本文展示了一种基于流式细胞术的定量测定人类自然杀伤细胞细胞毒活性的方法。
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摘要
摘要
在先天免疫系统中，一类称为自然杀伤（NK）细胞的效应淋巴细胞在宿主防御异常细胞方面发挥着关键作用，尤其能够清除肿瘤细胞和病毒感染细胞。目前已知约有30种单基因缺陷以及其他多种病理状态会导致功能性或典型性NK细胞缺乏症，表现为细胞毒活性降低或缺失。传统上，细胞毒性的研究依赖放射性方法，这类方法操作繁琐、成本高昂且存在潜在危害。本文介绍一种简化、适用于临床的基于流式细胞术的定量检测NK细胞细胞毒活性的方法。在该实验中，将外周血单个核细胞（PBMCs）或纯化的NK细胞样本以不同比例与对NK细胞介导的细胞毒性（NKCC）敏感的靶肿瘤细胞系共同孵育。靶细胞预先用荧光染料标记，以便将其与效应细胞（NK细胞）区分开来。孵育结束后，通过核酸染色剂识别被杀伤的靶细胞，该染色剂可特异性穿透死亡细胞。该方法既可用于诊断，也可用于科研，并且得益于流式细胞术的多参数检测能力，还可进一步深入分析NK细胞的表型与功能。
引言
自然杀伤（NK）细胞是一类复杂的人类先天性淋巴细胞亚群，在清除病毒感染细胞、转化细胞及其他病理性威胁中发挥关键作用1,2。NK细胞的溶细胞性颗粒中含有穿孔素和颗粒酶等细胞毒性蛋白。激活后，NK细胞与其靶细胞形成一种称为免疫突触的复杂相互作用，从而局部释放这些溶细胞分子，导致靶细胞直接发生裂解和凋亡，同时伴随细胞因子和趋化因子的释放，最终诱导炎症状态的产生1,3,4。
NK细胞的活化涉及NK细胞受体与靶细胞表面配体之间一系列复杂的激活性和抑制性相互作用，构成一个高度调控的系统。其中被研究得最为深入的NK细胞活化机制之一是"缺失自我"。事实上，当感染细胞或转化细胞表面缺乏主要组织相容性复合体I类（MHC）分子，即人类白细胞抗原（HLA）分子时，会触发NK细胞的细胞毒性作用。肿瘤细胞和病毒感染细胞通常会下调这些抗原的表达，以逃避免疫系统中T细胞介导的免疫应答，因而成为NK细胞的主要攻击目标1,3,4。
NK细胞功能的评估主要分为脱颗粒实验和细胞毒性实验。然而，脱颗粒实验（例如通过流式细胞术检测与脱颗粒相关的标志物CD107a）仅能反映NK细胞的活化状态，而不能反映其最终功能，即对靶细胞的直接杀伤作用5,6,7,8。因此，这一局限性促使研究人员倾向于采用细胞毒性实验作为更具指示性和更直接的替代方法。
长期以来，评估T细胞和NK细胞介导的细胞毒活性的"金标准"是铬释放实验（CRA）。CRA通过使用51Cr对靶细胞进行放射性标记，并将其与效应细胞共孵育。该实验基于细胞裂解会导致蛋白结合的51Cr释放到上清液中的原理，释放量可通过γ计数进行测定。尽管该方法有效，但由于多种原因存在诸多问题：材料成本高、需处理和处置放射性51Cr、51Cr的自发释放，以及标准化困难，使其整体上难以广泛应用9,10。
近年来已开发出多种非放射性检测方法作为细胞毒性放射性检测（CRA）的替代方案，这些方法涉及荧光标记、酶释放，甚至生物发光11,12,13,14。本文描述了一种基于流式细胞术的方法，用于检测自然杀伤（NK）细胞对K562靶细胞的细胞毒活性，该方法操作简便、灵敏度高且可重复。K562细胞是一种人红白血病细胞系，其HLA I类分子表达水平较低，而激活型NK细胞受体的配体表达升高，因此特别容易受到NK细胞介导的细胞毒作用的影响15。在本检测中，K562细胞预先用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记，并以不同比例与外周血单个核细胞（PBMCs）或纯化的NK细胞共培养1。CFSE是一种稳定的、可与蛋白质结合的荧光染料，可用于区分靶细胞与效应NK细胞16,17。共孵育后，使用一种可特异性穿透死亡细胞膜的核酸染料来识别被杀伤的靶细胞（见材料表）。随后通过流式细胞仪检测样品，以确定死亡（即染料阳性）的CFSE阳性靶细胞所占百分比。
该检测可用于单基因缺陷的常规诊断筛查，这些缺陷影响自然杀伤细胞（NK细胞）群体，目前已知约有30种此类缺陷可导致功能性或经典NK细胞缺乏症，以及原发性或继发性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症。此外，该检测还适用于反复发生严重疱疹病毒感染患者的NK细胞活性评估，造血细胞移植后或免疫调节治疗后的免疫重建评价18,19,20，以及多种基础科研应用。
