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化学修饰的肽核酸对双链RNA相对于单链RNA的序列特异性与选择性识别

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DOI：

10.3791/56221

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2017年9月21日

 ,  , 
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们报告了含有修饰残基的肽核酸（PNA）寡聚体的合成与纯化方案。同时描述了用于表征修饰PNA识别RNA双链体的生物化学与生物物理方法。

摘要

RNA 正逐渐成为重要的生物标志物和治疗靶点。因此，开发能够识别 RNA 序列和结构的化学探针及治疗性配体具有广阔前景。近年来已开发出经化学修饰的肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）寡聚物，可实现对 RNA 双链的序列特异性识别。PNA 具有化学稳定性高、骨架呈电中性且类似肽的特性。PNA 可通过手动 Boc 法固相肽合成方法相对容易地合成。合成后的 PNA 采用反相高效液相色谱（HPLC）进行纯化，随后通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定其分子量。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术有助于三链结构形成的成像，因为经过精心设计的游离 RNA 双链与 PNA 结合形成的三链复合物通常具有不同的迁移速率。使用溴化乙锭染色后的非变性 PAGE 常是一种简便且信息丰富的技术，可用于表征 PNA 寡聚物的结合亲和力与特异性。通常可采用多个含有单碱基对突变的 RNA 发夹结构或双链结构，来系统表征 PNA 的结合特性，如结合亲和力和特异性。2-氨基嘌呤是腺嘌呤（6-氨基嘌呤）的异构体；其荧光强度对局部结构环境变化敏感，适用于监测在 PNA 结合位点附近引入 2-氨基嘌呤残基后的三链形成过程。2-氨基嘌呤荧光滴定实验还可用于验证修饰型 PNA 对目标双链 RNA（dsRNA）相较于单链 RNA（ssRNA）的结合选择性。紫外吸收检测的热熔实验可用于测定 PNA-RNA 双链及 PNA·RNA2 三链的热稳定性。本文中，我们描述了含修饰残基的 PNA 寡聚物的合成与纯化方法，并介绍了用于表征修饰型 PNA 对 RNA 双链识别能力的生化与生物物理方法。

引言

由于近期在发现RNA调控和催化多种生物过程中的作用方面取得的进展，RNA正逐渐成为重要的生物标志物和治疗靶点1,2,3。传统上，反义链通过沃森-克里克（Watson-Crick）双链体的形成与单链RNA（ssRNA）结合3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。最近，研究人员设计了可经由霍格斯坦（Hoogsteen）氢键与双链RNA（dsRNA）结合的三链形成肽核酸（TFPNAs）（图1）3,28,29。在大多数传统反义靶向RNA中均存在双链RNA区域，包括pre-mRNA和mRNA、pre-或pri-miRNA3，以及许多其他非编码RNA1,26,27。利用TFPNAs通过三链结构靶向双链RNA可能具有优势，因其具备结构特异性，并在恢复因疾病而失调的RNA正常功能方面具有巨大潜力。

Rozners最近发表的研究工作 等，以及我们3,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41，报道了相关研究工作 在提高修饰型TFPNAs对双链RNA的选择性结合能力及增强其亲和力方面。我们已开发出合理设计的PNA单体的合成方法（图2包括硫代-伪异胞嘧啶（L）单体30 以及胍基修饰的5-甲基胞嘧啶（Q）单体31通过多种生物化学和生物物理表征方法，我们证明了含有L和Q残基的相对较短的PNA（6-10个残基）可分别增强对双链RNA中Watson-Crick G-C和C-G碱基对的识别能力。此外，与未修饰的PNA相比，含有L和Q残基的PNA对双链RNA的结合表现出相较于单链RNA和双链DNA更高的选择性。胍基官能团42 Q碱基的存在使PNA能够进入HeLa细胞31.

在我们的实验室中，我们采用手动Boc化学法（Boc或t-Boc代表叔丁氧羰基，参见图2）进行PNA的固相肽合成4。使用Boc作为氨基保护基团的PNA单体合成较为便利，因为与芴甲氧羰基（Fmoc）氨基保护基团相比，Boc基团体积位阻较小，这在PNA单体与固相载体偶联时可能具有优势。Boc基团对酸敏感，可在PNA合成过程中用含20-50%三氟乙酸（TFA）的二氯甲烷（DCM）溶液在固相载体上轻松去除。可使用自动肽合成仪合成PNA寡聚物；然而，自动合成通常需要3-5倍过量的PNA单体。而手动合成所需PNA单体量显著减少（仅需2-3倍过量），且每次偶联反应可通过凯撒试验（Kaiser test）43轻松监测。此外，由于Boc去除步骤中需使用具有腐蚀性的TFA，许多自动合成仪并不适用于Boc策略的合成。

