横截面肌肉面积测定 黑腹果蝇 成体间接飞行肌

摘要

我们报告了一种量化肌肉面积的方法，该方法是测定肌肉质量的间接手段 果蝇 成年个体。我们通过分析成年个体的间接飞行肌来展示本方法的应用 果蝇 强直性肌营养不良症疾病模型。

摘要

肌肉质量减少，即肌肉萎缩，是一种常见的表型 黑腹果蝇 神经肌肉疾病模型。我们以果蝇的间接飞行肌（IFMs），特别是背纵肌（DLM）作为实验对象，用于测量由不同遗传因素引起的萎缩表型。在本方案中，我们描述了如何包埋果蝇胸部肌肉以进行半薄切片，如何获得肌肉与周围组织之间良好的对比度，以及如何处理光学显微镜图像以实现可量化数据的半自动获取与分析。我们介绍了该方法流程的三个具体应用：第一，展示该方法可用于量化强直性肌营养不良果蝇模型中的肌肉退变；第二，通过测量肌肉横截面积有助于鉴定促进或抑制肌肉萎缩和/或肌肉退变的基因；第三，该方案可用于判断候选化合物是否能够显著改变由致病突变诱导的特定萎缩表型 或由环境因素触发。

引言

果蝇的胸部包含两类不同的飞行肌，它们在功能、生理和解剖结构上均具有显著差异。这两类肌肉分别为：间接飞行肌（IFM），由背纵肌（DLM）和背腹肌（DVM）组成（图1），以及同步飞行控制肌^1,2。这些肌肉共同产生飞行所需的高机械功率。间接飞行肌的大小、分布及其头尾方向的排列方式，使其易于进行横切面取样³（图2A）。基于此，我们选择这些肌肉作为研究黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）肌肉萎缩的模型。

图1. 果蝇胸部示意图，显示间接飞行肌（IFMs）的排列结构。（左图）为胸部侧视图，（右图）为胸部横切面。间接飞行肌由背纵肌（DLM，红色）和背腹肌（DVM，绿色....

方案

1. 固定与树脂包埋

1. 使用二氧化碳（CO₂）或冰块进行低温麻醉以麻醉果蝇。使用解剖显微镜（低倍镜以观察整只果蝇）和剪刀去除果蝇的腿、翅膀、头部以及腹部末端部分，以促进固定剂的渗透。此步骤中需小心操作尸体，避免胸部发生形变。
   注意：每种基因型至少从12只果蝇开始，以确保在实验结束时获得足够数量处理得当的个体。
2. 将尸体转移至含有200 µL溶液1的1.5 mL离心管中（每管最多放置6只），并置于冰上。
   注意：尸体在溶液1中停留时间不得超过20分钟。
   1. 溶液1的配制方法：按体积比1:1:1:1混合以下组分：4%多聚甲醛、8%戊二醛、0.2 M Na₂HPO₄ 和 0.2 M NaH₂PO₄。
3. 加入200 µL溶液2，在冰上孵育30分钟。
   1. 溶液2：将溶液1与OsO₄按1:1（v/v）比例混合。
      警告：OsO₄具有极高毒性，操作时必须在通风橱中进行，并采取适当的安全防护和废弃物处理措施。
4. 移除全部液体，加入200 µL溶液2，在冰上孵育1–2小时。
5. 移除溶液，并通过梯度乙醇系列对样品进行脱水处理：依次在30%、50%、70%、90%乙醇中各处理一次，在无水....

结果

为了定量分析MblC的过表达或Abp1的施用是否对强直性肌营养不良果蝇模型的萎缩表型产生任何影响，我们聚焦于间接飞行肌（IFMs）中的DLMs（图1）。我们发现，通过肌球蛋白重链（Myosin heavy-chain）启动子（Mhc）-Gal4在整个肌肉组织中驱动表达250个非编码CTG重复序列的模型果蝇，其肌肉面积比对照果蝇减少了50%。相比之下，使用相同驱动子共同表达MblC和扩增的CTG重复序列可显著抑制该表型，横截面肌肉面积达到对照（正常）果蝇的70%。在培养基中施用Abp1六肽同样抑制了萎缩表型，摄取该化合物的模型果蝇其肌肉面积约为正常果蝇的60%（而典型的DM1果蝇仅为50%；图2E）。对于这些样本的定量分析，我们采用甲苯胺蓝染色切片以增强对比度（图4和图5）。

讨论

已有研究表明，Drosophila melanogaster 是研究人类神经肌肉疾病的一个有效模型^7,10,11，包括以肌肉萎缩为特征的强直性肌营养不良症。本文所介绍的方案是一种用于量化果蝇模型中特定疾病发生或进展所导致的肌肉退变的有效工具。例如，通过在不同年龄的果蝇中进行此项分析，还可实现对肌纤维退变过程的追踪与定量评估。

该实验方案中存在若干关键步骤。在固定果蝇之前，解剖操作所需时间必须尽量缩短，以避免组织降解。为了使固定液充分渗透至肌肉组织（图6），必须去除果蝇的头部、翅膀和足部，以确保溶液能够进入果蝇体内。获取横切面时，必须确保目标肌肉完全可见。在对样本进行量化分析时，二值化处理尤为关键，需注意所选像素（黑色像素）应准确对应目标组织，并完整选中整个目标区域。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Image-J 软件	美国国立卫生研究院		https://imagej.nih.gov/ij/
超薄切片机	Leica	Leica UC6
显微镜	Leica	Leica MZ6	明场技术。
剃须刀片	电子显微科学公司	71970	存在多种替代供应商。
剪刀	世界精密仪器公司	14003	存在多种替代供应商。
包埋模具	电子显微科学公司	70900	存在多种替代供应商。
戊二醛	Fluka (Sigma)	49624	有毒。
OsO4	Polyscience	0972A	剧毒。
环氧丙烷	Sigma Aldrich	82320-250ML	剧毒。
树脂（Durcupan）	Sigma Aldrich	44611-44614	未聚合时具有致癌性。
甲苯胺蓝	Panreac	251176	有毒。
封片介质（DPX）	Sigma Aldrich	44581	危险。
多聚甲醛	Sigma Aldrich	P6148-500G	有害。
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M 稀释液。
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M 稀释液。
硼砂	Panreac	3052	有毒。