用于固相合成含有2'- 0

摘要

本文提供了在C2'- O位上修饰的RNA的十二聚体的固相合成，纯化和表征的详细程序。 UV-vis和圆二色性光度分析用于量化和表征结构方面， 即单链或双链。

摘要

已经使用固相合成来获得特定于DNA或RNA的核酸的规范和修饰的聚合物，其已经成为各种领域和不同研究目的的应用的流行方法。本文所描述的过程集中于合成，纯化和RNA 5的十二聚体的表征" - [CUA CGG AAU CAU] -3"含位于C2'-ø -位零个，一个或两个的修改。探针基于2-噻吩基甲基，通过标准有机合成并入RNA核苷酸，并通过其各自的亚磷酰胺引入相应的寡核苷酸。本报告通过四种典型的核碱基（尿苷（U），胞嘧啶（C），鸟苷（G），腺苷（A））以及在2'- O-氨基酸修饰的2-噻吩基甲基官能化核苷酸，位置;然而，该方法适用于一个大的变量多年来一直发展起来的各种修改。在受控孔玻璃（CPG）载体上合成寡核苷酸，然后在标准条件下， 即氨和甲胺（AMA），然后是氟化氢/三乙胺/ N-甲基吡咯烷酮的混合物从树脂上裂解并脱保护。相应的寡核苷酸通过经由反相色谱（的Sep-Pak，C ₁₈ -column），接着洗脱，脱盐，并进行隔离聚丙烯酰胺电泳（20％变性）纯化。通过紫外 - 可见（UV-vis）和圆二色性（CD）光度分析分别评估定量和结构参数。本报告旨在为有兴趣参与这一领域的初学者和专家研究人员提供资源和指导。随着新技术和方法的发展，预计将作为一项正在进行的工作。对thi内的方法和技术的描述s文件对应于使用亚磷酰胺化学的DNA / RNA合成仪（在2013年翻新并购买）。

引言

固相合成，以获得DNA的寡核苷酸/ RNA是一个功能强大的工具，已经使用亚磷酰胺构建模块⁴自1970年代以来^1，2，3提供在各种领域中的应用的几个。其广泛的影响的例子包括:其在标记的影响（ 通过点击化学反应^）5，结构探测^6，和反义技术的^图7，以及其生物机制^8,9，源阐明作为遗传物质^10，和的研究各种天然的和/或化学修饰^11，12，许多others.The修改中，我们在这里使用代表了我们的努力，以获得含有RNA的寡核苷酸的第一步光活性探针，能够对这一重要生物聚合物的结构和功能进行时间​​控制。

具有序列5' - [CUA CG G A AU CAU] -3'/ 5....

方案

1. RNA寡聚核苷酸的固相合成

1. 制备含有亚磷酰胺的溶液（表1）。
   1. 计算核苷酸数量，并适合n + 1方程（其中n =核苷酸数目）对应于每个碱基，并填写缺失值的表格。体积= 0.15mL /核苷酸，浓度为0.1M，溶于无水乙腈。
   2. 将每个亚磷酰胺称量到烘箱干燥的10毫升琥珀色瓶（隔垫顶部琥珀色394阿米申13毫米ID×20毫米OD顶部）中，并使用含有干燥剂的干燥器立即置于真空下。
   3. 用干燥氩气填充干燥器，取出瓶子并立即用相应量的乙腈（无水）稀释，然后再固定在仪器上。
      注意:确保使用气密注射器，并始终保持无水的气氛。
   4. 从瓶子上取下隔垫并放在m上通过瓶子更换功能。
      注意:该方法需要在合成之前补充每个溶液0.15mL（因此在上述n + 1方程中的过量体积）引出线。
2. 使用软件设置序列和固相合成（ 图3 ）。
   1. 单击软件图标（ 例如 ，OligoNet 1.0.1），然后选择仪器名称>确定 。通过File> New Synthesis> Order创建一个新的综合。
   2. 填写日期runid为;选择仪器;序列名称序列（5'-to-3'end）。在|循环下，分配先前....

结果

描述了在C2'- O-位上含有0,1或2个2-噻吩基甲基修饰的RNA十二烷基化物的合成以及其相应的纯化和表征。此外，还包括通过CD进行的结构分析的详细描述。

通过固相合成获得四条RNA（包括具有互补序列的链），随后每个寡核苷酸的纯度在300-700nmol之间。通过脱盐〜150 pmol的每个样品进行质谱，然后沉积在平板上用于MALDI-TOF分析（ 图5 ）。通过每种溶液的紫外光度分析进行定量，而CD用于鉴定双链结构的形成并记录其相应的T _m。通过紫外 - 可见光谱法，无论比较单链样品还是双链体结构，经典和修饰的寡核苷酸之间没有观察到明显的差异。然而，在测量其CD光谱时观察到微小的变化（ 图6 ）。此外，三个双相结构的T _m测量显示了不同的值，其表示通过在其中一条链上引入.......