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方案
样本采集遵循加州大学洛杉矶分校人类研究保护项目制定的伦理指南，并经机构审查委员会（IRB）批准。
1. 试剂的准备
注意：除非另有说明，所有试剂在使用前应于室温下平衡。所有试剂必须保持无菌。
- 使用 p20 移液器将 10 µL Tween-20 溶液加入 5 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 2 倍工作浓度的 Tween-20 溶液（即 0.2%）。
- 由于 Tween-20 黏度较高，为确保准确性，请采取以下步骤：缓慢吸取以避免产生气泡，不要将吸头完全浸入液体中以防止交叉污染，并在 PBS 中反复吹打数次，以彻底清洗吸头内的 Tween-20。
- 将 2 µL IL-2 原液（2.1E6 IU/mL）加入 198 µL 完全培养基（即 1:100 稀释），该完全培养基为含 1% 青霉素-链霉素和 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基，随后再进行一次 1:100 稀释，即将 2 µL IL-2 中间稀释液加入 198 µL 完全培养基中，配制 7 倍工作浓度溶液（210 IU/mL）。
- 将 2 µL CFSE 原液（5 mM）加入 500 µL 基础培养基（RPMI）中。充分涡旋混匀，短暂离心以去除管盖内液滴，随后再进行一次 1:20 稀释，即将 50 µL CFSE 中间稀释液加入 950 µL 基础 RPMI 培养基中，获得 2 倍工作浓度溶液（1 µM）。充分涡旋混匀，并避光保存。
2. 效应细胞的外周血单个核细胞分离
注意：该检测方法已验证可用于健康对照者的总外周血单个核细胞（PBMC）。然而，建议在每次制备PBMC时验证自然杀伤（NK）细胞的含量（图1）。此外，采集全血的体积应根据外周全血中NK细胞的频率确定，而该频率可能因人而异，尤其在健康供者与患者之间可能存在差异。
- 使用含钠或锂肝素的采血管采集至少 4 mL 的人全血。采集后将血液样本置于室温保存，并在采集后 30 小时内使用。
- 用 4 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）稀释全血（即加入与全血等体积的 PBS）。
- 向一个 15 mL 圆锥形离心管中加入 4 mL 密度梯度溶液（见材料表）。通过倾斜离心管，小心地将稀释后的全血覆盖于密度梯度溶液之上。
- 关闭离心机制动，以 650 × g 离心 24 分钟。
- 小心收集单个核细胞层（位于血浆和血小板顶层下方的薄白色层），转移至新的 15 mL 圆锥形离心管中。用 PBS 将体积补至 15 mL。
- 开启离心机制动，以 450 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于 0.5 mL 完全培养基中。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，并用完全培养基将 PBMC 浓度调整至 5×106 个细胞/mL。
- 通过流式细胞术检测 NK 细胞含量（见步骤 4）。
- 在 30 分钟内开始实验。细胞可在室温下放置不超过 10 分钟，或置于 37 °C、含 5% CO2 的加湿培养箱中，直至使用前。
3. 自然杀伤细胞作为效应细胞的分离
注意：本方案的这一部分是使用总PBMC作为效应细胞的替代方法。从健康个体的4 mL全血中分离NK细胞的典型得率约为4×105个细胞，约占PBMC的5–15%，但该比例在不同供体之间存在差异21。建议在分离后进行纯度检测。
- 使用含钠或锂肝素的采血管采集至少 4 mL 人全血。取 50 µL 全血用于富集前样本染色。
- 按 50 µL/mL 的比例向血液样本中加入富集试剂（见材料表）。充分混匀，并在室温下孵育 10 分钟。
- 加入等体积的 PBS + 2% FBS 以稀释样本，并轻轻混匀。
- 向 15 mL 圆锥形离心管中加入 4 mL 密度梯度溶液。小心地将稀释后的样本叠加在密度梯度介质上方。
- 以 1,200 × g 离心 10 分钟，关闭刹车。
- 小心收集富集后的细胞层至新的 15 mL 圆锥形离心管中。用 PBS + 2% FBS 将体积补至 50 mL，洗涤细胞。
- 以 300 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并重复洗涤一次。
