在此，我们提供了一种详细的实验方案，用于在诱导骨骼肌损伤后同时检测衰老细胞和多能干细胞 体内 重编程。该方法适用于评估细胞衰老在组织再生与重编程过程中的作用 体内.
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摘要
摘要
细胞衰老是一种应激反应，其特征是稳定的细胞生长停滞，在癌症和衰老等多种生理与病理过程中发挥重要作用。近年来，细胞衰老也被发现参与组织修复与再生。因此，准确识别衰老细胞变得愈发关键 体内衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测是目前最常用的检测培养细胞及体内衰老细胞的方法 体内该检测方法基于衰老细胞中溶酶体含量的增加，从而可在次优pH值（6或5.5）条件下通过组织化学方法检测溶酶体β-半乳糖苷酶活性。与其他检测方法（如流式细胞术）相比，该方法能够在细胞所处的原位环境中识别衰老细胞，提供有关细胞在组织结构中的位置、形态特征等重要信息，并可与免疫组织化学标记联合使用，实现多标志物共定位分析。 （免疫组织化学）。SA-β-半乳糖苷酶检测的主要局限在于需要新鲜或冷冻的样本。
本文介绍了一种详细方案，用于研究细胞衰老如何促进细胞可塑性及组织再生 体内我们采用SA-β-Gal检测骨骼肌损伤后衰老细胞，该体系是研究组织再生的成熟模型。此外，我们使用 通过免疫组化检测转基因小鼠模型中多能干细胞标志物 Nanog。该方案使我们能够在诱导细胞可塑性的背景下检测并定量细胞衰老。 体内 重编程
引言
细胞衰老是一种应激反应形式，其特征是稳定的细胞周期阻滞。在过去十年中，研究已明确证实，衰老与多种生物学和病理学过程相关，包括胚胎发育、纤维化以及生物体衰老1,2。细胞衰老最初是在人成纤维细胞中发现的，这些细胞在其复制寿命末期因端粒缩短而触发衰老3。除了复制性应激外，还有许多其他刺激因素可诱导细胞衰老，包括DNA损伤、氧化应激、致癌信号以及基因组/表观基因组改变，这些因素最终均可激活p53/p21和/或pRB通路，从而建立并维持永久性生长阻滞1。衰老细胞的一个重要特征是它们仍保持代谢活性，并强烈表达一种衰老相关分泌表型（SASP），即分泌大量炎性细胞因子、生长因子和细胞外基质因子4。由于SASP因子在招募免疫细胞以及改变局部和全身组织微环境方面具有强大作用，因此被认为在介导和放大衰老效应中发挥重要作用1。有趣的是，最近有研究提出，衰老在组织修复和再生过程中可能具有重要作用5,6。此外，包括我们实验室在内的多个研究团队的数据表明，组织损伤诱导的细胞衰老可能通过SASP增强细胞可塑性，从而促进组织再生7-9。因此，所有这些新兴数据均凸显了在体内（in vivo）研究细胞衰老的重要性。
在诱导多能干细胞后的 (iPSC) 时代，细胞可塑性是指细胞在体外培养及其他不同刺激条件下获得新身份并采取替代命运的能力 体内10已知完全重编程可以实现 体内11,12，其中表达含有四个山中因子的表达盒： Oct4, Sox2, Klf4，以及 c-Myc （OSKM）可被诱导 在体 以促进多器官畸胎瘤的形成。因此，可重编程小鼠模型（i4F）可作为一种强大系统，用于鉴定对细胞可塑性至关重要的调控因子和信号通路11.
