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方法文章

斑马鱼胚胎卵黄细胞中的原子力显微镜与微流变学研究

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DOI：

10.3791/56224

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2017年11月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

本文内容

摘要

缺乏在活体（in vivo）条件下测量材料特性和张力参数的工具，阻碍了对其在发育过程中作用的验证。我们采用原子力显微镜（AFM）和纳米颗粒示踪技术，对完整斑马鱼胚胎卵黄细胞在原肠胚形成期间的力学特性进行量化。这些方法可靠且具有广泛的适用性，无需侵入性干预。

摘要

阐明指导发育中组织时空结构的因素是发育研究的主要目标之一。已有多种假说声称对理解不同发育和形态发生过程中细胞与组织的力学特性具有重要贡献。然而，由于缺乏可靠且易于使用的工具来在活体（in vivo）条件下测量材料特性和张力参数，这些假说的验证一直存在困难。本文介绍了利用原子力显微镜（AFM）和粒子追踪技术来定量分析完整斑马鱼胚胎卵黄细胞在表层扩展（epiboly）过程中的力学特性的方法。表层扩展是一种早期保守的发育过程，胚胎的透明性为该过程的研究提供了便利。这些方法操作简便、结果可靠且具有广泛的适用性，因其避免了可能干扰组织力学特性的侵入性干预。我们采用了一种简单的策略进行样本固定、AFM记录以及纳米颗粒注射与追踪。该策略使得这些方法易于推广应用于其他发育阶段或其他生物体。

引言

形态发生过程的生物力学调控所依赖的物理原理在很大程度上仍未明确。尽管分子和细胞水平的生物力学研究正在迅速发展，但在组织/生物体水平上对生物力学参数的探索仍处于起步阶段。流体动力学逆推法1或视频力显微技术2可帮助研究人员区分主动与被动作用力，而激光显微手术3，或侵入性较小的分离细胞原子力显微镜（AFM）检测4、活体in vivo5检测，以及纳米颗粒微流变学6，有助于预测组织的力学特性及其响应。

原子力显微镜（AFM）是一种具有高原子分辨率的三维形貌技术，通过检测悬臂探针与样品表面接触时的偏转情况，可解析表面粗糙度和顺应性7。目前已发展出多种基于AFM的方法用于研究表面特性，包括测量摩擦力、黏附力以及各种材料的黏弹性性质。近年来，AFM已成为获取生物样品力学特性信息的有力工具。特别是，AFM可通过将已知弯曲常数的悬臂上附着的微探针施加振荡式压痕，非侵入性地从单个细胞中提取复数剪切模量8，从而推断出相应的受力情况。然而，AFM并非唯一可用的方法，其他多种技术也可用于获取单个细胞的流变学数据和力学特性（例如，微吸管抽吸法9、磁扭转细胞仪（MTC）10或单轴拉伸测试11）。

然而，将这些新方法应用于复杂的形态发生过程并不简单。在测定胚胎组织的力学特性时，主要面临的挑战在于材料本身具有微小（µm至mm尺度）、柔软（模量范围为102 -104 Pa）以及黏弹性（导致出现时间依赖性现象）的特性12。因此，有必要针对胚胎和发育中生物体的特殊情况，调整用于测定其力学性质（如刚度、黏度、黏附性）的方法。在分析用于研究发育过程的流变学方法时，需考虑两个重要问题：避免侵入性干扰，并确保操作的可及性。在此背景下，微吸管抽吸法、磁力扭转细胞仪（MTC）和拉伸测试均存在局限性。首先，细胞在微吸管抽吸过程中会经历较大的形变，可能改变其生理和力学特性9；其次，磁力扭转细胞仪需要将实验组织牢固地黏附在基底上，以确保施加的应力能够局部地作用于细胞骨架，这一过程也可能影响细胞的激活状态，从而改变其力学特征10；最后，单轴拉伸法受限于发育中生物体的几何形状和可操作性11。