PNA 寡聚体可通过反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行纯化，随后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行分子量表征（图 3 和 4）30,31。我们采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来监测三链结构的形成，因为游离的 RNA 双链结构与 PNA 结合形成的三链复合物通常具有不同的迁移速率（图 5）30,31。如果能够对 RNA 双链和 PNA·RNA2 三链条带实现有效的染色后显色，则无需进行标记。非变性 PAGE 实验所需的样品量相对较少。然而，上样（孵育）缓冲液与电泳缓冲液（pH 8.3）可能不同，这会导致检测仅限于动力学稳定的三链结构，因为 pH 8.3 的条件可能显著破坏三链结构的稳定性。

2-氨基嘌呤是腺嘌呤（6-氨基嘌呤）的一种异构体；其荧光强度（发射峰约为370 nm）对局部结构环境的变化敏感，适用于监测PNA结合位点附近掺入2-氨基嘌呤残基后的三链结构形成（图6）31。与许多在可见光范围内发射荧光的染料不同，标记了2-氨基嘌呤的RNA可在室光条件下暴露而不会发生光漂白。与通常需要pH 8.3运行缓冲液的PAGE实验不同，基于2-氨基嘌呤的荧光滴定法可在指定pH的单一溶液中测量结合反应，因此可能实现对相对微弱且动力学不稳定的结合在平衡状态下的测量与检测。

通过紫外吸收检测的热熔实验可测定双链（图7）31和三链结构30,32,44,45的热稳定性。三链结构的熔解过程是否呈现明显的相变，取决于其长度和序列组成。若加热与冷却曲线能够重叠，则可从中获得热力学参数。等温滴定量热法（ITC）32可更准确地测定热力学参数；然而，ITC通常需要相对大量的样品。

方案

1. 使用 Boc 化学法手动进行 PNA 的固相肽合成

注意：为了确保目标PNA寡聚物合成的成功与简便性，所有溶剂和试剂均应为无水状态。在试剂瓶中加入适当的分子筛（4Å，1-2 mm直径的颗粒），并定期通入干燥氮气。对于修饰型PNA单体的合成，可参考相应文献中报道的实验方案30,31。未修饰的PNA单体可从商业来源购买获得。在每一次洗涤步骤中，需向树脂中加入适量溶剂，形成浆液后，再将溶剂排尽。