一个合适且敏感的体内系统对于理解细胞衰老如何在组织再生背景下调控细胞可塑性至关重要。本文介绍了一种可靠的系统及详细的操作方案，用于评估在组织再生过程中衰老与细胞可塑性之间的关联。通过结合胫骨前肌（TA）肌群中由 cardiotoxin（CTX）诱导的肌肉损伤（一种研究组织再生的成熟体系）与 i4F 小鼠模型，可在肌肉再生过程中同时检测细胞衰老和体内重编程现象。
为了评估细胞可塑性与衰老之间的关联，使用 CTX 对 i4F 小鼠进行损伤以诱导急性肌肉损伤，并在 7 天内给予多西环素（0.2 mg/mL）处理以诱导 体内 重编程。尽管最近已发表了一项由CTX诱导的急性肌肉损伤与再生方案13出于伦理考虑，本方案中将省略该步骤。损伤后10天采集TA肌肉样本13，此前已观察到衰老细胞的峰值14本文详细描述了评估细胞衰老水平（通过SA-β-Gal染色）和重编程效率（通过Nanog免疫组化染色）所需的全部实验步骤。
衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测是最常用于在细胞培养和体内检测衰老细胞的实验方法。 体内15与其他检测方法相比，SA-β-Gal 检测能够在组织结构完整的原生环境中识别衰老细胞，这一点尤为关键 体内 此外，SA-β-Gal 检测可与免疫组化（IHC）中的其他标志物联合使用。然而，SA-β-Gal 检测需要新鲜或冷冻样本，这仍是其主要局限性。当可常规获得新鲜或冷冻组织时（例如冷冻的TA肌肉样本），SA-β-Gal 显然是检测衰老细胞最合适的实验方法。选择 Nanog 作为检测重编程细胞的标志物基于两个原因：1）它是多能性的关键标志物；2）更重要的是，其表达不受多西环素（dox）驱动，因此可特异性检测诱导产生的多能性，而非Yamanaka因子表达盒的强制性表达。
需要注意的是，本研究中提供的染色方案可以单独进行，以简化定量分析流程，也可以采用共染色程序，在同一组织切片上同时显示衰老细胞和多能干细胞。
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方案
动物操作遵循欧洲共同体指南，并经巴斯德研究所伦理委员会（CETEA）批准的方案许可。
1. 储备液的配制
- 准备用于肌肉样本固定的材料。在室温下将0.5 g刺梧桐胶溶于20 mL水中，制成用于肌肉固定的冷冻包埋介质。
- 准备SA-β-Gal染色所需溶液。
- 通过将相应粉末溶于蒸馏水中，分别配制100 mM的K3Fe(CN)6、100 mM的K4Fe(CN)6和1 M的MgCl2储备液。
- 将0.2%的C20H6Br4Na2O5（伊红）水溶液稀释后配制成储备液。
- 将X-gal粉末（C14H15BrClNO6）溶于C3H7NO（二甲基甲酰胺，DMF）中，配制成50 mg/mL的X-gal储备液。
- K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6溶液储存于4 °C，MgCl2溶液储存于室温。
注意：X-gal可分装后于-20 °C保存，最长可达6个月。伊红溶液可在室温下保存，必要时过滤后可重复使用。K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6溶液需避光保存。X-gal在水中不稳定，必须避光保存。
- 准备Nanog染色所需溶液：通透化溶液含0.1% Na3C6H5O7（柠檬酸三钠）和0.1% C14H22O(C2H4O)n（n = 9–10）（Triton X-100），溶于蒸馏水中，应储存于4 °C。配制含5%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）作为封闭液，应储存于室温。
2. 冰冻TA肌肉切片的SA-β-Gal染色
- 通过在软木片上放置少量黄蓍胶来准备胫骨前肌的固定材料。
- 两性别（2月龄，C57/B6）小鼠经心脏毒素（CDX）损伤处理10天，具体操作如前所述13使用同一小鼠的未损伤（PBS注射）胫前肌作为阴性对照。如果 在体内 若需要诱导重编程，应在CTX损伤后的同一天开始，用含Dox（1 mg/mL）的饮用水处理每只小鼠（避光）。
注意：多西环素溶液需每3天更换一次，总处理时间为7天。- 按照先前所述方法，分离小鼠的两侧胫骨前肌（受伤侧和对照侧）图1A)13. 为确保横切面，将趾长伸肌（TA）的远端肌腱插入刺槐胶中，并留出约 ¾ 肌肉外部的一部分（图1B）并直接在液氮冷却的异戊烷中冷冻 <1 分钟
注意：确保 TA 肌肉处于垂直位置并位于软木塞中央。样品可在 -80 ℃保存°C 或直接在 10 中进行冷冻切片 µm切片。
- 按照先前所述方法，分离小鼠的两侧胫骨前肌（受伤侧和对照侧）图1A)13. 为确保横切面，将趾长伸肌（TA）的远端肌腱插入刺槐胶中，并留出约 ¾ 肌肉外部的一部分（图1B）并直接在液氮冷却的异戊烷中冷冻 <1 分钟
- 按照所述方法处理TA肌肉 图1B.