- 吸除上清液，将细胞重悬于 0.5 mL 完全培养基中。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，并调整细胞浓度至 5×105 个细胞/mL。取 50 µL 纯化后的细胞悬液用于富集后样本染色。
- 将细胞在室温下保存不超过 10 分钟，或置于 37 °C、含 5% CO2 的加湿培养箱中，待使用时取出。
4. 用于评估NK细胞含量的免疫表型分析
- 使用总共 50 µL 的分离后 PBMC、富集前全血或纯化的 NK 细胞，用荧光染料标记的抗 CD56 抗体对细胞进行染色，以标记 NK 细胞。也可同时加入其他细胞类型和谱系的标记物（例如 CD3+ T 细胞、CD19+ B 细胞），以评估是否存在污染及其来源。
- 在 4 °C 下孵育 20 分钟，并加入 2 mL PBS + 2% FBS 进行洗涤。
- 以 450 × g 离心 5 分钟。
- 对于 PBMC 或 NK 细胞，吸除上清液，并将细胞重悬于 100 µL PBS + 2% FBS 中。
- 对于全血样本，进行红细胞（RBC）裂解：
- 离心后，吸除上清液，并将细胞重悬于 2 mL 红细胞裂解缓冲液中（含 31.75 g 氯化铵、4.16 g Tris 碱和 6.65 g EDTA，溶于 5000 mL 去离子水中）。
- 室温孵育 10 分钟。
- 重复洗涤两次，吸除上清液后，将裂解后的样本重悬于 100 µL PBS + 2% FBS 中。
注意：红细胞裂解也可在染色前进行。 - 随后进行流式细胞术分析。
5. K562 靶细胞的解冻、培养与收获
- 将10 mL完全培养基分装至15 mL锥形管中，并在37 °C水浴中预热。在K562细胞的解冻和培养过程中，所有步骤均须使用预热至37 °C的培养基。
- 将一支冻存的K562细胞冻存管放入37 °C水浴中，直至大部分细胞融化。
- 将部分融化的K562细胞转移至已预热至37 °C的完全培养基中（置于15 mL锥形管内）。用少量预热的培养基冲洗冻存管内壁，并将冲洗液加入15 mL锥形管中。
- 以140 × g离心7分钟（开启刹车），弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL完全培养基中。
- 取适量细胞悬液，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
- 将细胞浓度调整至1×105–2×105 个/mL ，并在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养至少2天后使用。维持培养密度在此范围内不超过3个月，之后应重新解冻新的细胞分装样品。 培养过程中细胞浓度切勿超过1×106 个/mL。
- 用于实验时，用10 mL移液管充分混匀K562细胞培养物，取适量细胞悬液，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板结合台盼蓝染色法进行细胞计数和活力检测。
- 若细胞活力低于85%，则进行以下去除死细胞的操作：
- 根据需要，向50 mL锥形管中加入15 mL密度梯度溶液。收集全部培养细胞，通过倾斜试管的方式，缓慢将细胞悬液铺于密度梯度溶液之上。
- 以650 × g离心24分钟（关闭刹车），小心收集上层活细胞至新的15 mL锥形管中，用PBS补足体积至50 mL。
- 以450 × g离心10分钟（开启刹车），弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL完全培养基中。进行细胞计数并检测细胞活力（同步骤5.7）。
- 在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养至少2天后使用。
- 若细胞活力低于85%，则进行以下去除死细胞的操作：
- 收集5×105个K562靶细胞，以140 × g离心7分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于含1% FBS的500 µL培养基中。
6. K562 靶细胞的标记
注意：在加入CFSE工作液之前，务必确保K562细胞充分重悬。
- 用移液器将500 µL CFSE工作液加入500 µL K562细胞中，终浓度为0.5 µM。使用同一支1000–1250 µL枪头，立即轻轻吹打混匀3–5次。
