缺乏在活体（in vivo）条件下测量材料特性和张力参数的工具，阻碍了对其在发育过程中作用的验证。我们采用原子力显微镜（AFM）和纳米颗粒示踪技术，对完整斑马鱼胚胎卵黄细胞在原肠胚形成期间的力学特性进行量化。这些方法可靠且具有广泛的适用性，无需侵入性干预。
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本文内容
摘要
摘要
阐明指导发育中组织时空结构的因素是发育研究的主要目标之一。已有多种假说声称对理解不同发育和形态发生过程中细胞与组织的力学特性具有重要贡献。然而，由于缺乏可靠且易于使用的工具来在活体（in vivo）条件下测量材料特性和张力参数，这些假说的验证一直存在困难。本文介绍了利用原子力显微镜（AFM）和粒子追踪技术来定量分析完整斑马鱼胚胎卵黄细胞在表层扩展（epiboly）过程中的力学特性的方法。表层扩展是一种早期保守的发育过程，胚胎的透明性为该过程的研究提供了便利。这些方法操作简便、结果可靠且具有广泛的适用性，因其避免了可能干扰组织力学特性的侵入性干预。我们采用了一种简单的策略进行样本固定、AFM记录以及纳米颗粒注射与追踪。该策略使得这些方法易于推广应用于其他发育阶段或其他生物体。
引言
形态发生过程的生物力学调控所依赖的物理原理在很大程度上仍未明确。尽管分子和细胞水平的生物力学研究正在迅速发展，但在组织/生物体水平上对生物力学参数的探索仍处于起步阶段。流体动力学逆推法1或视频力显微技术2可帮助研究人员区分主动与被动作用力，而激光显微手术3，或侵入性较小的分离细胞原子力显微镜（AFM）检测4、活体in vivo5检测，以及纳米颗粒微流变学6，有助于预测组织的力学特性及其响应。
原子力显微镜（AFM）是一种具有高原子分辨率的三维形貌技术，通过检测悬臂探针与样品表面接触时的偏转情况，可解析表面粗糙度和顺应性7。目前已发展出多种基于AFM的方法用于研究表面特性，包括测量摩擦力、黏附力以及各种材料的黏弹性性质。近年来，AFM已成为获取生物样品力学特性信息的有力工具。特别是，AFM可通过将已知弯曲常数的悬臂上附着的微探针施加振荡式压痕，非侵入性地从单个细胞中提取复数剪切模量8，从而推断出相应的受力情况。然而，AFM并非唯一可用的方法，其他多种技术也可用于获取单个细胞的流变学数....
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方案
以下所述的所有实验步骤均遵循本机构的动物护理指南。
1. 斑马鱼培养
- 在标准条件下饲养并维持成年斑马鱼。
注：本研究使用了AB和TL野生型胚胎。 - 收集胚胎，并在28.5 °C的E3胚胎培养基中培养24。根据形态学特征，按照先前描述的方法进行胚胎分期19。
2. 原子力显微镜
- 手动去除不同发育阶段的斑马鱼胚胎（根据个人研究需求选择不同年龄的胚胎）的卵膜。使用两把细而尖的镊子去除卵膜（参见 材料表).
- 用一把镊子夹住绒毛膜，用另一把镊子将其撕开一个小口。然后，用镊子夹住与撕裂位置相对的绒毛膜区域，轻轻将胚胎从开口处推出。
- 在解剖立体显微镜下进行去壳操作，显微镜的放大倍数可调范围为8倍至50倍。
- 将胚胎固定以进行原子力显微镜检测
- 在胚胎培养基中配制2%琼脂糖溶液，将35 mm培养皿填满该溶液，待其凝固。用细镊子在琼脂糖凝胶中制作直径1.5 mm（约为胚胎大小的两倍）、深度约350 µm（约为胚胎大小的一半）的小孔。
- 将胚胎放入琼脂糖层....