  1. 第一个单体的加载及树脂上过量游离伯胺的封端
    1. 称取30 mg的4-甲基二苯甲基胺盐酸盐（MBHA·HCl）聚苯乙烯树脂（商品化产品；载量为0.7–1.4 mmol/g；100–200目），转移至配有活塞和玻璃塞的5 mL固相多肽反应瓶中。
    2. 用适量二氯甲烷（DCM）浸泡树脂1小时，使树脂溶胀并暴露出胺基（盐酸盐形式）。
      注意：在整个合成过程中，树脂珠应始终完全浸没在溶剂中。
    3. 通过在瓶口上方通入温和的干燥氮气流排干DCM。加入1 mL含50%（v/v）N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）的DCM溶液，静置15分钟。此步骤用于中和树脂上游离胺基所结合的盐酸盐。
    4. 重复步骤1.1.3。同时，称取6 µmol单体和6 µmol (苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基六氟磷酸盐（PyBOP），转移至1.5 mL离心管中。加入200 µL二甲基甲酰胺（DMF）和12 µmol DIPEA。涡旋混合3–5分钟以制备偶联溶液。
      注意：本实验所用目标载量为0.2 mmol/g。所加入的第一个单体是目标PNA序列的C端单体。首个氨基酸的载量可通过苦味酸法测定46。
    5. 排干DIPEA的DCM溶液。用DCM洗涤树脂（×3），再用DMF洗涤（×3），关闭活塞。将制备好的偶联溶液加入树脂中，轻轻振摇。使用洁净的不锈钢刮勺将树脂沿反应瓶内壁推入偶联溶液中。盖上玻璃塞，并将反应瓶固定于40 °C的恒温振荡培养箱中反应3小时。
      注意：也可将反应瓶在室温下静置6–8小时，以完成肽键偶联反应。
    6. 通过将240 µmol乙酸酐和360 µmol DIPEA溶于200 µL DCM中配制封端溶液。排去偶联溶液，用DMF（×3）和DCM（×3）洗涤树脂。加入封端溶液，静置30分钟，期间偶尔轻轻振摇。封端反应通过乙酰化作用屏蔽树脂上未反应的游离伯胺基团。
    7. 重复步骤1.1.6。排去封端溶液，并用DCM洗涤树脂（×3）。
    8. 使用细毛细管取少量树脂珠，置于1.5 mL小玻璃样品瓶中。进行凯撒试验（Kaiser test）43。向样品瓶中各加入15 µL凯撒试剂，使用热风枪加热。观察加热后树脂珠的颜色变化。若树脂珠颜色无变化，表明树脂上已无游离胺基。
      注意：凯撒试剂盒可商品化购买，或根据已有文献方法配制。溶液A：乙醇中的茚三酮；溶液B：乙醇中的苯酚；溶液C：吡啶中的氰化钾（KCN）。
      警告：KCN具有高毒性，操作时应穿戴适当的防护装备，并在通风良好的通风橱中进行加热，避免接触易燃溶剂或试剂。
    9. 若树脂珠呈现蓝色或淡蓝色，则重复步骤1.1.6。
  2. N端胺基保护基的去除
    1. 排干反应瓶中的溶剂，加入含50%（v/v）三氟乙酸（TFA）的DCM溶液，确保树脂完全浸没。静置15分钟，期间偶尔振摇以促进胺基去保护反应。重复该过程2次。
      警告：TFA具有强腐蚀性，操作时应穿戴适当的防护装备。
    2. 依次用DCM（×3）、DMF（×3）和DCM（×3）洗涤树脂。加入含5% DIPEA的DCM溶液，静置15分钟。此步骤通过中和TFA抗衡阴离子来活化游离胺基。重复一次。
    3. 排去DIPEA的DCM溶液，用DCM洗涤树脂（×3）。进行凯撒试验（步骤1.1.8）。
      注意：若胺基成功去保护，树脂珠将呈现蓝色。一旦去保护成功，即可进行后续单体的肽偶联反应。
  3. 后续单体的偶联
    1. 称取18 µmol目标单体（对于Boc-PNA-Q-OH单体，称取13.2 mg）和18 µmol PyBOP至1.5 mL离心管中。加入200 µL DMF和36 µmol DIPEA。涡旋至所有固体完全溶解。
    2. 用DMF洗涤树脂（×3）。将偶联溶液加入反应瓶中，轻轻振摇。使用洁净的不锈钢刮勺将树脂沿瓶壁推入溶液中。盖上玻璃塞，并将反应瓶固定于40 °C恒温振荡培养箱中反应3小时。
    3. 排去偶联溶液，用DMF（×3）和DCM（×3）洗涤树脂。进行步骤1.1.8（凯撒试验）。若树脂珠颜色无变化，重复步骤1.2.1–1.3.3，直至完成目标PNA序列的合成。若在某一单体偶联后观察到树脂珠出现蓝色，则重复步骤1.3.1–1.3.3。若颜色仍持续存在，需再次进行封端（步骤1.1.6）。
      注意：若偶联反应存在问题，建议延长偶联时间（3–12小时）和/或增加单体及偶联试剂的当量。
    4. 完成目标PNA序列合成后，用DMF（×3）和DCM（×3）洗涤树脂。通入持续的干燥氮气流15分钟，将树脂完全干燥。该干燥树脂可用于在PNA的N端连接赖氨酸或荧光标记物（如Cy3或羧基荧光素）。
  4. 在PNA的N端连接赖氨酸或荧光标记物（Cy3、Cy5或羧基荧光素）
    1. 称取10 mg已负载目标PNA序列的树脂，转移至5 mL反应瓶中。用DCM浸泡树脂1小时。
    2. 连接赖氨酸时，执行步骤1.2.1–1.3.3，将单体替换为Boc-Lys(Z)-OH或Fmoc-Lys(Boc)-OH。
    3. 连接羧基荧光素时，执行步骤1.2.1–1.3.3，使用10倍过量的5(6)-羧基荧光素作为单体，并以N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIPC）和羟基苯并三唑（HOBt）为偶联试剂溶于DMF中。将偶联反应在40 °C恒温振荡培养箱中过夜进行。
      注意：由于羧基荧光素对光敏感，反应瓶应包裹铝箔避光。
    4. 连接Cy3或Cy5染料时，采用点击化学法（click chemistry），执行步骤1.2.1–1.3.3，将单体替换为N-Boc-2-丙炔基-L-甘氨酸，从而在PNA的N端引入炔基。随后通过铜催化的点击反应连接含叠氮基的Cy3或Cy5荧光染料12,47,48,49
  5. PNA从固相载体上的裂解、纯化与表征
    注意：若存在以Fmoc为保护基的胺基，需先用含20%哌啶的DMF溶液处理15分钟（重复2次）以去保护。随后用DMF（×3）彻底洗涤，再用DCM（×3）洗涤。通入持续的干燥氮气流15分钟，将树脂完全干燥。
    1. 取5 mg干燥树脂置于小样品瓶中。加入10 µL硫代苯甲醚和4 µL 1,2-乙二硫醇，确保树脂完全浸没于试剂中。室温下静置5分钟。
      注意：这些试剂作为捕获剂，用于捕获PNA保护基去除过程中产生的活性阳离子物种。可根据侧链保护基类型选择合适的捕获剂。
    2. 向含树脂和捕获剂的试管中加入100 µL TFA。轻轻涡旋混合物并短暂离心。室温下静置10分钟。
      警告：TFA具有强腐蚀性，操作时应穿戴适当的防护装备。
    3. 小心向试管中加入20 µL三氟甲磺酸（TFMSA）。轻轻振荡反应混合物，短暂离心后于室温下静置2小时。
      警告：TFMSA具有强腐蚀性，操作时应穿戴适当的防护装备。
    4. 使用装有棉塞的玻璃巴氏吸管将裂解混合液过滤至5 mL圆底烧瓶（RBF）中。用少量TFA洗涤树脂。
    5. 向收集的滤液中通入干燥氮气，直至所有挥发性溶剂完全蒸发。向RBF中加入1 mL冷的乙醚。
      注意：乙醚将导致PNA沉淀。
      1. 在将浑浊溶液转移至1.5 mL离心管前，用乙醚多次冲洗RBF。离心使PNA沉淀沉降。弃去上清液，向沉淀中加入300–500 µL灭菌水。充分涡旋以溶解PNA。
    6. 采用反相高效液相色谱（RP-HPLC），以水-乙腈-0.1% TFA为流动相纯化粗品PNA。收集相应馏分，使用真空浓缩仪蒸发所有溶剂，再将纯化后的PNA重新溶解于灭菌水中。
    7. 使用α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）作为样品结晶基质，通过MALDI-TOF质谱分析对纯化后的PNA进行表征。
    8. 测定PNA在65 °C下的紫外吸收值（260 nm）。使用以下公式计算PNA浓度：
      比尔-朗伯定律，公式：c=A/εl，浓度计算，吸光度分析。
      注意：其中c为浓度，A为测得的吸光度值，ε为RNA序列的消光系数，l为比色皿的光程（1 cm）。PNA序列的消光系数为各单体消光系数之和50。腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶的消光系数分别为15.4、7.3、11.7和8.8 mL/µmol·cm。本实验所用L和Q单体的消光系数假设与胞嘧啶（C）相同。

