需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

可逆性降温失活法研究行走猫大脑皮层对障碍物记忆的贡献

6.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/56196

⸱

2017年12月11日

 , 
1Cerebral Systems Laboratory, University of Western Ontario, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Western Ontario, 3Brain and Mind Institute, University of Western Ontario, 4Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 5Department of Psychology, University of Western Ontario

本文内容

摘要

在自然环境中需要四肢精细协调的复杂运动涉及顶叶皮层的多个区域。以下方案描述了利用可逆性冷却诱导失活技术，以证明顶叶第5区在行走猫的记忆引导下避障行为中的作用。

摘要

在复杂、接近自然的地形中，有关环境障碍物的感觉信息可用于快速调整运动动作以实现避障。例如，在猫中，关于即将出现的障碍物的视觉信息可以调节步态以实现避障。运动适应也可在无视觉参与的情况下发生，当腿部意外接触到障碍物时，突然的触觉输入能够调节四肢的步态以实现避障。这种复杂的运动协调涉及高级中枢结构，例如顶叶皮层。本方案描述了利用可逆性低温冷却诱导的皮层失活，来评估顶叶皮层在猫的记忆引导性越障运动中的作用。一种特殊形状的小型冷却环（称为冷冻环，cryoloops）可用于选择性地失活特定脑区，从而评估其对显性行为的贡献。此类方法已被用于阐明顶叶5区在猫的记忆引导性避障行为中的作用。

引言

在自然且不平坦的地形上，通过视觉或触觉获取的关于障碍物的感官信息可迅速调节运动以实现避障。这种精确协调的迈步动作涉及多个皮层区域1,2。例如，在执行障碍物规避等复杂运动任务时，运动皮层3,4和顶叶皮层5,6,7均被证实参与其中。在四足动物中，为实现避障所需的步态调整必须同时扩展至前肢和后肢。当前肢与后肢跨越障碍物之间的前进运动存在延迟时（例如动物在复杂、自然环境中谨慎行进并追踪猎物时可能发生的情况），有关障碍物的信息会保留在记忆中，用于在行走恢复后指导后肢跨越该障碍物。

旨在失活特定皮层区域的实验技术可用于研究皮层在记忆引导的越障运动中的作用。通过冷却诱导的皮层失活提供了一种可逆、可靠且可重复的方法，用于评估皮层对明显行为的贡献8。由不锈钢管制成的冷冻环（cryoloop）可根据目标皮层区域的形状进行定制，从而确保对特定脑区实现高度选择性和局限性的失活。植入后，通过冷冻环腔内泵入低温甲醇，可使冷冻环下方的皮层区域温度降至<20 °C。当温度低于这一临界值时，冷冻环正下方皮层区域的突触传递将受到抑制。这种失活作用只需停止甲醇流动即可迅速逆转。该方法已被用于研究皮层在感觉信息处理和多种行为中的作用9,10,11,12,13,14,15,16,17，以及在扫视眼动的运动控制18和记忆引导的越障运动19中的功能。

本实验方案的目的是利用可逆的冷却抑制技术，评估顶叶皮层区域在猫运动协调中的作用。具体而言，研究在有或无活跃顶叶皮层的情况下，猫基于记忆引导的越障行走行为。这些方法已成功用于证明顶叶5区在行走猫的记忆引导型避障行为中的关键作用19。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有操作均遵循《国家研究委员会实验动物护理与使用指南》（第八版，2011年）和《加拿大动物护理委员会实验动物护理与使用指南》（1993年）的规定，并已获得西安大略大学动物护理委员会动物使用小组委员会的批准。

以下步骤可应用于研究行走猫大脑皮层对运动控制贡献的实验。

1. 仪器设备

  1. 构建用于评估障碍物记忆的装置。
    注：该装置由一条长 2.43 m、宽 29 cm 的走道组成，走道两侧由高 18 cm 的透明丙烯酸壁封闭（图 1）。在装置中段设有一条窄缝，可通过安装在行走表面下方的杠杆将一块 25.8 cm 宽 × 3 mm 厚的障碍物升起或移出走道。
  2. 为确保动物的注意力持续集中在进食上，避免用手直接升起或降下障碍物。相反，实验者可使用腿部移动走道下方的杠杆来控制障碍物的升降，从而在操作过程中持续喂食动物。
  3. 妥善维护杠杆系统，确保障碍物的升起和降下过程无声。
  4. 使用一个小型 elevated 平台（23 cm 长 × 23 cm 宽 × 16 cm 高），在其上放置软质食物，以引导动物的运动行为。
  5. 使用安装在三脚架上的以太网摄像头（54 帧/秒），从距离走道中线 1.85 m 处对所有试验过程进行录像记录。