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结果
皮层张力测量
在每个测量点，通过原子力显微镜（AFM）以1 Hz的频率进行悬臂梁扫描，峰-峰值振幅为5 µm（速度=10 µm/s），最大压入深度约为2 µm，获取五条力-位移（F-z）曲线。该过程耗时少于20分钟，且不受外包运动进展的影响。每种实验条件至少在5个胚胎中进行测试。
与周围柔软的琼脂糖相比，胚胎卵黄细胞上记录的力-位移曲线表现出成比例的线性关系（R2 >0.999) (图2A）。我们在额外的对照实验中进行了多组F-z曲线测量 3 µm/s 和 30 µm/s 并排除了皮层张力 T 存在潜在依赖性的可能c 悬臂梁速度。Tc 仅增加了13%（p <0.01，当速度从10降低至 3 µm/s 且当从10增加时未显示出任何显著变化 30 µm/s.
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讨论
本文展示了在表皮形成过程中，斑马鱼卵黄细胞的材料特性和某些生物力学参数可以通过原子力显微镜（AFM）和纳米颗粒微流变学方法轻松估算。
尽管原子力显微镜（AFM）已被用于获取细胞和组织在生理条件下的流变学特性4,5,25,28，但本文中我们开发了一种将AFM应用于完整发育中胚胎的方案，并利用该方法检测斑马鱼胚胎在原肠胚形成期间卵黄细胞表面的力学性质。
在进行原子力显微镜（AFM）测量时，通过将胚胎半包埋于低熔点琼脂糖中以固定其方向。然而，琼脂糖包埋并未影响AFM测量结果。通过使用球形探针探测琼脂糖表面，测定了其刚度。利用赫兹接触模型（即球体压入弹性体平面表面的模型）对力-压痕曲线进行拟合，得到该凝胶的杨氏模量（E）为4.2 ± 0.2 Pa。鉴于E<.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
感谢Amayra Hernández-Vega和Philippe-Alexandre Pouille参与建立本实验方案的基础工作。同时感谢IBMB-PCB分子成像平台、Xavier Esteban以及实验室成员提供的持续支持。本研究工作得到了加泰罗尼亚自治区政府巩固研究团队项目、西班牙经济与竞争力部的DGI项目和Consolider基金对EMB和DN的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 倒置光学显微镜 | Nikon | TE2000 | 样品和原子力显微镜悬臂梁的可视化 |
| 原子力显微镜（AFM） | 定制 | - | 可使用任何商业化原子力显微镜 |
| 倒置共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM780 | 纳米流变学数据采集 |
| 低电渗琼脂糖 D1 | Conda | 8016.00 | 胚胎包埋 |
| 超纯低熔点琼脂糖（LMP Agarose） | Invitrogen | 16520-100 | 固定胚胎 |
| 斑马鱼显微注射与移植模具 | World Precision Instruments | Z-MOLDS | 用于胚胎包埋；也可使用按原始尺寸定制的模具 |
| Dumont 5 镊子 | FST | 11251-20 | 1.5 mm 直径 |
| Si3N4 悬臂梁 | Novascan | PT.GS | 用于原子力显微镜测量胚胎；球形探针：直径 4.5 µm，k=0.01 N/m |
| 荧光纳米颗粒 | Life Technologies | FluoSpheres F8811 | 用于纳米流变学追踪 |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-2000 | 制备定制微针 |
| 硼硅酸盐毛细玻璃管 | Warner Instruments | G100TF-4 | 制备定制微针 |
| 显微操作器 | Narishige | MN-153 | 操控微移液管 |
| 微量注射仪 | Eppendorf | FemtoJet Express | 控制注射时间和压力 |
| 体视显微镜 | Leica | DFC365FX | 注射过程中胚胎的观察 |
| 分析软件 | MathWorks | Matlab | 分析原子力显微镜和粒子追踪数据 |
| 斑马鱼 | AB 和 TL 野生型 | - | 用于胚胎采集的品系 |
| 玻璃底培养皿 | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | 用于纳米流变学数据采集时的胚胎装载 |
| 载物台测微尺 | FST | 29025-02 | 测量注射体积 |
参考文献
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc....
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重印与许可