2. 非变性PAGE

  1. 所需缓冲液的配制
    1. 使用 116.88 mg NaCl（200 mM）、50 µL 100 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）（0.5 mM）、200 µL 1 M 储存液 HEPES（20 mM）和 9.75 mL H2O 配制孵育缓冲液（10 mL）；调节缓冲液至 pH 7.5。
    2. 使用 100 mL 10x Tris-Borate-EDTA（pH 8.3）和 900 mL H2O 配制 1x Tris-硼酸-EDTA（TBE）电泳缓冲液（1 L）。
    3. 使用 30 mg 过硫酸铵和 300 µL H2O 配制 10% 过硫酸铵（APS）溶液（300 µL）。
  2. 12% 聚丙烯酰胺凝胶的制备
    1. 用乙醇清洗制孔梳、玻璃制胶板和垫片；制孔梳和垫片厚度为 1 mm。组装凝胶模具，并用凝胶密封胶带密封。
    2. 对于尺寸为 22 cm × 16.5 cm × 1 mm 的聚丙烯酰胺凝胶，50 mL 凝胶溶液已足够。称取 5.7 g 丙烯酰胺和 0.3 g N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（19:1），转移至 50 mL 离心管中。
      警告：丙烯酰胺具有致癌性。操作时应避免吸入其粉尘或蒸气，并穿戴适当的防护服。
    3. 将固体化合物溶于 50 mL 1×TBE 电泳缓冲液中，将离心管置于 50 °C 水浴中 15 分钟，或直至所有固体完全溶解。进行离心（3,000 rpm，5 分钟，25 °C）以去除溶液中的气泡。让溶液冷却至室温。
    4. 向凝胶溶液中加入 250 µL 10% APS 溶液和 50 µL 四甲基乙二胺（TEMED），用刮刀轻轻混匀。立即倒入玻璃板之间，确保不引入气泡。插入制孔梳，并将凝胶装置在室温下静置至少 60 分钟，以完成聚合，之后于 4 °C 保存备用。
  3. 样品制备
    1. 从主储备液中取出所需量的 RNA 发夹结构（1 µM），转移至洁净的 1.5 mL 离心管中。使用真空浓缩仪将 RNA 溶液干燥。
      注意：每个样品含 1 µM RNA，溶于 20 µL 孵育缓冲液中。通常一次 PAGE 实验准备 13 个 RNA 样品。所有样品的 RNA 可在单个离心管中统一制备。
    2. 从主储备液中取出所需体积的目标 PNA（终浓度最高达 50 µM），分别转移至不同的 1.5 mL 离心管中。使用真空浓缩仪蒸发 PNA 溶液中的水分。
    3. 向含有干燥 RNA 的 1.5 mL 离心管中加入 260 µL 孵育缓冲液，充分混匀以确保 RNA 完全溶解。进行快速冷却处理：将离心管放入已预热至 95 °C 的金属浴中 5 分钟，立即转移至冰浴中静置 10 分钟。
    4. 向每个含有干燥 PNA 的 1.5 mL 离心管中加入 20 µL RNA 溶液，并充分混匀。进行退火处理：将含有 RNA 和 PNA 混合物的离心管放入已预热至 65 °C 的金属浴中 10 分钟，关闭加热电源，让样品缓慢冷却至室温。随后在 4 °C 下孵育过夜。
  4. 凝胶电泳与处理
    1. 移除玻璃板底部的凝胶密封胶带。使用塑料夹具将玻璃板固定在垂直电泳槽上。
      注意：电泳在约 4 °C 的低温室中进行。所有设备、样品和缓冲液在电泳前均需预冷至 4 °C。
    2. 向电泳槽下层缓冲液室加入 1×TBE 电泳缓冲液，使玻璃板浸入缓冲液约 1–2 cm。向上层缓冲液室加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶顶部 1–2 cm。缓慢而轻柔地拔出制孔梳，使缓冲液自然填充加样孔。
    3. 将电泳槽连接至电源。以 250 V 恒定电压预电泳至少 30 分钟，此条件适用于 22 cm × 16.5 cm × 1 mm 的凝胶。
    4. 同时，向每个样品中加入 4 µL（样品体积的 20%）35% 甘油溶液，并轻轻混匀。预电泳结束后，使用移液器和加样枪头小心地将 20 µL 每个样品（包括一个仅含 RNA 的对照样品以及多个含 RNA 与 PNA 混合物的样品）加入加样孔底部，避免引入气泡。以与预电泳相同的 250 V 恒定电压继续电泳 5 小时。
    5. 5 小时后关闭电源，从电泳槽中取出玻璃板。移除剩余的凝胶密封胶带并拆卸玻璃板。小心取出凝胶，浸入盛有 350 mL 去离子水的容器中。加入 35 µL 溴化乙锭（10 mg/mL），将容器置于摇床上（低速）振荡 30 分钟。
      警告：溴化乙锭为诱变剂，操作时应穿戴适当的防护服。
    6. 将溴化乙锭溶液倒入指定的废液容器中。用 1.5–2 L 蒸馏水冲洗凝胶。使用成像仪（见材料表）在 532 nm 绿色激光激发下，配合 610 nm 发射滤光片扫描凝胶。
  5. 凝胶分析
    1. 使用免费软件 GelQuant.NET（http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html）对凝胶条带强度进行定量。根据以下公式对条带强度进行归一化：
      三链体与双链体 DNA 强度，a=I_triplex_max/I_duplex_max，公式分析。
      注意：其中 Iduplex max 是未添加 PNA 时仅 RNA 发夹结构的条带强度，Itriplex max 是添加最高浓度 PNA 后三链体条带的最大强度。
      1. 根据以下公式计算三链体形成的比例：
        静态平衡方程，Y = I_triplex/(I_triplex + aI_duplex)，分子分析公式。
    2. 以三链体形成比例（Y）为纵坐标，添加的 PNA 浓度（µM）为横坐标作图。将数据拟合至以下方程，以获得解离常数（Kd）：
      静态平衡方程；数学表达式；物理；代数公式。
      注意：其中 R0 为 RNA 发夹结构浓度（1 µM），Y0 和 B 分别为三链体比例的初始值和最大变化值，Y 为不同 PNA 浓度下的三链体比例，X 为总 PNA 浓度，Kd 为解离常数。

