本实验方案的目的是通过选择性育种改变斑马鱼致死性骨骼突变表型的外显率。致死性突变体无法生长至成年并进行自交繁殖，因此本方案描述了一种通过子代检测在多代中追踪和选择外显率的方法。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼突变体的表型通常具有不完全外显率，仅在部分突变个体中表现出来。那些出现不一致的有趣表型可能难以研究，并可能导致混淆性的结果。本文所述方案是一种简单的繁殖策略，可用于提高或降低致死性斑马鱼骨骼突变体的外显率。由于致死性突变体无法直接进行选择性育种，因此采用经典的后代测交选择育种策略。该方法还包括竞争性等位基因特异性PCR（KASP）对斑马鱼进行基因分型，以及对幼体斑马鱼软骨和骨骼染色的实验步骤。应用此处描述的繁育策略，可提高特定骨骼表型的外显率，从而在后续实验中获得更可重复的结果。此外，通过这种选择性育种策略降低突变体外显率，有助于揭示最依赖于突变基因功能的关键发育过程。尽管本文重点讨论骨骼系统，但我们认为该方法适用于所有斑马鱼突变品系。
引言
斑马鱼是研究骨骼发育的强有力模型系统。利用斑马鱼突变品系，生物学家可以解析基因在骨骼发生过程中的功能。然而，斑马鱼骨骼突变体的表型可能存在可变的外显率1,2,3,4，这可能阻碍发育和遗传分析。本方法的目的有三点。首先，建立能够稳定产生严重表型的斑马鱼突变品系，可支持后续的发育学研究，如延时成像5和细胞移植6。若试图研究仅偶尔出现的表型，此类研究将受到严重限制。其次，通过近交繁殖斑马鱼品系可减少遗传背景的变异，从而提高实验的一致性和可重复性。例如，在同一经过选择性近交的品系上开展所有的原位杂交分析，可降低混杂性变异，增强结论的可靠性。第三，建立表型严重和轻微的品系，有助于揭示特定突变可能引发的完整表型谱系。
乍一看，对致死突变体进行选择性育种似乎是不可能的。当用于筛选的个体已经死亡时，如何根据外显率进行育种呢？幸运的是，基于家系选择（特别是后代测定）的选择育种方法已在畜禽育种项目中成功应用多年7,8
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方案
本方案中描述的所有实验均按照科罗拉多大学和俄勒冈大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的规定完成并符合其要求。
1. 准备未筛选的起始菌种
- 通过剪取鱼鳍并采用合适的方法（如KASP12,13,14）对全同胞动物群体进行基因分型，以鉴定目标突变等位基因的杂合子携带者11。本方案使用斑马鱼mef2cab1086品系进行。
- KASP基因分型
注意：KASP的等位基因特异性引物由试剂提供公司设计（参见材料表）。为获得适用于特定实时PCR仪的6-羧基-X-罗丹明（ROX）染料浓度，请访问该公司网站。- 将斑马鱼尾组织置于50 µL裂解缓冲液（10 mM Tris（pH 8.3），50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.3%非离子型表面活性剂，0.3% 辛基苯基-聚乙二醇）中。向96孔PCR板的每孔加入10 µL 10 mg/mL蛋白酶K，在55 °C热循环仪中消化2–5小时，随后在94 °C灭活20分钟。消化完成后将裂解产物冷藏。&#....
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结果
本方案是一种用于研究斑马鱼骨骼突变体的长期繁育技术（图1）。通过后代测试进行选择性育种，可在几代内使总体外显率出现向下或向上的变化（图2）。在我们之前的研究中，经过两轮选择性育种，平均外显率从17%降至3%1。类似地，在向上选育品系中，经过三代育种，平均外显率从63%上升至93%。如果经过四轮选择性育种后，外显率仍未出现向下或向上的响应，则表明所评估的表型可能对基于后代测试的选择性育种不敏感。
在成功的KASP实验中，计算机程序应能识别出与基因型相对应的样本紧密聚类，且在完成足够数量的循环后，阴性对照（NTC）应位于散点图的原点附近（图3）。如果KASP散点图数据未形成紧密聚类，或在一个NTC中检测到污染，则程序将无法确定基因型.......
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讨论
选择性育种揭示基因功能的细微差异
通过选择性育种使突变表型变得更严重或更轻微，是深入了解基因功能的一种直接方法。与非选择性育种的标准方法相比，本文所介绍的方案能够更全面地揭示突变表型的特征。具体而言，通过构建表型严重的品系，可以展现出突变表型的全部范围，包括那些在非选择性品系中无法观察到的表型，从而发现该研究基因在发育过程中新的功能角色。相反，构建表型轻微的品系则有助于揭示该基因最关键的生物学功能。例如，若在轻微突变体中仅存一种表型，那么该表型所对应的发育过程很可能最依赖于该基因的功能。因此，通过选择性育种可更完整地理解特定突变的全系列表型特征。
避免近交衰退
在许多动物和植物体系中，近亲个体的后代表现出生存能力和繁殖力的下降，斑马鱼即是其中之一20。这种现象被称为近交衰退，大多数模型认为其根本原因是基因座上隐性有害等位基因的纯合度增加，或在杂合状态下具有优.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Chuck Kimmel提供的指导，John Dowd在制定本繁殖策略过程中给予的帮助，Macie Walker在优化骨骼染色方法方面的工作，以及Charline Walker和Bonnie Ullmann在斑马鱼研究方面提供的有益建议。本研究工作由资助项目K99/R00 DE024190（资助给JTN）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 多聚甲醛，颗粒状，固体 | Ted Pella Co. | 18501 | 颗粒状PFA比粉末状PFA更安全 |
| 氯化镁，固体 | Acros Organics | 223210010 | |
| 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS），水溶液 | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof 乙醇 | |||
| 阿利新蓝，固体 | Anatech Ltd. | 867 | 必须来自Anatech |
| 茜素红，固体 | Sigma | A5533-25G | |
| 甘油，液体 | Fisher | BP229 1 | |
| 过氧化氢，液体 | Fisher | BP263500 | |
| 氢氧化钾， 固体 | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus 实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | ||
| 带条形码的MicroAmp快速光学96孔反应板（0.1 mL） | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' 密封膜 | BioRad | MSB1001 | |
| KASP预混液，高ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP定制引物混合液 | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl，固体 | Fisher | BP153 500 | |
| 氯化钾，固体 | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20，液体 | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| 蛋白酶K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100梯度PCR仪 | BioRad | 1861096 | |
| 可控滴加巴斯德吸管 | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | 用于DNA定量 |
参考文献
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K.
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