2. 训练步骤

注意： 为了成功获取数据，在行为测试之前需要进行一段时间的训练，以确保每只动物充分适应测试房间和实验装置。反复暴露于新环境有助于减少惊吓反应或其他应激行为。不同动物之间的适应过程可能存在差异，可能需要1-2个月的训练时间。初始适应阶段的训练时长最多可达5分钟，具体取决于动物进食的专注度和动机。后续训练阶段应逐步延长动物保持工作动机的时间（通常约为20-25分钟）。

  1. 从商业实验室动物繁育机构获取成熟的（>6月龄以上）短毛家猫，猫的体重和性别不限。
    注：在选择纳入研究的动物时，应以对食物奖励具有工作动机以及性情合作作为筛选标准。
  2. 使每只动物适应佩戴带有1米长牵引绳的背带，并将牵引绳固定在步道中点上方的架子上。
    注：此设置可使动物在装置中央区域自由行走而无牵引张力，从而鼓励动物停留在该区域。为移动的实验对象设定此类活动边界有助于实验操作。
  3. 将动物放置于步道上，允许其取食放置在平台上的软质食物。
    注：此阶段初步训练的目的之一是确保动物能够顺利跟随前移的食物平台，并能舒适地穿戴背带和牵引绳行走。 使用软质食物作为正向强化手段，有助于动物在整个训练或测试过程中保持专注，并营造舒适的实验环境。
  4. 确保动物适应操作处理，包括需要将其转移至步道起始区域的情况。

3. 行为训练与测试方案

注意：障碍记忆通过两种范式进行评估：视觉依赖性障碍记忆任务和触觉依赖性障碍记忆任务。在初始训练及后续测试中，应同时使用这两种范式。

  1. 视觉障碍记忆
    1. 为评估视觉障碍记忆，将障碍物升起至走道上（图2A）。将平台放置在障碍物的远端一侧。将动物置于走道的起始区域。
    2. 让动物向食物方向移动，仅用前肢跨过障碍物以从平台上取食。
    3. 当动物继续进食时，将障碍物降下，使其与走道表面齐平，以消除任何进一步的视觉或触觉刺激。
    4. 经过一段可变的延迟时间后，再次将食物向前移动，促使动物恢复行走；该延迟时间可短于1秒，也可长达2分钟。
    5. 重要的是，需进行障碍物缺失的试验，以防止动物对障碍物产生习惯化或形成习得性回避反应。在这些视觉障碍缺失试验中，确保在将动物放入走道起始区域前，障碍物未被升起至走道上。
    6. 观察在障碍物存在和缺失试验中动物后肢的跨步行为，以验证冷却前正常的运动行为及完整的视觉障碍记忆。确保动物能够无接触地越过障碍物，并且在障碍物存在的试验中，四肢的抬腿动作均显著升高。
      注：观看训练试验的视频可能有助于此验证过程。
  2. 触觉障碍记忆
    1. 为评估触觉障碍记忆，在将动物置于走道起始区域前，确保障碍物未被升起至走道上（图2B）。
    2. 让动物朝向放置在障碍槽远端一侧的食物平台行走。
    3. 当动物进食时，将障碍物从食盘下方升起至走道上，以避免动物获得障碍物的视觉信息。
    4. 当食物被向前移动时，应注意动物应在跨过障碍物前先以前肢接触到障碍物。
    5. 允许动物在前肢与后肢跨立障碍物的同时继续进食。在此期间，将障碍物降下，使其与走道表面齐平，以消除任何进一步的视觉或触觉输入。
    6. 经过一段可变的延迟时间后，再次将食物向前移动，以促使动物恢复行走。
    7. 重要的是，需进行障碍物缺失且无前肢接触的试验，以防止动物对障碍物产生习惯化或形成习得性回避反应。
      1. 在这些触觉障碍缺失试验中，让动物接近并从食物平台取食，操作如步骤3.2.1所述。然而，在步骤3.2.3中向前移动食物之前，先执行障碍物的升起与降下（步骤3.2.2），并确保在最终恢复运动（步骤3.2.5）前，存在一段类似时长的允许动物继续进食的延迟期（步骤3.2.4）。
    8. 观察在障碍物存在和缺失试验中动物后肢的跨步行为，以验证冷却前正常的运动行为及完整的视觉障碍记忆。

4. 视频分析

注意：为了评估障碍物记忆，在初始训练期间以及冷却环植入后的后续测试中，需对视觉和触觉范式下的每一步的最高步高、步态 Clearance 以及足尖与障碍物在步态最高点时的水平距离进行量化分析（图 2C）。