- 分配 1st-10th 将切片按正确顺序放置在10张载玻片的左上位置。放置第11张th 1 的相邻切片st 第一张幻灯片上的第12部分th 该部分将按相同顺序排列，紧邻第2部分nd 在第二张切片上进行切片，重复此过程直至每张切片获得10个切片段（共10张切片，总计100个切片段），以确保第一个切片段与最后一个切片段之间至少保持1 mm的距离。
- 用含1%多聚甲醛和0.2%戊二醛的PBS固定切片4分钟，再用PBS洗涤2次 10分钟。接着，将切片在PBS（pH = 5.5）中孵育30分钟。所有步骤均在室温下进行。
注意：固定必须温和，以保持酶活性。此步骤需在通风橱中进行。PBS 的 pH 值至关重要，X-gal 溶液必须避光保存。 - 在含有 4 mM K3Fe(CN)6 的 X-gal 溶液中孵育切片6，4 mM K4Fe(CN)6，2 mM MgCl2，和 400 µg/mL X-Gal 溶于 PBS，pH = 5.5。37℃避光孵育 °在4 °C下孵育至少24小时。在室温下用PBS洗涤切片，每次10分钟，共3次。
注意：孵育至少需要24小时，可延长至48小时，以最大程度增强SA-β-半乳糖苷酶活性的检测信号。β-半乳糖苷酶信号。孵育24小时后需更换溶液。切片应避光保存。如果仅检测SA-β若需进行-Gal染色，请继续执行步骤2.5；若需进行Nanog共染色，请跳至步骤3.1。 - 用1%多聚甲醛PBS溶液固定切片30分钟，用PBS洗涤切片，每次10分钟，共洗3次。用0.2%伊红复染，将切片浸入伊红溶液中1分钟，随后用蒸馏水短暂漂洗。最后，用非荧光水溶性封片剂封片（参见 材料表).
注意：后固定步骤至关重要，必须在通风橱中进行。所有步骤均在室温下操作。
3. 使用抗 Nanog 抗体进行免疫组织化学
- 用含有 4% 多聚甲醛的 PBS 固定载玻片 10 分钟。用 PBS 洗涤，每次 10 分钟，共洗 2 次。直接在载玻片上加入 200 µL 通透化溶液，孵育 5 分钟。
- 用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 2 次；最后一次洗涤时，直接在载玻片上使用含 0.25% BSA 的 PBS 200 µL。所有步骤均在室温下进行。
注意：固定步骤应在通风橱中进行。
- 用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 2 次；最后一次洗涤时，直接在载玻片上使用含 0.25% BSA 的 PBS 200 µL。所有步骤均在室温下进行。
- 将载玻片与一抗 Nanog 抗体（终浓度：1.25 µg/mL）在含 5% FBS 的 PBS 中 4 °C 过夜孵育。用 PBS 洗涤载玻片，每次 10 分钟，共洗 2 次；最后一次洗涤时，使用含 0.25% BSA 的 PBS 200 µL，孵育 5 分钟。所有洗涤步骤均在室温下进行。
注意：将载玻片置于盒中，并用湿纸巾保持湿度，以防止蒸发。 - 将载玻片与即用型试剂盒中的 100 µL rAb-HRP 二抗（见材料表）孵育 45 分钟。用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次，以去除未结合的二抗。所有步骤均在室温下避光进行。
- 显色
- 首先，将 3,3'-二氨基联苯胺（C12H14N4C12H18Cl4N4(4HCl)，DAB）用试剂盒提供的底物缓冲液稀释（每 1 mL 底物缓冲液中加入 20 µL DAB）。直接在每张载玻片上加入 100 µL DAB 溶液，在室温下孵育最多 10 分钟。
注意：稀释后的 DAB 溶液应新鲜配制，可在 4 °C 保存最多一周。可根据需要调整孵育时间以降低背景信号，但所有载玻片的孵育时间必须保持一致。 - 用水冲洗去除 DAB 溶液。用即用型快红溶液（见材料表）对载玻片进行复染 20 分钟。再次用清水短暂洗涤载玻片。