原子力显微镜（AFM）似乎更适用于发育过程的研究，因为它能够在无需复杂样品制备的情况下，直接在天然环境中研究生物样品。此外，由于胚胎组织的解离通常较为困难，AFM探针的小尺寸提供了高度的灵活性，且对介质类型（无论是水性还是非水性）、样品温度或样品化学组成的选取没有限制。AFM具有足够的通用性，可应用于广泛的领域和时间尺度，并已被用于获取不同发育阶段或生理条件下组织的材料特性。已有研究从形貌学角度对动脉13或骨骼14等完整的天然组织进行了分析，某些情况下（如巩膜）还获得了其力学性质15。在活体胚胎中也开展了形貌研究，例如可视化非洲爪蟾（Xenopus）形态发生过程中的细胞重排16。最后，已开发出全面的样品制备方案，用于测定不同发育过程中的力学参数。已针对鸡胚胎消化道的天然未固定组织切片生成纳米压痕图谱11；从原肠胚期斑马鱼胚胎中分离出的外胚层、中胚层和内胚层前体细胞，分别获取了其黏附性和力学特性4；对禽类胚胎外植体的上胚层和原条进行了刚度测量17；并在非洲爪蟾胚胎脑中直接定义出独特的刚度梯度模式5。

将原子力显微镜（AFM）应用于胚胎发育研究的一个重要定性飞跃，可能源于对简单且易于接近的形态发生过程的探索。斑马鱼的外包运动（epiboly）是一个关键且保守的事件，在此过程中，不同组织在有限的球形空间内协调作用，于数小时内引导胚盘的扩展。在斑马鱼外包运动开始时（球形期），一层表层细胞——即包被层（enveloping layer, EVL）——覆盖在位于巨大卵黄合胞体细胞上方、以胚胎动物极为中心的半球形分裂球帽上。外包运动包括EVL、胚盘深层细胞（DCs）以及卵黄合胞体细胞外层（E-YSL）朝向植物极方向的皮层扩展。外包运动最终以EVL和DCs在植物极的闭合而结束18,19,20。然而，外包过程中力的产生机制与位置，以及这些力如何实现全局耦合，目前尚不清楚1,21。

本文详细描述了如何应用原子力显微镜（AFM）在斑马鱼卵黄细胞表皮层扩展过程中推断其被动力学组织特性 体内为此，我们采用附着在原子力显微镜（AFM）悬臂上的微小微球作为探针。该方法可获取非均匀卵黄细胞表面内的精确局部信息，并用于研究张力梯度及其随时间的动态变化。其他AFM方法，例如使用楔形悬臂的方法22，无法提供足够精确的局部数据。楔形技术需要极其精细的操作技巧，将一个大于样品尺寸的楔形物粘附在悬臂末端，该方法不适合用于探测胚胎（约比悬臂长度大两倍）的力学特性。

以定性和定量的方式建模并表征细胞的黏弹性特性，有助于更深入地理解其生物力学行为。从生物力学的角度来看，理解外包运动（epiboly）至关重要，而不仅仅局限于获取可通过原子力显微镜（AFM）提取的皮层张力测量值及其动态信息；因此，还需要有关组织的生物物理特性的数据。为了获取这些信息，多年来已发展出多种细胞流变学技术，用于在不同生理条件下表征不同类型的细胞23。这些方法包括原子力显微镜（AFM）、磁力扭控仪（MTC）以及光镊（OT）。然而，这些方法已被证明难以适用于胚胎或器官尺度上的介观分析。作为替代方案，我们已成功将纳米颗粒追踪微流变学6应用于活体（in vivo）流变学测量。该技术通过分析单个颗粒的布朗运动位移，推断出局部的微观力学特性。

原子力显微镜与纳米颗粒微流变学相结合，可定义卵黄在原肠胚外展过程中皮层张力动态变化及内部力学特性。该信息充分支持一种模型，即各向异性应力的产生源于外层包被层（EVL）与卵黄细胞质层（YCL）对E-YSL皮层各向同性肌动球蛋白收缩的形变响应差异，这种差异对于EVL的定向净移动及原肠胚外展的进展至关重要1。

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方案

以下所述的所有实验步骤均遵循本机构的动物护理指南。

1. 斑马鱼培养

  1. 在标准条件下饲养并维持成年斑马鱼。
    注：本研究使用了AB和TL野生型胚胎。
  2. 收集胚胎，并在28.5 °C的E3胚胎培养基中培养24。根据形态学特征，按照先前描述的方法进行胚胎分期19。

