在此，我们提供了一种详细的实验方案，用于在诱导骨骼肌损伤后同时检测衰老细胞和多能干细胞 体内 重编程。该方法适用于评估细胞衰老在组织再生与重编程过程中的作用 体内.
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本文内容
摘要
摘要
细胞衰老是一种应激反应，其特征是稳定的细胞生长停滞，在癌症和衰老等多种生理与病理过程中发挥重要作用。近年来，细胞衰老也被发现参与组织修复与再生。因此，准确识别衰老细胞变得愈发关键 体内衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测是目前最常用的检测培养细胞及体内衰老细胞的方法 体内该检测方法基于衰老细胞中溶酶体含量的增加，从而可在次优pH值（6或5.5）条件下通过组织化学方法检测溶酶体β-半乳糖苷酶活性。与其他检测方法（如流式细胞术）相比，该方法能够在细胞所处的原位环境中识别衰老细胞，提供有关细胞在组织结构中的位置、形态特征等重要信息，并可与免疫组织化学标记联合使用，实现多标志物共定位分析。 （免疫组织化学）。SA-β-半乳糖苷酶检测的主要局限在于需要新鲜或冷冻的样本。
本文介绍了一种详细方案，用于研究细胞衰老如何促进细胞可塑性及组织再生 体内我们采用SA-β-Gal检测骨骼肌损伤后衰老细胞，该体系是研究组织再生的成熟模型。此外，我们使用 通过免疫组化检测转基因小鼠模型中多能干细胞标志物 Nanog。该方案使我们能够在诱导细胞可塑性的背景下检测并定量细胞衰老。 体内 重编程
引言
细胞衰老是一种应激反应形式，其特征是稳定的细胞周期阻滞。在过去十年中，研究已明确证实，衰老与多种生物学和病理学过程相关，包括胚胎发育、纤维化以及生物体衰老1,2。细胞衰老最初是在人成纤维细胞中发现的，这些细胞在其复制寿命末期因端粒缩短而触发衰老3。除了复制性应激外，还有许多其他刺激因素可诱导细胞衰老，包括DNA损伤、氧化应激、致癌信号以及基因组/表观基因组改变，这些因素最终均可激活p53/p21和/或pRB通路，从而建立并维持永久性生长阻滞1。衰老细胞的一个重要特征是它们仍保持代谢活性，并强烈表达一种衰老相关分泌表型（SASP），即分泌大量炎性细胞因子、生长因子和细胞外基质因子4。由于SASP因子在招募免疫细胞以及改变局部和全身组织微环境方面具有强大作用，因此被认为在介导和放大衰老效应中发挥重要作用1。有趣的是，最近有研究提出，衰老在组织修复和再生过程中可能具有重要作用5,6。此外，包括我们实验室在内的多个研究团队的数据表明，组织损伤诱导的细胞衰老可能通过SASP增强细胞可塑性，从而促进组织再生
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方案
动物操作遵循欧洲共同体指南，并经巴斯德研究所伦理委员会（CETEA）批准的方案许可。
1. 储备液的配制
- 准备用于肌肉样本固定的材料。在室温下将0.5 g刺梧桐胶溶于20 mL水中，制成用于肌肉固定的冷冻包埋介质。
- 准备SA-β-Gal染色所需溶液。
- 通过将相应粉末溶于蒸馏水中，分别配制100 mM的K3Fe(CN)6、100 mM的K4Fe(CN)6和1 M的MgCl2储备液。
- 将0.2%的C20H6Br4Na2O5（伊红）水溶液稀释后配制成储备液。
- 将X-gal粉末（C14H15BrClNO6）溶于C3H7NO（二甲基甲酰胺，DMF）中，配制成50 mg/mL的X-gal储备液。
- K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6溶液储存于4 °C，MgCl2溶液储存于室温。
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结果
检测肌肉损伤诱导的细胞衰老
最近的研究表明，肌肉损伤会诱导细胞出现短暂的衰老状态14。损伤后第10天（DPI），大多数受损肌纤维正处于再生阶段，表现为细胞核位于中央，这是再生肌纤维的典型特征，同时肌肉的结构也已重新建立。浸润的炎性细胞数量显著减少，但在某些区域仍可见。第10天是通过SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测衰老细胞的理想时间点，因为此时肌肉中坏死细胞和炎性细胞较少，对染色的干扰较小。为了确定染色的特异性，应使用同一小鼠中注射了PBS的胫骨前肌（TA）作为关键的阴性对照（图1A）。
为了更准确地评估SA-β-Gal阳性细胞，应将TA肌肉不同切面的切片置于同一张载玻片上（图1B）。使用.......