- 先用 95% 乙醇脱水 5 分钟，再用 100% 乙醇脱水 2 次，每次 5 分钟。最后用快速硬化封片剂封片（见材料表）。
- 在显微镜下以明场 20X 物镜观察载玻片，以避免背景干扰。
注意：快红溶液可在室温保存，过滤后可重复使用。
- 首先，将 3,3'-二氨基联苯胺（C12H14N4C12H18Cl4N4(4HCl)，DAB）用试剂盒提供的底物缓冲液稀释（每 1 mL 底物缓冲液中加入 20 µL DAB）。直接在每张载玻片上加入 100 µL DAB 溶液，在室温下孵育最多 10 分钟。
4. 分析与定量
- SA-β-Gal 定量分析
- 扫描切片，并根据获取的图像选择每张切片上质量最佳的区域。每个 TA 肌肉至少使用两个切片区段进行定量分析。根据组织完整性、染色质量和复染效果来评估切片质量。在定量分析时，选择两个质量最高且彼此间距尽可能远的切片区段，以便更全面地代表整个 TA 肌肉中 SA-β-Gal 的定量结果。
- SA-β-Gal 阳性细胞的定量分析（图 2）。
- 通过手动选取最小和最大的阳性 SA-β-Gal 细胞，确定像素大小的范围。
- 使用 ImageJ 软件打开扫描切片的数字图像。
- 在界面中点击“分析” > “工具” > “ROI 管理器” > “分析” > “设置测量” > “选择面积”。使用选择工具圈选最小和最大的阳性 SA-β-Gal 细胞，并通过点击“添加”将其加入 ROI 管理器。使用“测量”按钮测量其大小，并保存数值以供后续使用。
- 调整阈值参数，确保所有可见的阳性细胞均被选中。
- 通过点击“图像” > “类型” > “8 位”将图像转换为灰度图像（图 2A）。接着进入“图像” > “调整” > “阈值”，移动第二个光标，直到所有阳性 SA-β-Gal 细胞均被红色覆盖（图 2B），然后点击“应用”。
- 点击“分析” > “分析颗粒” > “大小（像素²）”，输入步骤 4.1.2.1 中定义的数值，输入“圆度”：0.00–1.00，点击“确定”；所有被计数颗粒的汇总结果将显示在 ROI 管理器中（图 2D）。
- 将所有选定的颗粒转移至原始图像。手动调整选区以确保定量准确。添加阳性细胞（绿色箭头，图 2E）和/或删除假阳性细胞（红色箭头，图 2E）。最后，使用“选择工具”勾勒切片区段轮廓（图 2D）并测量其面积。点击“ROI 管理器” > “添加” > “测量”。
- 重要的是，需将阳性细胞数量根据切片区段的面积进行归一化处理。
- 通过手动选取最小和最大的阳性 SA-β-Gal 细胞，确定像素大小的范围。
- Nanog 定量分析
- 在显微镜下以 20 倍明场放大倍数手动计数 Nanog 阳性细胞。
注：快红复染有助于良好评估 TA 肌肉的形态结构。然而，该染色较浅，缺乏清晰的切片区段轮廓。扫描仪常无法识别切片边界，导致聚焦不准。可在扫描前用标记笔圈出切片边缘，或使用更灵敏的扫描仪来识别切片。在本实验方案中，手动计数 Nanog 阳性细胞最为高效。
- 在显微镜下以 20 倍明场放大倍数手动计数 Nanog 阳性细胞。
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结果
检测肌肉损伤诱导的细胞衰老
最近的研究表明，肌肉损伤会诱导细胞出现短暂的衰老状态14。损伤后第10天（DPI），大多数受损肌纤维正处于再生阶段，表现为细胞核位于中央，这是再生肌纤维的典型特征，同时肌肉的结构也已重新建立。浸润的炎性细胞数量显著减少，但在某些区域仍可见。第10天是通过SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测衰老细胞的理想时间点，因为此时肌肉中坏死细胞和炎性细胞较少，对染色的干扰较小。为了确定染色的特异性，应使用同一小鼠中注射了PBS的胫骨前肌（TA）作为关键的阴性对照（图1A）。
为了更准确地评估SA-β-Gal阳性细胞，应将TA肌肉不同切面的切片置于同一张载玻片上（图1B）。使用...