2. 原子力显微镜

  1. 手动去除不同发育阶段的斑马鱼胚胎（根据个人研究需求选择不同年龄的胚胎）的卵膜。使用两把细而尖的镊子去除卵膜（参见 材料表).
    1. 用一把镊子夹住绒毛膜，用另一把镊子将其撕开一个小口。然后，用镊子夹住与撕裂位置相对的绒毛膜区域，轻轻将胚胎从开口处推出。
    2. 在解剖立体显微镜下进行去壳操作，显微镜的放大倍数可调范围为8倍至50倍。
  2. 将胚胎固定以进行原子力显微镜检测
    1. 在胚胎培养基中配制2%琼脂糖溶液，将35 mm培养皿填满该溶液，待其凝固。用细镊子在琼脂糖凝胶中制作直径1.5 mm（约为胚胎大小的两倍）、深度约350 µm（约为胚胎大小的一半）的小孔。
    2. 将胚胎放入琼脂糖层中打好的孔洞中，并用含有0.5%低熔点琼脂糖的胚胎培养基溶液围绕胚胎进行灌注，以确保胚胎固定到位。仅将该溶液浇注在胚胎周围，使其牢固地固定在孔中。
    3. 在低熔点琼脂糖于室温下凝固之前，旋转胚胎使其待用原子力显微镜探测的感兴趣区域朝上图1A).
  3. 通过原子力显微镜观察胚胎
    1. 在倒置原子力显微镜下使用20倍物镜定位并成像培养皿中的胚胎（参见 材料表25室温（23 - 24 °C）下
      注意：胚胎需保持存活状态，浸没于胚胎培养基中，并附着在琼脂糖基质上。
    2. 使用直径为4.5 µm、连接在标称弹簧常数为0.01 N/m的悬臂上的球形聚苯乙烯微珠，探测已固定胚胎的卵黄细胞表面。将悬臂振荡的峰-峰振幅设定为5 µm，频率设定为1 Hz。
    3. 在不同位置及多个胚胎中收集每个待测区域的数据，作为常规操作以进行数据平均。
      注意：一个良好的起点是通过使用原子力显微镜（AFM）的XY压电驱动器控制悬臂位置，在10 µm × 10 µm正方形的中心及四个角共五个位置进行探测。每个胚胎的成像与数据采集耗时约20分钟。在胚胎卵黄细胞表面的不同区域记录数据， 例如，植物极或靠近外胚层细胞边缘的不同区域（图1B 和 1C），只能通过使用不同取向的独立样本实现。
  4. 计算力
    1. 使用与压电驱动器耦合的应变传感器测量原子力显微镜悬臂的垂直位移（z），并通过显微镜控制软件利用光学杠杆法结合四象限光电二极管测量其偏转量（d）（参见 材料表25).
    2. 利用从玻璃盖玻片裸露区域采集的数据获得的 d-z 曲线的斜率，来校准光电二极管信号与悬臂梁偏转（d）之间的相关性。
      注意：测得的垂直位移等于悬臂梁的形变，其斜率代表光杠杆的形变灵敏度26.
    3. 推断悬臂梁的弹簧常数（k）来自先前所述的热涨落27.
    4. 根据以下公式计算样品的压痕深度（h）：
      h = (z - zc) - (d - d关闭)          (1)
      注意：此处 zc 是接触点的位置和 d关闭 是光电二极管的偏移量。
    5. 计算力（F) 在悬臂上的表示为：
      F = k · d          (2)
  5. 根据包含皮层张力 T 的弹性层的液球模型，计算皮层的张力c 包裹着一种黏性液体。在此模型中，当压痕较小时（与胚胎尺寸相比），作用力随压痕深度成比例增加4,28 作为：
    F = 4π Tc [(Rb / Re) +1)] h          (3)
    注意：此处 Rb 是微珠的半径，且 Re 是胚胎的半径。对于斑马鱼胚胎而言，由于胚胎半径（400 µm）比微珠半径（2.25 µm）大两个数量级，因此该方程可近似为：
    F = 4π Tc h          (4)
    1. 计算张力-压痕力F-h每个胚胎卵黄细胞区域中五个不同点位测量的曲线。
    2. 计算 Tc 每个 F-h 通过非线性最小二乘法拟合曲线。对于统计分析，皮层张力 Tc 计算结果必须取自不同样本的平均值 F-h 曲线。
  6. 通过原子力显微镜（AFM）施加由不同频率正弦波组成的低振幅（100 nm）多频振荡，测量皮层的黏弹性特性（流变学）25.
    1. 计算有效复数模量 g*(ƒ) 从力-压痕曲线的频域中表示为：
      g*(f) = [F(f) / h(f)] - ifb          (5)
      此处 i 是虚数单位且 F(f）和 h(f）是频率（f力和压痕的光谱。 b 是从施加在表面上的振荡中提取出的针对悬臂梁粘性阻力的校正。
    2. 分离 g*(ƒ) 为实部和虚部，即：
      g*(ƒ) = g'(f) + Ig''(f)          (6)
      em>g'f弹性模量是每振荡周期内储存和恢复的弹性能量的度量。 g''(f是表征耗散能量的黏性模量。
    3. 计算损耗正切值，该值可作为类固态（<1）或液态样（>1）材料的性能，例如：
      g''(f) / g'(f)          (7)
      注意：通过此类测量，可提取出表征被测材料黏性与弹性程度的参数。尽管 b 略微依赖于悬臂末端与表面之间的距离，鉴于其数值非常低 g卵细胞所表现出的（参见 图2D 如下所述），微小的变异 b 对测量结果的影响可忽略不计29.