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讨论
本文介绍了一种在可重编程小鼠骨骼肌中检测衰老细胞和多能干细胞的方法。该方法可用于在体in vivo条件下评估和定量细胞衰老及诱导的细胞可塑性，并研究衰老在组织修复与再生中的作用。
在本实验方案中，采用衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测法来检测骨骼肌中体内的衰老细胞。该检测方法通过在非最适pH值（6.0或5.5）条件下检测溶酶体β-半乳糖苷酶活性的升高，特异性地识别衰老细胞，而该酶的常规活性检测通常在酸性pH 4.5下进行16,17。因此，必须将pH值调节至6.0或5.5，以确保特异性检测与细胞衰老相关的酶活性。此外，使用伊红复染对于SA-β-Gal+细胞的自动定量至关重要，可排除弱且弥散的信号被计入。为避免潜在的变异，建议由同一人完成全部计数操作。
尽管SA-β-Gal检测是目前应用最广泛且被认可的衰老细胞生物标志物，但它 并非衰老.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Clemire Cimper提供的出色技术支持。H.L.实验室的工作由巴斯德研究所、法国国家科学研究中心以及法国国家研究局（卓越实验室Revive，未来投资计划；ANR-10-LABX-73）、法国国家研究局（ANR-16-CE13-0017-01）和ARC基金会（PJA 20161205028）资助。C.C.和A.C.的研究经费来自Revive联盟提供的博士研究生和博士后奖学金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| K3Fe(CN)6 | 西格玛 | 13746-66-2 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| K4Fe(CN)6 | 西格玛 | 14459-95-1 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| MgCl2 | 西格玛 | 7786-30-3 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| X-Gal | 西格玛 | B4252 | 用于 SA-β Gal 染色液 |
| 多西环素 | 西格玛 | D3447 | 用于诱导体内重编程 |
| 心脏毒素 | Lotaxan Valence，法国 | L8102 | 用于肌肉损伤 |
| 戊二醛 | 西格玛 | 111-30-8 | 用于固定液 |
| 多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 50-980-487 | 用于固定液 |
| 柠檬酸钠： 一水合柠檬酸钠，无水级 | 西格玛 | 18996-35-5 | 用于通透液 |
| 吐温 | 西格玛 | 93443 | 用于通透液 |
| 牛血清白蛋白 | 西格玛 | A3608 | 洗涤液 |
| 抗 Nanog 抗体 | Cell Signalling | 8822S | 兔单克隆抗体 |
| EnVision+ 试剂盒（HRP，兔，DAB+） | Dako | K4010 | 用于 Nanog 显色 |
| 1% 伊红 | Leica | 380159EOF | 复染 |
| 快红 | Vector Laboratories | H-3403 | 复染 |
| Thermo Scientific Shandon 免疫封片剂 | 费舍尔科技 | 9990402 | 封片液 |
| 快速硬化显微镜封片介质：Eukitt® | 西格玛 | 25608-33-7 | 封片液 |
| 显微镜相衬明场 CKX41：10X-20X-40X 物镜 | 奥林巴斯 | CKX41 | 用于 Nanog 定量分析的显微镜 |
| 小鼠：i4F-A | Abad 等，2013 | N/A | 可重编程小鼠模型 |
| 骨骼肌，胫骨前肌 | |||
| 切片扫描仪 | 蔡司 | Axio Scan Z1 | 切片扫描 |
参考文献
- Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2....
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重印与许可
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