3. 2-氨基嘌呤荧光结合实验

  1. 样品制备（含dsRNA）
    1. 从主溶液中取出所需量的2-氨基嘌呤（2AP）标记的dsRNA（每条链1 µM）至洁净的1.5 mL离心管中。使用真空浓缩仪蒸发RNA溶液中的水分。
      注意：每个样品含有75 µL孵育缓冲液中的1 µM RNA。通常准备13个RNA样品。所有样品的RNA可在同一管中一次性配制。
    2. 从主溶液中取出所需体积的不同浓度靶向PNA，分别转移至不同的1.5 mL离心管中。使用真空浓缩仪蒸发PNA溶液中的水分。
    3. 向含有干燥RNA的1.5 mL离心管中加入975 µL孵育缓冲液，充分混匀以确保RNA完全溶解。短暂离心后进行退火处理：将离心管放入已预热至95 °C的金属浴中孵育10分钟。关闭金属浴电源，使样品缓慢冷却至室温。
    4. 向每个含有干燥PNA的1.5 mL离心管中加入75 µL RNA溶液，并充分混匀。室温下静置至少1小时，随后在4 °C孵育过夜。
  2. 样品制备（含ssRNA）
    1. 从主溶液中取出所需量的2AP标记的ssRNA（1 µM），分装至洁净的1.5 mL离心管中。从主溶液中取出所需体积的不同浓度靶向PNA，分别加入含有ssRNA的对应1.5 mL离心管中。使用真空浓缩仪将RNA和PNA混合物干燥。
    2. 向每个1.5 mL离心管中加入75 µL孵育缓冲液，充分混匀。进行退火处理：将离心管放入已预热至95 °C的金属浴中孵育10分钟。关闭电源，使样品缓慢冷却至室温。随后在4 °C孵育过夜。
  3. 测量与分析
    1. 使用荧光分光光度计在330–550 nm波长范围内测量发射光谱，激发波长设为303 nm。
      注意：样品在室温下测量，每个样品重复测量3次，取平均值。
    2. 向1 cm方形比色皿中加入70 µL孵育缓冲液，开始测量。
    3. 从比色皿中移除缓冲液，用去离子水冲洗，并通入氮气吹干。对所有样品重复此步骤。从所有样品的测量值中扣除缓冲液的背景信号。
    4. 绘制荧光强度（a.u.）随波长（nm）变化的曲线图。记录所有样品在370 nm处的荧光强度。绘制370 nm处的荧光强度（a.u.）随加入PNA浓度（µM）变化的关系图。
    5. 将数据拟合至步骤2.5.2中的方程，以获得解离常数（Kd）：Y = Y0 + (B/(2R0))(R0 + X + Kd- ((R0 + X + Kd)2- 4R0X)1/2)，其中R0为2AP标记的dsRNA浓度（1 µM）。
      注意：此处Y0和B分别为370 nm处荧光强度的初始变化值和最大变化值，Y为不同PNA浓度下370 nm处的荧光强度，X为总PNA浓度，Kd为解离常数。