3. 粒子追踪微流变学

  1. 向卵黄细胞进行颗粒显微注射
    1. 使用水平显微注射拉针仪和硼硅酸盐毛细玻璃管制备定制微针（参见 材料表).
      1. 使用拉制仪参数：气压 500，加热 510，拉力 65，速度 25，时间 50，制备外径为 1.00 mm、内径为 0.58 mm、长度为 10 cm 的微针。
    2. 使用定制模具在胚胎培养基中的1%琼脂糖平板上制备注射用培养皿，创建直线凹槽通道（参见 材料表).
      1. 将模具倒置并放置在液态琼脂糖凝胶表面，待凝胶凝固后移除模具。在解剖立体显微镜下以1.2倍放大倍率，用移液器将胚胎加入琼脂糖中由模具形成的凹槽内。
        注意：模具的宽度和设计可使胚胎自动对齐。
    3. 注射前，几乎完全去除培养基，以利于注射操作（注射后拔出针头时，较低的液面张力可防止胚胎/绒毛膜黏附在针头上）。
    4. 显微注射荧光纳米颗粒（半径 a = 100 nm，参见 材料表) 用水稀释（1:1,000）后注入胚胎卵黄细胞的植物极部分（图3A).
    5. 使用精密显微操作器调节微量移液器，并利用具有时间与压力控制功能的自动显微注射仪注射微珠（参见 材料表将压力设定在10至20 psi之间。
    6. 在注射微珠溶液之前，使用1×0.01 mm载物台测微尺测量显微注射仪释放的液滴大小，以校准注射体积（0.5 nL）（参见 材料表).
    7. 在室温下进行显微注射时，使用解剖体视显微镜的1.6倍放大倍率观察胚胎。
  2. 通过记录热波动来评估卵黄的粘弹性行为
    1. 按照步骤2.1去壳显微注射后的胚胎，并将其包埋于含胚胎培养基的0.5%低熔点琼脂糖溶液中，30 °C条件下孵育。随后转移至玻璃底培养皿中（参见 材料表并将它们朝盖玻片方向推移，此时琼脂糖仍处于液态。
      注意：当琼脂糖在室温下凝固后，即可对胚胎进行成像。
    2. 将显微注射后2小时的胚胎置于玻璃底培养板中，并放置在倒置共聚焦显微镜的载物台上。在室温下，使用63倍物镜及标准商用显微镜软件，以25 Hz的采样频率连续采集纳米颗粒图像26秒（像素大小为166 nm，每40 ms采集一次图像）。
    3. 使用开源 ImageJ 软件中的 TrackMate 插件计算颗粒质心的位置，并定义其随时间变化的轨迹图3B).
    4. 使用自制软件计算每个粒子的二维均方位移（MSD）6,30 作为：
      <Δr2 (τ)> = <[x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>          (8)
      注意：此处 t 是经过的时间和时间滞后。在纯粘性液体中，均方位移（MSD）随粘度的增加而减小ν根据斯托克斯-爱因斯坦关系式：
      <Δr2 (τ)> = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9)
      其中 T 是绝对温度。

