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方法文章

通过子代检测改变斑马鱼致死性骨骼突变体的外显率

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DOI：

10.3791/56200

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2017年9月1日

 , 
1Department of Craniofacial Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

本文内容

摘要

本实验方案的目的是通过选择性育种改变斑马鱼致死性骨骼突变表型的外显率。致死性突变体无法生长至成年并进行自交繁殖，因此本方案描述了一种通过子代检测在多代中追踪和选择外显率的方法。

摘要

斑马鱼突变体的表型通常具有不完全外显率，仅在部分突变个体中表现出来。那些出现不一致的有趣表型可能难以研究，并可能导致混淆性的结果。本文所述方案是一种简单的繁殖策略，可用于提高或降低致死性斑马鱼骨骼突变体的外显率。由于致死性突变体无法直接进行选择性育种，因此采用经典的后代测交选择育种策略。该方法还包括竞争性等位基因特异性PCR（KASP）对斑马鱼进行基因分型，以及对幼体斑马鱼软骨和骨骼染色的实验步骤。应用此处描述的繁育策略，可提高特定骨骼表型的外显率，从而在后续实验中获得更可重复的结果。此外，通过这种选择性育种策略降低突变体外显率，有助于揭示最依赖于突变基因功能的关键发育过程。尽管本文重点讨论骨骼系统，但我们认为该方法适用于所有斑马鱼突变品系。

引言

斑马鱼是研究骨骼发育的强有力模型系统。利用斑马鱼突变品系，生物学家可以解析基因在骨骼发生过程中的功能。然而，斑马鱼骨骼突变体的表型可能存在可变的外显率1,2,3,4，这可能阻碍发育和遗传分析。本方法的目的有三点。首先，建立能够稳定产生严重表型的斑马鱼突变品系，可支持后续的发育学研究，如延时成像5和细胞移植6。若试图研究仅偶尔出现的表型，此类研究将受到严重限制。其次，通过近交繁殖斑马鱼品系可减少遗传背景的变异，从而提高实验的一致性和可重复性。例如，在同一经过选择性近交的品系上开展所有的原位杂交分析，可降低混杂性变异，增强结论的可靠性。第三，建立表型严重和轻微的品系，有助于揭示特定突变可能引发的完整表型谱系。

乍一看，对致死突变体进行选择性育种似乎是不可能的。当用于筛选的个体已经死亡时，如何根据外显率进行育种呢？幸运的是，基于家系选择（特别是后代测定）的选择育种方法已在畜禽育种项目中成功应用多年7,8。这些项目主要用于对仅存在于单一性别中的性状进行选育，例如奶牛的产奶量或母鸡的产蛋量。这些物种的雄性个体无法直接测定性状，但可通过其后代的表现进行评估，并据此对亲本赋予相应的育种值。借鉴这一策略，本文所介绍的方案涉及对一对携带感兴趣突变基因的杂合子斑马鱼所产生的固定并染色的突变后代进行表型评分。在决定哪些个体将用于繁殖下一代时，将纯合致死突变后代中表型的外显率归于其亲本。我们发现，该方法在改变斑马鱼致死性骨骼突变体的外显率方面具有显著效果1。

与其他研究类似，本选择性育种方案考虑了窝产仔数、子代存活率、胚胎正常发育以及性别比例等因素9。然而，这些因素均是在突变背景的前提下进行考量，旨在改变突变的外显率。因此，本方案通过提供一种增强发育性突变分析能力并提高遗传背景均一性的方法，拓展了以往的选择性育种范式。

本实验方案需要进行大量的基因分型，因此提前建立一种可靠且快速的基因分型方法至关重要。目前已有多种基因分型方案可供选择10,11，但我们发现KASP基因分型12,13,14相比基于扩增序列的限制性酶切方法10具有更快的速度、更高的成本效益和更好的可靠性。因此，本文中包含了KASP基因分型的实验步骤。此外，本方案重点关注骨骼突变表型，并收录了基于先前方案改进的阿利新蓝/茜素红染色操作流程15。