4. 紫外吸收检测的热熔解实验

  1. 样品制备
    注意：在95 °C下测量RNA的紫外吸收（260 nm）（以确保RNA二级结构被破坏）。使用以下公式计算RNA浓度：
    比尔-朗伯定律公式 \(c = A/\varepsilon l\)，光谱学中的浓度分析。
    其中c为浓度，A为测得的吸光度值，ε为RNA序列的消光系数，l为比色皿的光程长度（1 cm）。RNA的消光系数基于最近邻模型，使用MeltWin51,52计算得出。程序包可根据要求提供。
    1. 从主储备液中取出所需量的ssRNA（5 µM）至洁净的1.5 mL离心管中。从主储备液中取出所需体积的目标PNA（5 µM），加入相应的含有ssRNA的1.5 mL离心管中。使用真空浓缩仪将RNA和PNA混合物干燥。
    2. 向每个1.5 mL离心管中加入130 µL孵育缓冲液，并充分混匀。进行退火处理：将离心管放入预热至95 °C的金属浴中孵育10分钟。关闭电源，使样品缓慢冷却至室温。随后在4 °C下孵育过夜。
  2. 测量与分析
    1. 使用光程为1 cm的8 µL微量比色皿，在紫外-可见分光光度计上测量260 nm处的吸光度。以0.5 °C/min的升温速率，从15 °C升至95 °C，再从95 °C降至15 °C，逐步测量样品在不同温度下的吸光度。
    2. 将130 µL样品转移至各孔中，确保其中一个孔只加入孵育缓冲液作为空白对照。开始测量。根据需要重复实验。
    3. 以高温下的吸光度值归一化为1，对吸光度数据进行归一化处理，并绘制归一化吸光度值随温度（°C）变化的曲线。绘制曲线的一阶导数图。通过将一阶导数曲线拟合为高斯函数，获得熔解温度（Tm）。

结果

反相高效液相色谱法可用于纯化PNA寡聚物。通过两轮高效液相色谱纯化，即可获得高纯度的PNA寡聚物（图3）。PNA的结构可通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析加以确认（图4）。

非变性PAGE是一种简便且信息丰富的技术，可用于表征PNA寡核苷酸的结合亲和力和特异性。我们通常使用多个含有单碱基对突变的RNA发夹结构或双链体来分析其结合特性（图5）。如图5所示的非变性PAGE结果明确表明，Q和L修饰的PNA能够识别含有C-G碱基对的双链RNA区域（图5B，下图），但不能识别不含C-G碱基对的区域（图5B，上图）。这种特异且增强的识别作用是通过形成T·A-U、L·G-C和Q·C-G PNA·RNA2碱基三联体实现的（图1A、C、D）。此外，也可使用单个或多个位点突变的多种PNA来验证修饰PNA结合性能的提升。我们已证实，在孵育缓冲液中添加2 mM Mg2+对结合能力无显著影响31。

我们通过2-氨基嘌呤荧光滴定实验证明，Q和L修饰的PNA能够结合靶向的双链RNA区域（图6A、6C、6D），但不能结合单链RNA（图6B、6E、6F）。PNA P3与2-氨基嘌呤标记的双链RNA结合的解离常数（Kd）为0.8 ± 0.1 µM。当P3浓度变化时，2-氨基嘌呤标记的单链RNA在370 nm处的荧光强度基本保持不变，表明PNA P3不与单链RNA结合。

含有Q残基的PNA（P2和P3）未显示出热熔解转变（图7），表明其无法与单链RNA（ssRNA）结合。这是由于在类似Watson-Crick配对的Q-G碱基对中存在空间位阻。与未修饰的PNA P1相比，含有修饰L残基但不含Q残基的PNA P4和P5，其对应的RNA-PNA双链体的熔解温度降低，这是由于类似Watson-Crick配对的L-G碱基对中同样存在空间位阻。紫外吸收检测的热熔解数据与2-氨基嘌呤荧光滴定结果一致，后者也显示含有Q和L残基的PNA对单链RNA的结合能力可忽略不计（图6B、6E、6F）。引入Q碱基比引入L碱基更具 destabilizing 作用，因为Q碱基在形成类似Watson-Crick的Q-G配对时产生的空间位阻比类似Watson-Crick的L-G配对（图1E）更为显著（图1F）。