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结果

皮层张力测量
在每个测量点，通过原子力显微镜（AFM）以1 Hz的频率进行悬臂梁扫描，峰-峰值振幅为5 µm（速度=10 µm/s），最大压入深度约为2 µm，获取五条力-位移（F-z）曲线。该过程耗时少于20分钟，且不受外包运动进展的影响。每种实验条件至少在5个胚胎中进行测试。

与周围柔软的琼脂糖相比，胚胎卵黄细胞上记录的力-位移曲线表现出成比例的线性关系（R2 >0.999) (图2A）。我们在额外的对照实验中进行了多组F-z曲线测量 3 µm/s 和 30 µm/s 并排除了皮层张力 T 存在潜在依赖性的可能c 悬臂梁速度。Tc 仅增加了13%（p <0.01，当速度从10降低至 3 µm/s 且当从10增加时未显示出任何显著变化 30 µm/s.

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讨论

本文展示了在表皮形成过程中，斑马鱼卵黄细胞的材料特性和某些生物力学参数可以通过原子力显微镜（AFM）和纳米颗粒微流变学方法轻松估算。

尽管原子力显微镜（AFM）已被用于获取细胞和组织在生理条件下的流变学特性4,5,25,28，但本文中我们开发了一种将AFM应用于完整发育中胚胎的方案，并利用该方法检测斑马鱼胚胎在原肠胚形成期间卵黄细胞表面的力学性质。

在进行原子力显微镜（AFM）测量时，通过将胚胎半包埋于低熔点琼脂糖中以固定其方向。然而，琼脂糖包埋并未影响AFM测量结果。通过使用球形探针探测琼脂糖表面，测定了其刚度。利用赫兹接触模型（即球体压入弹性体平面表面的模型）对力-压痕曲线进行拟合，得到该凝胶的杨氏模量（E）为4.2 ± 0.2 Pa。鉴于E<...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

感谢Amayra Hernández-Vega和Philippe-Alexandre Pouille参与建立本实验方案的基础工作。同时感谢IBMB-PCB分子成像平台、Xavier Esteban以及实验室成员提供的持续支持。本研究工作得到了加泰罗尼亚自治区政府巩固研究团队项目、西班牙经济与竞争力部的DGI项目和Consolider基金对EMB和DN的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
倒置光学显微镜NikonTE2000样品和原子力显微镜悬臂梁的可视化
原子力显微镜（AFM）定制-可使用任何商业化原子力显微镜
倒置共聚焦显微镜ZeissLSM780纳米流变学数据采集
低电渗琼脂糖 D1Conda8016.00胚胎包埋
超纯低熔点琼脂糖（LMP Agarose）Invitrogen16520-100固定胚胎
斑马鱼显微注射与移植模具World Precision InstrumentsZ-MOLDS用于胚胎包埋；也可使用按原始尺寸定制的模具
Dumont 5 镊子FST11251-201.5 mm 直径
Si3N4 悬臂梁NovascanPT.GS用于原子力显微镜测量胚胎；球形探针：直径 4.5 µm，k=0.01 N/m
荧光纳米颗粒Life TechnologiesFluoSpheres F8811用于纳米流变学追踪
微电极拉制仪Sutter InstrumentsP-2000制备定制微针
硼硅酸盐毛细玻璃管Warner InstrumentsG100TF-4制备定制微针
显微操作器NarishigeMN-153操控微移液管
微量注射仪EppendorfFemtoJet Express控制注射时间和压力
体视显微镜LeicaDFC365FX注射过程中胚胎的观察
分析软件MathWorksMatlab分析原子力显微镜和粒子追踪数据
斑马鱼AB 和 TL 野生型-用于胚胎采集的品系
玻璃底培养皿Mat TekP35G-0.170-14-C用于纳米流变学数据采集时的胚胎装载
载物台测微尺FST29025-02测量注射体积

参考文献

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