- 在37 °C水浴或37 °C、5% CO2培养箱中避光孵育10分钟。
注意：由于培养箱的温度平衡延迟时间比水浴更长，孵育时间可能需要调整，特别是当体积>1 mL时。 - 加入10 mL完全培养基，在室温下避光淬灭标记反应10分钟。
- 将标记后的K562细胞在140 × g离心7分钟，弃上清，用1 mL完全培养基重悬细胞。
- 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至1×105 个细胞/mL的完全培养基中。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中待用。细胞可在室温下放置不超过10分钟，或置于37 °C、5% CO2培养箱中待用。切勿冷藏。
7. 涂布
注意：如果 NK 细胞数量有限，可将 K562 细胞和 NK 细胞的浓度均减半，从而使一半数量的细胞用于铺板进行实验。只要细胞比例保持一致，使用一半数量的细胞仍可获得可比的实验结果。
- 若使用总PBMCs，标记一个96孔、U型底、组织培养处理过的板，每孔对应以下条件：(1) 效应细胞 (E) : 靶细胞 (T) = 50 : 1 + IL-2 — NK细胞杀伤活性的阳性对照；(2) E : T = 50 : 1；(3) E : T = 25 : 1；(4) E : T = 12.5 : 1；(5) E : T = 6.25 : 1；(6) T — 仅靶细胞 — K562细胞死亡的阴性对照；(7) E — 仅效应细胞；(8) T + Tween — K562细胞死亡的阳性对照
- 若使用纯化的NK细胞，标记一个96孔、U型底、组织培养处理过的板，每孔对应以下条件：(1) 效应细胞 (E) : 靶细胞 (T) = 5 : 1 + IL-2 — NK细胞杀伤活性的阳性对照；(2) E : T = 5 : 1；(3) E : T = 2.5 : 1；(4) E : T = 1.25 : 1；(5) E : T = 0.625 : 1；(6) T — 仅靶细胞 — K562细胞死亡的阴性对照；(7) E — 仅效应细胞；(8) T + Tween — K562细胞死亡的阳性对照
- 向条件3, 4, 5, 6, 7中各加入100 µL完全培养基。此步骤及后续所有步骤建议使用多通道移液器。
- 向条件1, 2, 3中各加入100 µL效应细胞（PBMCs浓度为5×106 个细胞/mL，或纯化NK细胞浓度为5×105 个细胞/mL）。通过连续稀释法向条件4–7中加入效应细胞。从一个条件转移到下一个条件时，不要更换吸头。
- 混匀条件3，取100 µL转移至条件4。
- 混匀条件4，取100 µL转移至条件5。
- 混匀条件5，取100 µL转移至条件7；条件6不含效应细胞。
- 向条件8中加入100 µL配制好的2倍浓度0.2% Tween工作液（终浓度为0.1% Tween-20）；条件8不含效应细胞。
- 向条件1中加入30 µL IL-2工作液。IL-2应在加入靶细胞悬液之前加入效应细胞悬液中（终浓度为27 IU/mL）。
- 向条件1, 2, 3, 4, 5, 6, 8中各加入100 µL靶细胞（标记的K562细胞，浓度为1×105 个细胞/mL）。条件7不含靶细胞。
- 使用多通道移液器混匀所有孔，并将板在120 × g下离心2分钟。
- 在37 °C、湿润的CO2培养箱中孵育4小时。孵育结束后，将板置于冰上，并在30分钟内进行活率染色。
8. 活性染色与样本采集
- 通过将3 µL的5 µM储备液加入600 µL的PBS中，制备死细胞染料（参见材料表）。
- 向每孔加入50 µL稀释后的死细胞染料，终体积为250 µL，终浓度为0.005 µM。使用多通道移液器充分混匀。
- 进行流式细胞术分析。使用流式细胞仪，在目标细胞门（图2）中至少收集1,000个事件，以获得具有统计学意义的结果。
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结果
在建立检测之前，强烈建议评估所选效应细胞群体中的自然杀伤细胞含量。 图1 显示NK细胞富集前（浅蓝色）和富集后（红色）典型的CD56染色结果。NK细胞在PBMCs中占比可达15%，富集后纯度应至少达到80%。