  1. 使用自行编写的脚本分析视频。
  2. 对于每次试验，通过标记每一步中距离相机最近的脚趾位置来追踪每只脚的运动轨迹。
  3. 测量每步轨迹最高点处脚趾与步道表面之间的垂直距离，作为峰值步高（图 2C）。
  4. 在存在障碍物的试验中，步过障碍物槽正上方时的步高减去障碍物高度，即为步过障碍物时的 Clearance（步过高度）。
  5. 此外，在存在障碍物的试验中，还需测量每步达到最高点时脚趾与障碍物之间的水平距离。
  6. 在冷却环植入前，通过验证存在障碍物试验中的峰值步高高于无障碍物试验中的步高，确认动物的障碍物记忆能力完好无损。

5. 冷却环（低温环）植入

  1. 根据先前报道的手术方法，在双侧5区和7区上方植入冷冻环8（图3）。
  2. 简而言之，对每个半球，从霍斯利-克拉克坐标20 A15至A25处进行颅骨切开和硬脑膜切开，以暴露钩状沟与外侧沟的交界区域。
  3. 使用由23号不锈钢皮下注射管制成的单个冷却环，将其环部直接接触顶叶5区或7区的皮层表面，并准确定位。
  4. 用牙科丙烯酸树脂将每个冷冻环的基部固定于颅骨上，并通过不锈钢螺钉进行锚定。
  5. 用额外的牙科丙烯酸树脂封闭颅骨切口；将皮肤边缘拉至丙烯酸树脂边缘并缝合固定。

6. 皮层冷却方案

  1. 实验设置
    注意：在将动物带入测试室之前，需准备好并测试冷却回路。冷却回路由一个甲醇储液罐（带进液管，外径 3.2 mm，内径 1.6 mm）、往复式活塞泵和干冰浴组成，通过聚四氟乙烯管（外径 1.6 mm，内径 0.5 mm）连接；图 4。此外，还需要一个数字温度计。
    1. 在冰浴中向 200 mL 甲醇加入 500 cc 干冰。将管路两端紧密套在假体冷冻环的进、出口上，以完成冷却回路。
    2. 使用由两个公头热电偶连接器和热电偶导线组成的电缆，将热电偶插头连接至数字温度计，以实现连续温度监测。确保该电缆长度足够，当一端插入温度计时，另一端可延伸至动物头部。
    3. 使用开关打开活塞泵。
      注意：甲醇应从储液罐中被吸入，经泵输送至干冰浴，在管路中流动的甲醇将被冷却至 -75 °C。冷却后的甲醇随后离开冰浴，流经连接的冷冻环，再返回甲醇储液罐。
    4. 确保泵的设定、冰浴内管路长度以及从冰浴到假体冷冻环的管路长度均处于最佳状态，使假体冷冻环的温度能够稳定在约 -5.0 °C。
      注意：在初始设置过程中达到的此类温度通常已足够，当使用相同系统冷却植入式冷冻环时，可实现 3.0 ± 1.0 °C 的测试温度。若冷却效果不足，可通过调节泵速、增加浸入冰浴中的管路长度和/或缩短从冰浴到冷冻环的管路长度来解决。
    5. 如有必要，可通过将管端穿入管端接头并使用扩口工具对管端进行扩口，以延长一段管路。使用连接器将具有相同扩口端的所需长度管路连接。
    6. 确认所有连接紧密且无泄漏。完成初始设置后，关闭泵并移除假体冷冻环；此时回路已为测试动物准备就绪。
  2. 行为测试
    1. 将动物放置于测试装置上。将背带滑过动物头部，并将绑带紧实地固定在动物身上。连接牵引绳。
    2. 取下植入式冷冻环的保护帽，暴露其进、出口管。将管路两端紧密套在冷冻环的进、出口管上。将热电偶插头连接至数字温度计。
    3. 以视觉（步骤 3.1）或触觉（步骤 3.2）障碍物记忆试验开始测试。随后以随机顺序进行其余四种类型的试验（视觉障碍存在、视觉障碍缺失、触觉障碍存在、触觉障碍缺失）。
      注意：典型的测试会话包括一个“常温”试验区块，在不进行冷却的情况下观察基于记忆的障碍物回避行为，以建立基线测量值。
    4. 打开活塞泵，等待冷冻环温度达到 3.0 ± 1.0 °C（1–2 分钟）。随后在活塞泵开启后运行一个“低温”试验区块。在此试验区块期间，如需评估冷却区域对基于记忆的行为的贡献，请进行相应测试。确保在整个区块期间冷冻环温度维持在 3.0 ± 1.0 °C。
      注意：所有四种试验类型应在该区块中随机穿插进行。
    5. 在关闭活塞泵且冷冻环恢复至原始温度后，运行最后一个“复温”试验区块。
      注意：在此区块中重新建立基线步态行为。同样，所有四种试验类型应在该区块中随机穿插进行。
  3. 清理工作
    1. 行为测试结束后，从进、出口管上取下管路。注意管路末端可能残留滴落的甲醇，可能刺激动物。
    2. 确保重新安装保护帽。在将动物送回种群前，取下牵引绳和背带。使用管路切割器修剪管路末端（3–4 mm），以防止下次测试时连接处泄漏。