RNA-DNA 碱基配对示意图；Hoogsteen 配对与 Watson-Crick 配对；化学结构分析。
图 1：稳定碱基三联体与不稳定碱基对结构的化学结构。（A-D）T·A-U（A）、C+·G-C（B）、L·G-C（C）和 Q·C-G（D）的 PNA·RNA2 大沟碱基三联体。（E, F）类似 Watson-Crick 的不稳定 PNA-RNA 碱基对 L-G（E）和 Q-G（F）。字母 R 代表 RNA 的糖-磷酸骨架。氢键以黑色虚线表示。该图引自参考文献31。请点击此处查看此图的放大版本。

Boc-PNA 变体的化学结构图，展示肽核酸的合成。
图 2：PNA 单体的化学结构。 图示四种 PNA 单体（T、C、L 和 Q）。请点击此处查看该图的放大版本。

多肽合成示意图，包含粗品及再纯化后的色谱结果、保留时间分析。
图 3：PNA 寡聚物的化学结构及其通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行的纯化。 （A）PNA 序列 P3 的化学结构。（B, C）粗品 PNA P3 的 RP-HPLC 数据（B）以及再纯化后 PNA P3 的 RP-HPLC 数据（C）。请点击此处查看该图的放大版本。

质谱结果；m/z 与强度关系图；分析化合物 P3；计算质量与实测质量对比。
图 4： 纯化后的 PNA P3 的 MALDI-TOF 质谱图。 请点击此处查看该图的放大版本。

RNA发夹结构相互作用；示意图、凝胶电泳、结合曲线；三链体形成分析。
图5： RNA发夹结构与PNA序列及其通过非变性PAGE进行的结合特性表征。（A）RNA发夹结构（rHP1和rHP2）、PNA P3，以及PNA P3与rHP2之间形成的PNA·RNA2三链体。（B）rHP1和rHP2与PNA P3结合的非变性PAGE（12%）结果。孵育缓冲液为200 mM NaCl、0.5 mM EDTA、20 mM HEPES，pH 7.5。上样RNA发夹结构（rHP1和rHP2）浓度为1 µM，体积为20 µL。泳道中PNA浓度从左至右分别为0、0.2、0.4、1、1.6、2、4、10、16、20、28和50 µM。PNA P3不与rHP1结合（上图），但可与rHP2结合（下图）。（C）P3与rHP2结合的Kd测定。三链体形成比例（Y）随PNA浓度作图。本图改编自参考文献31。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA-RNA 三链体，双链稳定性；荧光光谱；结合亲和力曲线；光谱数据。
图 6：PNA P3 与 2-氨基嘌呤标记的 RNA 结合的荧光滴定研究。 RNA 序列中的 2-氨基嘌呤残基标记为“2”。孵育缓冲液为 200 mM NaCl、0.5 mM EDTA、20 mM HEPES，pH 7.5。（A）P3 与一条 2-氨基嘌呤标记的双链 RNA（dsRNA2-2AP）之间形成的 PNA·RNA2 三链体。（B）P3 与一条 2-氨基嘌呤标记的单链 RNA（ssRNA2-2AP）之间可能形成的 PNA-RNA 双链体。（C、E）在 pH 7.5 条件下，2-氨基嘌呤标记的 RNA 双链体（1 µM）和单链 RNA（1 µM）在不同浓度 P3 存在下的荧光发射光谱。约 475 nm 处的峰源于 PNA 中 L 碱基的微弱荧光发射。（D、F）基于 RNA 双链体和单链 RNA 的 2-氨基嘌呤荧光强度（370 nm 处）随 PNA P3 浓度变化的曲线所确定的 Kd 值。该图改编自参考文献31。请点击此处查看此图的放大版本。

RNA双链稳定性；熔解曲线；图表；ssRNA1，P1-P5相互作用；热变性分析。
图7：RNA-PNA双链的热熔解实验结果。 孵育缓冲液组成为200 mM NaCl、0.5 mM EDTA、20 mM NaH2PO4，pH 7.5。所有样品体积为130 µL，含有5 µM单链RNA（ssRNA1）和PNA。(A) 单链RNA（ssRNA1）、PNA（P1、P2、P3、P4和P5）以及PNA P3与ssRNA1以平行取向形成的假想PNA-RNA双链结构。图中显示了类似Watson-Crick配对的Q-G和L-G碱基对之间的空间位阻。(B) 不同PNA与ssRNA1结合后的熔解曲线。具有熔解转变的曲线标示了相应的熔解温度。该图改编自参考文献31。

讨论

RNA双链结合PNA寡聚体（例如，10聚体）属于中等大小的分子，因此在与大小相近或略大的RNA结合时，可表现出电泳迁移率的改变（例如，50聚体或更小）。如果RNA显著大于PNA，则向RNA中滴加PNA可能因凝胶迁移率变化有限而难以奏效。因此，在进行非变性PAGE实验时，可对较大的RNA进行截短处理。将大分子RNA滴加至荧光标记的PNA中，可通过非变性琼脂糖凝胶电泳监测三链结构的形成，样品加样于凝胶中部40。