本文所述方法是一种直接有效的策略，可用于提高或降低致死突变的外显率。尽管本实验方案主要关注骨骼突变表型，但我们认为该策略对于所有突变型斑马鱼品系的繁育管理均具有实用价值。事实上，这种繁殖策略的应用可能不仅限于斑马鱼。我们预测，该方案可经适当修改后应用于多种生物中以调控外显率。通过子代检测来调节致死外显率，将有助于推动发育遗传学研究的进展。

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方案

本方案中描述的所有实验均按照科罗拉多大学和俄勒冈大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的规定完成并符合其要求。

1. 准备未筛选的起始菌种

  1. 通过剪取鱼鳍并采用合适的方法（如KASP12,13,14）对全同胞动物群体进行基因分型，以鉴定目标突变等位基因的杂合子携带者11。本方案使用斑马鱼mef2cab1086品系进行。
  2. KASP基因分型
    注意：KASP的等位基因特异性引物由试剂提供公司设计（参见材料表）。为获得适用于特定实时PCR仪的6-羧基-X-罗丹明（ROX）染料浓度，请访问该公司网站。
    1. 将斑马鱼尾组织置于50 µL裂解缓冲液（10 mM Tris（pH 8.3），50 mM KCl，1.5 mM MgCl2，0.3%非离子型表面活性剂，0.3% 辛基苯基-聚乙二醇）中。向96孔PCR板的每孔加入10 µL 10 mg/mL蛋白酶K，在55 °C热循环仪中消化2–5小时，随后在94 °C灭活20分钟。消化完成后将裂解产物冷藏。 
      注意：裂解产物在制备后数月内仍可有效使用。若使用50 mM NaOH裂解组织，KASP反应将失败。这些结果表明，NaOH法提取的基因组DNA不适用于KASP反应。
    2. 使用分光光度计定量基因组DNA。用分子生物学级水稀释基因组DNA模板，使每个反应体系中含约20–30 ng DNA。
      注意：可定量4至5个样本，混合后取平均值，据此为所有样本制备稀释液。当本方案用于成年鱼尾组织时，通常1:100的稀释度已足够。无需精确测定DNA浓度。
    3. 在冰上向1.5 mL微量离心管中每样本加入0.14 µL KASP引物混合液和5 µL KASP主混合液，充分混匀后短暂离心，使液体沉至管底。
      注意：KASP主混合液对热和光敏感，储存时应置于冰上并避免直射光。
    4. 将5 µL引物/主混合液移入适用于所用实时PCR仪的96孔光学PCR板的各孔中。
    5. 向各孔中加入5 µL稀释后的DNA模板样本（浓度约为5–7 ng/µL），并用移液器反复吸打混匀。
    6. 向3个孔中各加入5 µL无核酸酶水作为无模板对照（NTC），另分别加入5 µL经确认的纯合野生型、杂合子及纯合突变型DNA模板作为阳性对照。
    7. 用光学透明封膜覆盖PCR板，确保每个孔均完全密封。
    8. 将PCR板在600 × g下短暂离心，使反应液沉至孔底并去除气泡。
      注意：在进行下一步操作前，应将PCR板置于冰上并避光保存。
    9. 使用表1所示的循环程序进行主要KASP反应。
    10. 查看分析计算机生成的散点图。成功的反应在图中应显示4个明显分离的点群（图3）：三个对应基因型的样本群，以及一个位于原点附近的NTC群。阳性对照应与相应的样本群聚类一致。
    11. 若计算机程序未能识别图中点群对应的特定基因型，可能需要追加循环程序（表2）。重复追加程序，直至计算机能按基因型识别出紧密的聚类。
    12. 将基因分型结果导出为电子表格文件，以便后续使用和分析。
  3. 将鉴定出的杂合子个体共同饲养于主循环水系统中。

