方法文章

斑马鱼RNA测序基因表达数据的样本制备与分析

DOI：

10.3791/56187

⸱

2017年10月27日

 ,  , 
1Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本方案介绍了一种从斑马鱼胚胎、幼体或分选细胞中进行全转录组分析的方法。我们包括了RNA的分离、RNA测序数据的通路分析，以及基于qRT-PCR的基因表达变化验证。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

全局基因表达变化的分析是识别与特定表型相关的新型通路的有力工具。由于可从大量个体中便捷地分离RNA，斑马鱼成为快速评估整体转录组（来自完整动物或特定细胞群体）的理想模型。本文介绍了一种利用RNA测序（RNASeq）技术对斑马鱼胚胎进行全局基因表达分析的实验方案。我们描述了从完整胚胎或通过转基因动物中细胞分选获得的特定细胞群体中提取RNA的方法。同时，本文还介绍了一种分析RNASeq数据的策略，用于识别全局基因表达数据集中富集的通路及基因本体（GO）术语。最后，我们提供了一种利用定量反转录PCR（qRT-PCR）验证基因表达变化的实验流程。这些方案可用于对照组与实验组斑马鱼之间的比较分析，以发现新的基因表达变化，并为感兴趣表型提供分子层面的解释。

引言

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全局基因表达的比较分析是识别参与特定表型形成的新基因的有力工具。此类分析通常依赖于对实验组与对照组样本之间转录本丰度的定量评估。针对特定基因的方法，如定量逆转录PCR（qRT-PCR），在单个基因表达变化的研究中具有较快的速度和较高的准确性。而RNA测序（RNASeq）则提供了一种广泛且无需预先假设的方法，可用于识别样本间基因表达的显著差异，现已成为各类实验体系中此类研究的标准方法。

斑马鱼已成为多种疾病研究领域的重要模型。最初因其在发育生物学研究中的实用性而被开发，由于其繁殖力高且维持成本相对较低，斑马鱼的实验应用已扩展至涵盖从胚胎到成体阶段的广泛表型，以及多种分子检测方法。1,2,3事实上，这些优势使得分子机制研究变得快速且经济高效，因为可以轻松获得大量实验材料，同时在生命各个阶段均易于进行遗传和环境操控。此外，斑马鱼胚胎和幼鱼具有透明特性，非常适用于构建细胞和组织特异性的转基因报告品系，从而实现 体内 离散细胞群体的可视化4利用此类细胞系可基于报告基因的表达，对特定分离细胞类型进行全基因表达分析。

本文介绍了一种利用RNA测序（RNASeq）对斑马鱼胚胎进行全基因表....

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方案

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以下所述的所有动物实验方案均符合马里兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定，并已获得其批准。

1. 胚胎制备

  1. 通过自然交配产生胚胎
    1. 将胚胎培养至3月龄，达到性成熟5,8。
    2. 在收集胚胎的前一晚，将所需品系的成年雄性和雌性鱼分隔放入交配缸中，每缸放入2条雄鱼和3条雌鱼。
      注：使用转基因insulin2a:mCherry荧光报告品系可实现对胰腺β细胞的分析。
    3. 将鱼转移到含有新鲜系统水的交配缸中，并在次日清晨开灯后立即移除隔板。
    4. 让鱼自然交配，直至在缸底观察到胚胎。每30分钟收集一次胚胎，直至获得所需数量。将每个时间点收集的胚胎分别置于含胚胎培养基的培养皿中，在28.5 °C下保存。
    5. 如需进行遗传物质显微注射或转入实验性培养基6，可将胚胎转移至新鲜的Hank's胚胎培养基8中，在10 cm培养皿中于28.5 °C继续培养。
      注：对于注射吗啉代（MO）或突变体动物的基因表达分析，需注意每种操作可能对基因表达产生非特异性影响。突变体可能在转录水平上出现遗传补....

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结果

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差异表达基因的筛选：

为了鉴定Alström综合征和Bardet-Biedl综合征（BBS）斑马鱼模型幼虫阶段差异表达的基因，我们通过向野生型斑马鱼胚胎中注射先前已验证的剪接阻断型吗啉代寡核苷酸（MO），靶向alms1或bbs1转录本16,17。受精后5天（dpf），按照上述第3节所述方法，从每种实验条件下以及对照MO注射的胚胎中分别提取两份RNA重复样本。每个样本的RNA测序深度约为1.2亿条读段，其中约1.07亿条读段比对至斑马鱼基因组。在比对上的读段中，有85%至90%映射到基因组的外显子区域。

Alström 模型中有 1,348 个基因的表达发生显著变化，BBS 模型中有 47.......

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讨论

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本方案所述方法为全动物或特定分选细胞群体的转录组水平分析提供了一种相对快速且经济有效的策略。斑马鱼是此类研究的理想模型，因其易于快速获得大量起始材料，易于实施遗传或环境实验条件，并且拥有大量转基因报告品系，可用于分离特定细胞类型和特定组织的细胞群体。

尽管此处未详细说明，该方法也可轻松适用于从幼年或成年鱼类中采集的组织切片，作为流式细胞分选和收集的替代方案。我们还开发了一种基本的后续分析策略，仅依赖于基础的电子表格命令以及现有的通路和GO数据库。该方法的主要优势在于易于获取和使用，无需具备高水平的计算机编程或数据库管理专业知识。因此，该策略适用于各种背景的研究人员对大规模基因表达数据集进行信息丰富的分析。

我们的方法结合了基础的斑马鱼胚胎和幼体培养技术，以及标准的RNA提取技术，随后进行RNA测序（RNASeq）。RNA测序需要大量高质量的起始材料；部分供应商要求至少2 µg的总RNA。因此，稀有或罕见细胞类型，以及单个胚胎的分析目前尚难以实现。然而，过去五年已在低产量样本分析、小样本量数据生成及低RNA投入量方面取得了显著进.......

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由 R01DK102001（N.A.Z.）、P30DK072488（N.A.Z.）和 T32DK098107（T.L.H. 和 J.E.N.）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
商用试剂
TriZolThermo Scientific15596026裂解试剂
TrypLEGibco12604013解离缓冲液 1
FACSMaxGenlantisT200100解离缓冲液 2
DEPC 处理水Sigma95284
FirstStrand cDNA 合成Thermo ScientificK1621cDNA 合成试剂盒
2X SYBR Green Master MixRoche4707516001qRT-PCR Master Mix
FACS 缓冲液Fisher Scientific50-105-9042
氯仿Sigma Aldrich288306
乙酸钠Sigma AldrichS2889
名称公司目录编号备注
斑马鱼品系
TuebingenZIRCZL57
ins2a:mCherryZIRCZL1483
名称公司目录编号备注
设备
40 微米细胞筛SigmaCLS431750
FACS 管BD Falcon352063
血细胞计数板SigmaZ359629
解剖显微镜Zeiss
倒置显微镜Zeiss
NanodropThermo Scientific
Illumina HiSeqIllumina
LightCycler 480Roche
交配罐 1.0L 交配罐套装AquaneeringZHCT100
FACS 管 5 mL 聚丙烯管BD Falcon352063
名称公司目录编号备注
软件
ExcelMicrosoft
Consensus Path DBhttp://cpdb.molgen.mpg.de/
GO 富集分析http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  2. Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
  3. Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.

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重印与许可

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标签

RNA RNA qRT PCR GO

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