在总RNA浓度保持恒定的非变性PAGE滴定实验中，我们通常使用1 µM的未标记RNA浓度，以便通过溴化乙锭对游离RNA和三链带进行高效染色。根据RNA结构的不同，低至0.2 µM的RNA浓度也可能足够31。未标记RNA的浓度（0.2 µM）决定了可准确测定的Kd值应约为0.2 µM或更高。也可使用其他染色染料以提高染色效率。此外，我们的未发表数据表明，Cy3荧光染料标记的RNA可用于非变性PAGE实验，以检测强结合事件。

由于2-氨基嘌呤仅具有中等程度的荧光性，2-氨基嘌呤荧光滴定法也仅限于测量解离常数（Kd）接近或高于0.2 µM的结合反应31。如果结合过程引起荧光信号的变化，则可通过荧光滴定法使用相对较亮的染料标记RNA或PNA，以定量溶液中相对较强的结合53,54,55。

通过双链RNA结合型肽核酸（dsRNA-binding PNAs）靶向RNA结构的策略目前仅在有限数量的RNA上得到验证。对于具有不同序列和碱基对组成的双链RNA，其结合特性可能存在差异。在设计三链形成肽核酸（TFPNAs）时，通常可选择双链中富含嘌呤的一条链。理解连续的Q·C-G三联体如何影响三链结构的稳定性至关重要。显然，需要开展更广泛的序列依赖性研究，以深入阐明TFPNAs的序列依赖性结合特性。

通过增加TFPNAs的长度和/或进一步修饰其碱基和骨架56,57，可进一步增强其结合亲和力。然而，连续的双链区域若不含非Watson-Crick结构的干扰，通常难以形成超过10个连续碱基对的稳定结构。可通过将TFPNAs与小分子偶联，以识别双链RNA区域附近存在的非Watson-Crick结构。原则上，TFPNA-小分子偶联物相较于单独的TFPNA或小分子，预期具有更高的结合亲和力和特异性。然而，用于偶联的连接臂的化学和物理性质必须经过优化58,59,60,61,62,63,64。

TFPNAs 能够优先结合双链 RNA（dsRNA），而非单链 RNA（ssRNA）或双链 DNA（dsDNA），这一特性表明，通过调控 RNA 的结构动态性及其与蛋白质和代谢物的相互作用，有望将 TFPNAs 开发为极具价值的化学探针和潜在的治疗性配体。通过将 TFPNAs 与细胞穿透性基团（如小分子、多肽和纳米颗粒）偶联，或与脂质体等超分子结构形成复合物，可能有助于其进入细胞5,6,12,17,25,31,41,65,66。进一步在 TFPNAs 上修饰生物成像标记物（如荧光团和放射性同位素），可能有助于在活体生物中对功能性 RNA 结构进行检测、成像和靶向定位。

披露

已基于本文报道的研究工作提交了一项专利申请（专利号：PAT/179/14/15/PCT）。

致谢

本工作由新加坡教育部（MOE）第一层次基金（RGT3/13 和 RG42/15，授予 G.C.）以及第二层次基金（MOE2013-T2-2-024 和 MOE2015-T2-1-028，授予 G.C.）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4A分子筛，直径1-2毫米颗粒 Alfa Aesar87956
4-甲基二苯甲基胺盐酸盐（MBHA）ŸHClSigma-Aldrich532444
N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）Alfa AesarA11801
(苯并三唑-1-基-氧基)三吡咯烷基膦六氟磷酸盐（PyBOP）Alfa AesarB25251
乙酸酐Sigma-Aldrich320102
凯泽测试试剂盒 Sigma-Aldrich60017
三氟乙酸（TFA）Alfa AesarL06374
未修饰的PNA单体ASM Research Chemicals GmbH5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OHSigma-AldrichB8389 / 47624
硫代苯甲醚Alfa AesarA14846
1,2-乙二硫醇Alfa AesarL12865
三氟甲磺酸Alfa AesarA10173
LiChrosper® 100 RP-18 封端（5 µm) LiChroCART® 250-4默克密理博150838
RNA 寡核苷酸 Sigma-Aldrich定制化 
α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）Sigma-Aldrich39468
乙二胺四乙酸（EDTA）Alfa AesarJ15694
HEPES Lonza17-737E
丙烯酰胺Sigma-AldrichA8887
N.N'-亚甲基双丙烯酰胺Sigma-Aldrich 146072
过硫酸铵（APS）Bio-rad161-0700
四甲基乙二胺（TEMED）Bio-rad161-0800
10倍浓度Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液，pH 8.3第1个碱基BUF-3010-10X1L
甘油 Promega H5433
溴化乙锭（10 mg/mL）伯乐（Bio-rad） 161-0433
高精度比色皿（石英 Suprasil，200–2500 nm）Hellma Analytics 105.250-QS

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RNA 2 RNA
化学修饰的肽核酸对双链RNA相对于单链RNA的序列特异性与选择性识别
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