2. 子代评分的第一轮

  1. 成对杂交同胞杂合子
    1. 在动物从鳍条取样恢复后，设置成对互交。使用隔离板以确保胚胎发育同步16。
    2. 收集胚胎，并将亲本配对隔离在繁殖笼中。
    3. 监测隔离的成年鱼，以便将具有攻击性的个体分隔开或为其提供遮蔽物（碎鱼网效果良好）。在静水条件下饲养期间，应按照IACUC指南进行喂食并更换水。
  2. 胚胎培育
    1. 在标准条件下对斑马鱼胚胎进行分期并培育至幼体阶段17。
    2. 在第5或第6天使用玻璃移液管收集表型为野生型的个体，此时75%的同窝胚胎 swim bladder 已充气。将表型野生型个体放入育苗池，并记录其亲本信息。
      注意：对于隐性致死突变等位基因（许多骨骼突变属于此类），纯合突变体无法形成 swim bladder18,19。因此，可根据 swim bladder 是否充气，轻松区分表型野生型个体与其突变同胞。
  3. 阿利新蓝/茜素红软骨和骨骼染色
    1. 使用含0.17 g/L Tricaine-S的胚胎培养基麻醉未充气 swim bladder 的幼体。用宽口玻璃巴斯德移液管将个体收集至1.5 mL微量离心管中。每管不超过100条幼体。
    2. 移除各管中的胚胎水，每管加入1 mL含2%多聚甲醛的1×PBS溶液固定样本。
      注意：水溶液中的PFA具有可燃性，会引起严重的皮肤和眼睛刺激。操作时应佩戴适当个人防护装备（如手套和护目镜），使用后彻底洗手。
    3. 摇动1小时；更长时间的固定会影响骨骼染色效果。在此步骤及后续所有摇动步骤中，需定期检查各管，确保无幼体粘附于管壁或聚集在管底。
    4. 用玻璃移液管移除固定液，每管加入1 mL 50%乙醇，摇动10分钟。
    5. 通过向每1 mL Alcian预混液（0.04%阿利新蓝/10 mM MgCl2/80%乙醇）中加入20 µL 0.5%茜素红，配制新鲜染色液。弃去50%乙醇，每管加入1 mL染色液，过夜摇动。幼体可在染色液中保存最多5天。
    6. 移除染色液，每管加入1 mL 80%乙醇/10 mM MgCl2溶液，摇动至少1小时；过夜漂洗可获得更清晰的阿利新蓝染色效果。
    7. 移除80%乙醇/10 mM MgCl2溶液，每管加入1 mL 50%乙醇，摇动5分钟。
    8. 移除50%乙醇溶液，每管加入1 mL 25%乙醇，摇动5分钟。
    9. 移除50%乙醇溶液，每管加入1 mL新配制的3% H2O2/0.5% KOH漂白液。打开管盖，将各管置于微量离心管架中静置约10分钟，或直至溶液上部出现微弱的棕褐色。
      注意：溶液表面会形成一层气泡。此步骤需精确控制时间，过度漂白将导致双染效果不佳。
    10. 移除漂白液，每管加入1 mL 25%甘油/0.1% KOH溶液，摇动10分钟至1小时。
    11. 移除25%甘油/0.1% KOH溶液，每管加入1 mL 50%甘油/0.1% KOH溶液，摇动10分钟至过夜。
    12. 移除50%甘油/0.1% KOH溶液，再次向每管加入50%甘油/0.1% KOH溶液。过夜摇动有助于去除可能在幼体内积聚的气泡。未使用时，将染色后的骨骼样本储存于4 °C。
  4. 表型评分
    1. 对染色后的突变后代进行所选表型外显率的评分。在Nichols et al.1的研究中，突变体被评分是否存在异位骨化。
      注意：由于斑马鱼亲本处于静水中，且茜素红染色随时间可能褪色，因此应在完成骨骼制备后的数天内完成骨骼评分。
    2. 外显率指具有特定基因型中表现出相应表型的比例。按以下公式计算外显率百分比：
      % 外显率 = （具有表型的突变体数量）/（突变体总数） × 100