讨论

该手稿的目的是作为领域研究人员，初学者或专家的指导，成功实现或增强DNA或RNA寡核苷酸的合成。所描述的方法侧重于使用通过标准亚磷酰胺化学的自动化DNA / RNA合成仪的固相合成。该报告描述了RNA十二聚体的合成，纯化和表征的逐步描述。此外，使用CD来识别二级结构基序和热变性转变。

重要的是要注意，这项工作可以适应其他情况， 即固相合成中的各种品牌的设备，修改，保护基团和/或试剂。因此，改变在该过程中涉及的许多参数中的一个或多个或通过调节反应条件可以实现。一世此外，本文提供的详细结构分析（通过CD）预计将为该领域的研究人员提供一种替代方法，通常通过 UV-vis进行类似的分析。

以确定亚磷酰胺的固相合成的群众计算是基于以下所示的序列，并制备和在相同的运行纯化的四种寡核苷酸（加下划线的位置表示一个2'-O- -thiophenylmethyl修饰的存在） 。所有计算和值都包含在表1中
1 5' - [CUA C.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
AbsolveTM	珀金埃尔默	6NE9711
乙腈 99.9%，HPLC 级	Fisher Scientific	75-05-8
乙腈 99.9%，无水 DNA 测序	Fisher BioReagents	75-05-8
丙烯酰胺，99+%	ACROS 有机物	164850025
氯化铵 98+%	Alfa Aesar	12125-02-9
柠檬酸铵，氢二元 98%	Sigma Aldrich	3012-65-5
氟化铵  98.0%，ACS 级	Alfa Aesar	12125-01-8
氢氧化铵 28 - 30% 水溶液，ACS Plus	Fisher Chemical	1336-21-6
过硫酸铵	ACROS Organics	1444
氩-超高纯度	Airgas	7440-37-1
双丙烯酰胺 超纯	VWR-Amresco	172
硼酸	Fisher Scientific	A73-1
焦碳酸二乙酯，97%	ACROS 有机物	A0368487
乙醇，无水，组织学级	Fisher Chemical	64-17-5
乙二胺四乙酸，二钠盐脱水 100.2%	Fisher Chemical	6381-92-6
甲酰胺	Thermo Scientific	75-12-7
盐酸，36.5 - 38.0%，ACS Plus 认证	Chemical	7647-01-0
氯化镁六水合物，99%	Fisher Scientific	7786-30-3
甲醇，99.9%， HPLC 级	Fisher Chemical	67-56-1
甲胺 40% 水溶液	Sigma Aldrich	74-89-5
1-甲基-2-吡咯烷酮和水 99.5%	Aldrich	872-50-4
Opti-TOFTM 96 孔插件 （123 x 81 mm）	MDS SCIEX	1020157
RNase Away	分子生物制品	7005-11
无水乙酸钠 99.2%，ACS	Fisher Chemical	127-09-3
氯化钠，100.5%，ACS	Fisher Chemical	7647-14-5
磷酸二氢钠二水合物 99.0%	Sigma	13472-35-0
2'，4'三乙胺，99+%	Alfa Aesar	121-44-8
TEMED	Amresco	761
三氢氟化三乙胺，98%	Aldrich	73602-61-6
三氟乙酸，99%	Alfa Aesar	76-05-1
6'-三羟基苯乙酮一水合物 98%	Sigma Aldrich	480-66-0
Tris Base	Fisher Scientific	BP154-3
尿素	Fisher Scientific	U15-3
RNA合成试剂：
解封混合物，3%三氯乙酸的二氯甲烷溶液	Glen Research	40-4140-57
Cap Mix A，THF/吡啶/乙酸酐	Glen Research	40-4110-52
Cap Mix B，10% 1-甲基咪唑，溶于 THF	Glen Research	40-4120-52
活化剂，0.25 M 5-乙硫代-1H-四唑，溶于无水乙腈中	Glen Research	30-3140-52
氧化溶液，0.02 M 碘的 THF/吡啶/水	Glen Research	40-4330-52
U-RNA-CPG	Glen Research	20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG	Glen Research	20-3324-xx
Ac-G-CE 亚磷酰胺	Glen Research	10-3025-xx
U-CE 亚磷酰胺	Glen Research	10-3030-xx
Ac-C-CE 亚磷酰胺	Glen Research	10-3015-xx
Bz-A-CE 亚磷酰胺	格伦研究	10-3003-xx