7. 验证冷却程度

  1. 行为测试结束后，使用已报道的技术8确认失活范围仅限于每个冷冻环正下方的皮层区域。
    注：可通过温差图谱法12或热成像相机13,14,19验证此结果。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

该方案已成功用于研究顶叶皮层在行走猫的障碍物记忆中的作用19。在本研究中，将冷冻环双侧植入三只成年（>6月龄）雌性猫的顶叶5区和7区上方（图5A）。在无冷却（温暖，对照条件）情况下，或当5区或7区被双侧失活时，对动物在触觉障碍物记忆范式中的表现进行评估。

该研究的代表性结果表明，当双侧冷却5区时，在存在障碍物的试验中，后肢迈步高度显著降低（图5D，蓝色）。在正常温度条件下，前导和跟随后肢的平均峰值迈步高度分别为9.5 ±2.2 cm和8.0 ±2.1 cm。单因素多变量方差分析显示，当5区被冷却时，前导和跟随后肢的峰值迈步高度分别显著降低至4.3 ±2.2 cm（p <0.0001）和3.4 ±1.4 cm（p <0.0001）。在存在障碍...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本研究所采用的实验范式利用冷冻环（cryoloop）对猫大脑皮层特定区域进行冷却抑制，以研究记忆引导下的避障运动。视觉与触觉障碍记忆范式对动物而言执行较为简单，因其利用了动物在受到移动食物源吸引时自然发生的、几乎无需刻意努力的运动行为。因此，训练阶段的大部分时间主要用于使动物适应测试环境及冷却设备。大多数动物需要多次穿戴背带并经由牵引绳固定后，才能在装置上自如、自然地行走。此外，在测试过程中，活塞泵发出的声音可能使动物分心或受惊。在初期训练时，可使用假冷冻环连接冷却回路并运行泵机，使动物逐步适应泵机运行的声音。尽管在测试前已进行充分训练，动物在测试过程中仍可能仅能维持有限时间的配合，随后便趋于焦躁。因此，在将动物带入测试室前，投入充足时间完成设备的正确设置与故障排查，将有助于优化后续的数据采集过程。

难以达到足够冷却效果时，可通过调节泵速来解决。但需注意，泵速增加可能导致压力上升，从而使管道从冷冻环的进液口或出液口脱开。另一种方法是增加浸入冰浴中管道的长度，以延长甲醇在管道内流动时的冷却时间。此外，应尽量缩短管道从冰浴出口到冷冻环之间的距离，以减少冷量损失。然而，该距离也必须足够长...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢加拿大卫生研究院、加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）以及加拿大创新基金会提供的支持。C.W. 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）颁发的亚历山大·格雷厄姆·贝尔加拿大研究生奖学金的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
相机IDS Imaging Development Systems GmbH型号：UI-5240CP-C-HQ
进样管Restek25306无法兰端浸入甲醇储液罐中，带法兰端连接至泵
泵Fluid Metering, Inc.型号：QG 150
Nalgene 杜瓦真空瓶Sigma-AldrichF9401
聚四氟乙烯管EzkemA051754
微型探针温度计Physitemp型号：BAT-12
带法兰管接头Valco Instruments Co. Inc.CF-1BK提供多种颜色用于颜色编码。包装中包含与接头数量相同的垫圈
垫圈Valco Instruments Co. Inc.CF-W1额外垫圈
法兰制作工具包Pro Liquid GmbH201553
管路连接器Restek25323
管路切割器Restek25069
热电偶公头连接器OmegaSMPW-T-M用于连接温度计的电缆
热电偶导线OmegaPP-T-24S用于连接温度计的电缆
MATLABMathWorksn/a

