我们展示了一种“卡扣芯片”技术，通过简单地将两张载玻片卡合，即可实现无交叉反应的多重夹心免疫测定。该技术使用一种卡扣装置，可可靠地将试剂从一个微阵列转移至另一个微阵列。这种卡扣芯片可用于任何需要不同试剂共定位且避免交叉污染的生化反应。
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本文内容
摘要
摘要
与单个蛋白质检测相比，多重蛋白质分析显示出更高的诊断灵敏度和准确性。抗体微阵列可在单个芯片上同时进行数千个微尺度免疫测定。夹心式检测通过使用两种抗体识别每个靶标，提高了检测特异性，但因试剂间的交叉反应而限制了其多重检测能力。为实现无交叉反应的多重蛋白质检测，已开发出抗体共定位微阵列（ACM）技术，但该方法在检测过程中需要现场使用昂贵的点样仪进行微阵列制备。本文展示了一种“ snap 芯片”技术，通过简单地将两个芯片扣合，即可实现试剂从一个微阵列向另一个微阵列的转移，从而在样品孵育及后续检测抗体（dAbs）应用过程中无需点样仪，仅需预先点样的玻片储存，将玻片制备与检测操作分离。本文介绍了单次和双次转移两种方法，以实现两个微阵列之间的精确对齐，并描述了两种方法的玻片制备流程。结果显示，采用双次转移方法可实现<40 μm 的对齐精度，达到 625 个点/cm2 的阵列密度。通过开展 50 重免疫测定，验证了 snap 芯片在多重蛋白质分析中的可用性。35 种蛋白质的检测限均处于 pg/mL 范围内。
引言
由多种蛋白质组成的生物标志物组合在诊断癌症等复杂疾病时，可能比单一生物标志物具有更高的灵敏度和特异性1,2。酶联免疫吸附测定（ELISA）一直是临床实验室中的金标准技术，可在血浆中实现低至 pg/mL 水平的检测下限，但其局限性在于每次实验只能检测一个靶标3,4,5。抗体微阵列技术已被开发用于在单张显微镜载玻片上并行开展数千个微型化检测实验6,7,8。然而，该方法的多重检测能力受限于试剂引起的交叉反应性，这种交叉反应性源于检测抗体（dAbs）混合物的应用，并且随着靶标数量的增加而变得更加严重9,10,11。Pla et al. 指出，多重夹心检测的易受影响程度与 4N(N-1) 成正比，其中 N 为靶标数量1....
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方案
1. 快速芯片的制备与储存
- 单次转移法（图1a)
- 使用喷墨微阵列点样仪，将含有400 µg/mL抗体和20%甘油的磷酸盐缓冲液（PBS）中的cAb溶液点样到硝酸纤维素膜（或功能化玻璃）检测芯片上13 相对湿度为60％（每点1.2 nL），点间距为800 µm。确保载玻片根据某一角落固定在点样仪载台（此处使用左下角）。
- 将点样后的检测玻片在室温下孵育1小时，相对湿度为60%。
- 将带有16个隔室的载玻片模块垫圈夹紧在检测载玻片上，将其分割为16个孔。每孔加入80 µL含0.1% Tween-20的PBS（PBST），在振荡器上以450 rpm振荡5分钟，重复洗涤3次。
- 每孔加入 80 µL 封闭液，在 450 rpm 条件下振荡孵育 1 小时。
- 取下垫圈，并用氮气流吹干检测载玻片。
- 将转移玻片固定在点样台支架上，并将玻片的左下角紧贴点样台支架的左下角。使用喷墨技术点样一组与cAbs布局相同的对齐标记（聚苯乙烯微珠溶液）。
- 让对齐标记晾干。翻转转移玻片，并将其重新放回点样平台，固定于左下角。
- 制备含有20 µg/mL抗体、20%甘油和1% BSA的dAb点样溶液。
- 使用定位相机拍摄一个对齐标记的图像。将该图像作....
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结果
单次转移与双次转移两种方法的检测流程如图1所示。在单次转移法中，捕获抗体（cAbs）直接点样于检测载玻片上，检测抗体（dAbs）则在使用时以与cAbs呈镜像对称的方式转移至检测载玻片上（图1a）。该方法仅需一次转移操作，但其主要缺陷在于两个微阵列之间存在错位，错位主要由载玻片与喷墨打印架之间的角度偏差引起（图2）。为解决这一问题，一种可行方案是在点样完成后，依次将cAbs和dAbs转移至检测载玻片，并将载玻片在卡扣装置中正确固定（图1b）。采用该方法时，两个微阵列可被精确转移至完全相同的位置。双次转移法无需图像识别系统或对齐标记。98%的点阵列错位控制在41 µm以内，较单次转移法提高了6倍14。
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讨论
在本研究中，我们介绍了一种快照芯片（snap chip）技术，该技术使得无需交叉反应的多重免疫分析方法能够被具备基本实验条件的研究人员广泛使用。与现有的抗体微阵列不同，终端用户无需使用微阵列点样仪。本文展示了单次和双次转移方法，其中双次转移实现了更高的对准精度，98%的点阵对准误差低至约40 μm，最大错位为63 μm14。我们开发了一种新型快照装置，可方便地以恒定压力将两张载玻片压合，使该技术更易于被研究人员采用。试剂的可靠转移不仅可在硝酸纤维素涂层载玻片上实现，也可在普通玻璃载玻片上完成，显著拓展了该技术的应用范围，且无需 extensive 培训。为验证快照芯片的可用性，我们使用预先点样并储存的载玻片进行了50重免疫分析，其中70%的蛋白质检测限（LOD）达到pg/mL量级14。与现有将双抗体（dAbs）混合使用的多重免疫分析方法相比，ACM及快照芯片技术的一个重要优势在于，芯片上的各个检测互不干扰，因此可任意添加或移除任何抗体对，而不会影响其他检测对。利用快照芯片可同时检测数十至数百种蛋白质，相比诸如通过连续孵育进行自动化串行检测等其.......
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披露
麦吉尔大学已就本工作的某些方面提交了专利申请，发明人为 Huiyan Li 和 David Juncker。
致谢
感谢 Rob Sladek 博士提供喷墨点样仪的使用。感谢加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）、加拿大癌症协会研究所和加拿大创新基金会（CFI）提供的最终支持。D.J. 感谢加拿大研究主席计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| 链霉亲和素偶联Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| 吐温-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| 牛血清白蛋白 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| 封闭液：不含BSA的StabilGuard Choice微阵列稳定剂 | SurModics, Inc | SG02 | |
| 硝酸纤维素包被载玻片 | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| 氨基硅烷包被载玻片 | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| 喷墨微阵列点样仪 | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| 载玻片模块垫圈 | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| 湿度稳定珠 | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer软件 | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| 荧光微阵列扫描仪 | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| 生物统计学软件 | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| 内皮糖蛋白捕获抗体 | R&D Systems | MAB10972 | |
| 内皮糖蛋白 | R&D Systems | 1097-EN | |
| 内皮糖蛋白检测抗体 | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a（见表1） | R&D Systems | ||
| IL-6b（见表1） | Invitrogen |
参考文献
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al.
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