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讨论
本文介绍了一种在可重编程小鼠骨骼肌中检测衰老细胞和多能干细胞的方法。该方法可用于在体in vivo条件下评估和定量细胞衰老及诱导的细胞可塑性，并研究衰老在组织修复与再生中的作用。
在本实验方案中，采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测法来检测骨骼肌中体内的衰老细胞。该检测方法通过在非最适pH值（6.0或5.5）条件下检测溶酶体β-半乳糖苷酶活性的升高，特异性地识别衰老细胞，而该酶的常规活性检测通常在酸性pH 4.5下进行16,17。因此，必须将pH值调节至6.0或5.5，以确保特异性检测与细胞衰老相关的酶活性。此外，使用伊红复染对于SA-β-Gal+细胞的自动定量至关重要，可排除弱且弥散的信号被计入。为避免潜在的变异，建议由同一人完成全部计数操作。
尽管SA-β-Gal检测是目前应用最广泛且被认可的衰老细胞生物标志物，但它 并非衰老...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Clemire Cimper提供的出色技术支持。H.L.实验室的工作由巴斯德研究所、法国国家科学研究中心以及法国国家研究局（卓越实验室Revive，未来投资计划；ANR-10-LABX-73）、法国国家研究局（ANR-16-CE13-0017-01）和ARC基金会（PJA 20161205028）资助。C.C.和A.C.的研究经费来自Revive联盟提供的博士研究生和博士后奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| K3Fe(CN)6 | 西格玛 | 13746-66-2 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| K4Fe(CN)6 | 西格玛 | 14459-95-1 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| MgCl2 | 西格玛 | 7786-30-3 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| X-Gal | 西格玛 | B4252 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| 多西环素 | 西格玛 | D3447 | 用于诱导体内重编程 |
| 心脏毒素 | Lotaxan Valence，法国 | L8102 | 用于肌肉损伤 |
| 戊二醛 | 西格玛 | 111-30-8 | 用于固定液 |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 50-980-487 | 用于固定液 |
| 柠檬酸钠： 一水合柠檬酸钠，无水级 | 西格玛 | 18996-35-5 | 用于通透液 |
| 吐温 | 西格玛 | 93443 | 用于通透液 |
| 牛血清白蛋白 | 西格玛 | A3608 | 洗涤液 |
| 抗 Nanog 抗体 | Cell Signalling | 8822S | 兔单克隆抗体 |
| EnVision+ 试剂盒（HRP，兔，DAB+） | Dako | K4010 | 用于 Nanog 显色 |
| 1% 伊红 | Leica | 380159EOF | 复染 |
| 快红 | Vector Laboratories | H-3403 | 复染 |
| Thermo Scientific Shandon 免疫封片剂 | 费舍尔科技 | 9990402 | 封片液 |
| 快速硬化显微镜封片介质：Eukitt® | 西格玛 | 25608-33-7 | 封片液 |
| 显微镜相衬明场 CKX41：10X-20X-40X 物镜 | 奥林巴斯 | CKX41 | 用于 Nanog 定量分析的显微镜 |
| 小鼠：i4F-A | Abad 等，2013 | N/A | 可重编程小鼠模型 |
| 骨骼肌，胫骨前肌 | |||
| 切片扫描仪 | 蔡司 | Axio Scan Z1 | 切片扫描 |
参考文献
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
- Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
- Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
- Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
- Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
- Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
- Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
- Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
- Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
- Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528(2015).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
- Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).
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