本实验中的流式细胞术分析涉及两个参数的检测：CFSE（可在与 FITC 相同的通道中检测）和死细胞染料（可在与 APC 相同的通道中检测）（图 2A、B）。数据采集后，采用 图 2 中的设门策略分析数据。将死亡（即死细胞染料阳性）的 K562 靶细胞从 CFSE 阳性群体中排除，从而获得靶细胞群中被杀伤细胞的百分比。
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讨论
本文所述方法为评估自然杀伤细胞（NK细胞）细胞毒活性提供了一种简单且经济的替代方案，可取代传统的51Cr释放试验。该方法比以往的标准方法（如CRA）更灵敏、更可重复，且耗时更短，适用于临床和科研应用。
尽管该检测可使用总PBMC或富集的NK细胞进行，但在处理采集的血量较少或患者样本中细胞数量少、质量差的情况下，无需纯化细胞群而直接使用PBMC是一项显著优势。该检测仅使用CFSE和死细胞排除法 viability 染料。仅通过分析这两个参数即可获得简洁且足以满足诊断需求的信息，同时避免了流式细胞术分析中额外的补偿设置。
该方法还可用于研究自然杀伤细胞（NK细胞）的基本生物学特性，并测试新型靶向NK细胞的治疗方法。在此方面，流式细胞仪不断扩展的检测能力为该实验带来了宝贵的灵活性，使得能够对NK细胞及其活性进行多参数分析，这是以往如CRA等实验方法所无法实现的。此外，还可提供在其他通道中发光的替代性细胞追踪和活力染料，以满足研究人员的需求。
本方案经过优化...
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披露
作者声明不存在经济利益冲突。
致谢
我们感谢加州大学洛杉矶分校免疫遗传学中心的Jill Narciso在手稿准备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（1x，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺） | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 培养基 | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| 热灭活胎牛血清 | Omega Scientific | FB-02 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-163 | 储存液浓度为 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | 由经 0.2 μm 滤膜过滤的乙腈和三氟乙酸溶液冻干而成，含牛血清白蛋白作为载体蛋白。用 500 μL 无菌 100 mM 乙酸溶液（含至少 0.1% 牛血清白蛋白）重悬至 100 μg/mL（2.1×10⁶ IU/mL） |
| K562 细胞 | ATCC | CCL-243 | 肿瘤细胞系 |
| T-75 细胞培养瓶 | Corning | 431464 | |
| CFSE 细胞增殖检测试剂盒 | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | 将一瓶用 18 μL DMSO 重悬，配制成 5 mM 储存液。避免反复冻融。 |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | 储存液为 5 μM 的 1 mL DMSO 溶液。DMSO 溶液可经受多次冻融循环而不发生试剂降解。 |
| 钠/锂肝素抗凝采血管 | BD | 02-687-95 | |
| U 型底 96 孔板 | Corning | CLS3897 | |
| 刻度移液管 | BD Falcon | ||
| 聚苯乙烯圆底试管（5 mL） | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL 聚丙烯锥形管 | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL 聚丙烯锥形管 | BD Falcon | 352097 | |
| 试剂储液槽 | USA Scientific | 2321-2230 | |
| 人 NK 细胞富集试剂盒 | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
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