参考文献

  1. Drew, T., Marigold, D. S. Taking the next step: cortical contributions to the control of locomotion. Curr. Opin. Neurobiol. 33, 25-33 (2015).
  2. Takakusaki, K. Neurophysiology of gait: From the spinal cord to the frontal lobe. Mov. Disord. 28, 1483-1491 (2013).
  3. Drew, T. Motor cortical activity during voluntary gait modifications in the cat. I. cells related to the forelimbs. J. Neurophysiol. 70, 179-199 (1993).
  4. Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. The role of the motor cortex in the control of accuracy of locomotor movements in the cat. J. Physiol. 461, 1-25 (1993).
  5. McVea, D. A., Taylor, A. J., Pearson, K. G. Long-lasting working memories of obstacles established by foreleg stepping in walking cats require area 5 of the posterior parietal cortex. J. Neurosci. 29, 9396-9404 (2009).
  6. Lajoie, K., Andujar, J. -E., Pearson, K. G., Drew, T. Neurons in area 5 of the posterior parietal cortex in the cat contribute to interlimb coordination during visually guided locomotion: a role in working memory. J. Neurophysiol. 103, 2234-2254 (2010).
  7. Beloozerova, I. N., Sirota, M. G. Integration of motor and visual information in the parietal area 5 during locomotion. J. Neurophysiol. 90, 961-971 (2003).
  8. Lomber, S. G., Payne, B. R., Horel, J. A. The cryoloop: An adaptable reversible cooling deactivation method for behavioral or electrophysiological assessment of neural function. J. Neurosci. Methods. 86, 179-194 (1999).
  9. Lomber, S. G., Cornwell, P., Sun, J., Macneil, M. A., Payne, B. R. Reversible inactivation of visual processing operations in middle suprasylvian cortex of the behaving cat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2999-3003 (1994).
  10. Lomber, S. G., Payne, B. R. Contributions of cat posterior parietal cortex to visuospatial discrimination. Vis. Neurosci. 17, 701-709 (2000).
  11. Lomber, S. G., Malhotra, S. Double dissociation of 'what' and 'where' processing in auditory cortex. Nat. Neurosci. 11, 609-616 (2008).
  12. Lomber, S. G., Meredith, M. A., Kral, A. Cross-modal plasticity in specific auditory cortices underlies visual compensations in the deaf. Nat. Neurosci. 13, 1421-1427 (2010).
  13. Kok, M. A., Stolzberg, D., Brown, T. A., Lomber, S. G. Dissociable influences of primary auditory cortex and the posterior auditory field on neuronal responses in the dorsal zone of auditory cortex. J. Neurophysiol. 113, 475-486 (2015).
  14. Carrasco, A., Kok, M. A., Lomber, S. G. Effects of core auditory cortex deactivation on neuronal response to simple and complex acoustic signals in the contralateral anterior auditory field. Cereb. Cortex. 25, 84-96 (2015).
  15. Coomber, B., et al. Cortical inactivation by cooling in small animals. Front. Syst. Neurosci. 5, 53(2011).
  16. Malmierca, M. S., Anderson, L. A., Antunes, F. M. The cortical modulation of stimulus-specific adaptation in the auditory midbrain and thalamus: a potential neuronal correlate for predictive coding. Front. Syst. Neurosci. 9, 19(2015).
  17. Antunes, F. M., Malmierca, M. S. Effect of auditory cortex deactivation on stimulus-specific adaptation in the medial geniculate body. J. Neurosci. 31, 17306-17316 (2011).
  18. Peel, T. R., Johnston, K., Lomber, S. G., Corneil, B. D. Bilateral saccadic deficits following large and reversible inactivation of unilateral frontal eye field. J. Neurophysiol. 111, 415-433 (2014).
  19. Wong, C., Wong, G., Pearson, K. G., Lomber, S. G. Memory-guided stumbling correction in the hindlimb of quadrupeds relies on parietal area 5. Cereb. Cortex. , (2016).
  20. Horsley, V., Clarke, R. H. The structure and function of the cerebellum examined by a new method. Brain Behav Evol. 31, 45-124 (1908).
  21. Lomber, S. G., Malhotra, S., Hall, A. J. Functional specialization in non-primary auditory cortex of the cat: areal and laminar contributions to sound localization. Hear. Res. 229, 31-45 (2007).
  22. Johnston, K., Koval, M. J., Lomber, S. G., Everling, S. Macaque dorsolateral prefrontal cortex does not suppress saccade-related activity in the superior colliculus. Cereb. Cortex. 24, 1373-1388 (2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

皮层去激活冷冻环冷却顶叶皮层记忆引导的回避触觉障碍物视觉障碍物温度监测行为测试
可逆性降温失活法研究行走猫大脑皮层对障碍物记忆的贡献
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。