3. 家系选择

  1. 为下一代选择两个高外显率和两个低外显率的家系。在选择要扩繁的家系时，除了外显率之外，还需考虑繁殖力和活力；更多相关细节请参见讨论部分。
  2. 为每对亲本分配一个子品系标识符：家系.01、.02、等。
  3. 将亲本对与数条混合性别的“伴游”鱼共同饲养于主系统中。伴游鱼可以是任何具有永久且明显可区分特征的斑马鱼品系，例如色素改变或鳍结构异常。
    注意：尽管许多研究人员成功地仅在水箱中饲养繁殖对，但将繁殖对与若干伴游鱼共同饲养可获得更理想的结果。这一可选步骤允许将动物的繁殖对置于更大的群体中饲养，并便于随时取出，以便根据需要进行重复交配。亲本对可多次交配以产生较大的全同胞家系；同一亲本对应至少间隔一周后再进行重复交配。
  4. 淘汰在步骤2.2.2中未被选中用于下一代的幼鱼家系。
  5. 用其突变同胞的外显率标注含有野生型同胞幼鱼的水箱，并按常规方式饲养至成年。
  6. 下一代将至少包含四个全同胞家系，其中两个用于上升家系，两个用于下降家系。
  7. 当幼鱼达到性成熟时，从第一步开始对新一代重复本实验方案。

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结果

本方案是一种用于研究斑马鱼骨骼突变体的长期繁育技术（图1）。通过后代测试进行选择性育种，可在几代内使总体外显率出现向下或向上的变化（图2）。在我们之前的研究中，经过两轮选择性育种，平均外显率从17%降至3%1。类似地，在向上选育品系中，经过三代育种，平均外显率从63%上升至93%。如果经过四轮选择性育种后，外显率仍未出现向下或向上的响应，则表明所评估的表型可能对基于后代测试的选择性育种不敏感。

在成功的KASP实验中，计算机程序应能识别出与基因型相对应的样本紧密聚类，且在完成足够数量的循环后，阴性对照（NTC）应位于散点图的原点附近（图3）。如果KASP散点图数据未形成紧密聚类，或在一个NTC中检测到污染，则程序将无法确定基因型...

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讨论

选择性育种揭示基因功能的细微差异

通过选择性育种使突变表型变得更严重或更轻微，是深入了解基因功能的一种直接方法。与非选择性育种的标准方法相比，本文所介绍的方案能够更全面地揭示突变表型的特征。具体而言，通过构建表型严重的品系，可以展现出突变表型的全部范围，包括那些在非选择性品系中无法观察到的表型，从而发现该研究基因在发育过程中新的功能角色。相反，构建表型轻微的品系则有助于揭示该基因最关键的生物学功能。例如，若在轻微突变体中仅存一种表型，那么该表型所对应的发育过程很可能最依赖于该基因的功能。因此，通过选择性育种可更完整地理解特定突变的全系列表型特征。

避免近交衰退

在许多动物和植物体系中，近亲个体的后代表现出生存能力和繁殖力的下降，斑马鱼即是其中之一20。这种现象被称为近交衰退，大多数模型认为其根本原因是基因座上隐性有害等位基因的纯合度增加，或在杂合状态下具有优...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Chuck Kimmel提供的指导，John Dowd在制定本繁殖策略过程中给予的帮助，Macie Walker在优化骨骼染色方法方面的工作，以及Charline Walker和Bonnie Ullmann在斑马鱼研究方面提供的有益建议。本研究工作由资助项目K99/R00 DE024190（资助给JTN）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
多聚甲醛，颗粒状，固体Ted Pella Co.18501颗粒状PFA比粉末状PFA更安全
氯化镁，固体Acros Organics223210010
10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS），水溶液FisherBP3994
190 proof 乙醇
阿利新蓝，固体Anatech Ltd.867必须来自Anatech
茜素红，固体SigmaA5533-25G
甘油，液体FisherBP229 1
过氧化氢，液体FisherBP263500
氢氧化钾，  固体FisherP250 500
StepOnePlus 实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems
带条形码的MicroAmp快速光学96孔反应板（0.1 mL）Applied Biosystems4346906
Microseal 'B' 密封膜BioRadMSB1001
KASP预混液，高ROXLGCKBS-1016-022https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP定制引物混合液LGCKBS-2100-100
Tris HCl，固体FisherBP153 500
氯化钾，固体FisherBP366 500
Tween-20，液体FisherBP337 100
Nonidet P40ThermoFisher28324
Tricaine-SWestern Chemicals
蛋白酶KFisherBP1700 100
T100梯度PCR仪BioRad1861096
可控滴加巴斯德吸管Fisher13-678-30
NanodropThermoFisher用于DNA定量

参考文献

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