Method Article

斑马鱼 RNASeq-based 基因表达数据的样品制备与分析

DOI:

10.3791/56187

⸱

October 27th, 2017

 ,  , 
1Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

In This Article

Summary

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该协议提出了一种从斑马鱼胚胎, 幼虫, 或排序细胞的整体转录分析的方法。我们包括 RNA 的分离, RNASeq 数据的通路分析, 和 qRT pcr 验证基因表达的变化。

Abstract

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分析全球基因表达变化是一个有价值的工具, 以确定新的途径的基础观察表型。斑马鱼是一个很好的模型, 快速评估整个转录从整个动物或单个细胞的数量, 由于 RNA 的容易分离, 从大量的动物。本文介绍了利用 RNA 测序 (RNASeq) 对斑马鱼胚胎进行全球基因表达分析的协议。我们描述的是从整个胚胎或细胞群中获得的 RNA 的制备方法。我们还描述了一种分析 RNASeq 数据的方法, 用以识别全球基因表达数据集的富集通路和基因本体 (GO) 术语。最后, 我们提供了一个协议, 以验证基因表达变化使用定量逆转录酶 pcr (qRT pcr)。这些协议可用于比较分析的控制和实验组斑马鱼, 以确定新的基因表达变化, 并提供分子洞察的表型的兴趣。

Introduction

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全球基因表达的比较分析是鉴别新基因的重要工具。这种分析通常依赖于对实验和对照样本的成绩单丰度进行定量评估。靶向方法, 如 qRT PCR 是相对快速和准确的调查单基因表达变化。RNA 测序 (RNASeq) 提供了一种宽泛的、无假设的方法来识别样本间基因表达的显著变化, 使之成为跨实验系统进行此类调查的标准。

斑马鱼已成为一个突出的模式, 在许多疾病地区。最初为他们的用途开发生物学研究, 由于他们的高繁殖力和相对地低维护费用, 试验性使用斑马鱼已经演变包括各种各样的表型从胚胎到成人阶段并且分子分析的宽数组1,2,3。事实上, 这些优势使分子机械研究迅速和 cost-effective, 因为容易获得大量的材料结合在一起, 在生活的所有阶段的遗传和环境操作的容易。此外, 斑马鱼的胚胎和幼虫的透明性质使它非常适合于生成细胞和组织特异的转基因报告线, 允许在体内离散细胞群的可视化4。利用此类线, 根据报告基因表达, 对特定孤立细胞类型进行全球基因表达分析。

在这里, 我们提出了一个全面的协议, 全球基因表达分析使用 RNASeq 后, 养殖斑马鱼胚胎。基因实验操作, 包括基于吗....

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Protocol

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下面概述的所有动物协议均符合并经马里兰大学动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准.

1. 胚准备

  1. 通过自然交配生成胚胎
    1. 培养胚胎到3月龄, 生殖成熟度 5 , 8.
    2. 在胚胎采集前, 将成年雄性和雌性鱼从所需的菌株分离到分离的交配槽中, 并在每个容器中添加2雄性和3雌性.
      注: 使用转基因的 insulin2a:mCherry 荧光报告株可以分析胰腺和 #946;-细胞.
    3. 将鱼转移到配有新鲜系统水的交配罐中, 并在第二天早上灯亮后立即移除分隔条.
    4. 允许鱼自然交配, 直到底部罐中的胚胎被观察到。以30分钟的间隔收集胚胎, 直到收集到所需的数量。将每个收集的时间点存储在28.5 和 #176 的胚胎培养基中的不同培养皿中; C.
    5. 在实验培养基中进行遗传物质或放置的显微注射 6 , 如果需要, 并培养新鲜的汉克和 #39 的胚胎培养基 8 在10厘米的 Petri 皿中28.5 和 #176;
      注: 对于吗 (MO) 注入或....

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Results

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差异表达基因的分类:

为了鉴别斑马鱼 Alström 综合征和 Bardet-Biedl 综合征 (BBS) 模型幼虫期的差异表达基因, 我们以alms1或bbs1的记录为目标, 将先前经过验证的拼接阻断 MOs 注入野生型斑马鱼胚胎16,17。在5天后受精 (dpf), 两个 RNA 复制从每个条件提取, 以及胚胎注射控制钼, 如上文3节所述。RNA 从每个样品被测序到深度的 ~ 1.2亿读与 ~ 1亿700万读排列对斑马鱼基因组。在85-90% 之间被排列的读映射到基因组的 exonic 区域。

在 Alström 模型中, 1348 总基因发生了显著变化, 471 总基因在 BBS.......

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Discussion

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本协议中描述的方法提供了一个相对快速和 cost-effective 的策略, 用于对整个动物或特定排序的细胞群进行转录分析。斑马鱼为这种类型的研究提供了一个有利的模式, 因为在产生大量的起始物质, 易于实施遗传或环境实验条件, 以及大量的可用性光谱的转基因记者线允许隔离细胞类型的特定和组织特定的群体。

虽然这里没有详细说明, 但这种方法可以很容易地容纳从幼鱼或成年鱼类收集的组织切片, 作为外地资产管制和收集的替代品。我们还开发了一个基本的后续分析策略, 它只依赖于使用基本的电子表格命令和预先存在的路径和 GO 数据库。这种方法的主要优点是易于访问, 而无需计算机编程或数据库管理方面的高级专门知识。因此, 该策略适用于所有背景的调查人员对大型基因表达数据集进行信息分析。

我们的方法结合了基本的斑马鱼胚胎和幼虫培养和标准 RNA 提取技术, 其次是 RNASeq。RNASeq 需要大量高质量的起动材料;一些供应商需要2µg 的总 RNA。因此, 稀有/罕见的细胞类型或个体胚胎分析是遥不可及的。然而, 在过去的五年中, 在低收益分.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了 R01DK102001 (N.A.Z.)、P30DK072488 (N.A.Z.) 和 T32DK098107 (T.L.H. 和 J.E.N.) 的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
商业试剂
TriZolThermo Scientific15596026裂解试剂
TrypLEGibco12604013解离缓冲液 1
FACSMaxGenlantisT200100解离缓冲液 2
DEPC 处理过的水Sigma95284
FirstStrand cDNA 转化Thermo ScientificK1621cDNA 转化试剂盒
2X SYBR Green 预混液罗氏4707516001qRT-PCR 预混液
FACS 缓冲液Fisher Scientific50-105-9042
氯仿Sigma Aldrich288306
乙酸钠Sigma AldrichS2889
名称公司目录号评论
斑马鱼菌株
TuebingenZIRCZL57
ins2a：mCherryZIRCZL1483
名称<strong>公司目录号评论
>设备
40微米细胞过滤器SigmaCLS431750
FACS管BD Falcon352063
血细胞计数器SigmaZ359629
解剖显微镜蔡
倒置显微镜蔡
NanodropThermo Scientific
Illumina HiSeqIllumina
LightCycler 480罗氏
配对槽 1.0L 交叉槽套装AquaneeringZHCT100
FACS 管 5 mL聚丙烯管BD Falcon352063
名称公司目录号<strong>Comments
Software
ExcelMicrosoft
共识路径数据库http://cpdb.molgen.mpg.de/
GO 富集分析http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis
司司

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  2. Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
  3. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.

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Tags

Zebrafish RNASeqGene Expression AnalysisRNA IsolationCell SortingqRT PCR ValidationPathway EnrichmentGO Term AnalysisDifferential ExpressionTranscriptome ProfilingEmbryo Staging

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