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小鼠经皮微创主动脉横缩术诱导左心室肥厚的技术

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DOI：

10.3791/56231

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2017年9月25日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Veterinary Physiology and Zurich Center for Integrative Human Physiology (ZIHP), University of Zurich, 2Laboratoire d'Innovation Thérapeutique, UMR7200, Université de Strasbourg - CNRS, 3Department of Cardiology, Canton Hospital Lucerne

本文内容

摘要

本实验方案的目的是逐步描述小鼠微创横主动脉缩窄（TAC）技术。通过省去常规标准手术中必需的插管和通气步骤，微创TAC简化了手术操作，并减轻了对动物造成的应激负担。

摘要

小鼠横主动脉缩窄术（TAC）是研究压力超负荷诱导左心室肥厚（LVH）及其向心力衰竭进展的最常用外科技术之一。在大多数已报道的研究中，该手术需对动物进行气管插管和机械通气，这使得操作复杂、耗时，并增加了动物的手术负担。本方案旨在描述一种无需气管插管和通气的小鼠微创简化TAC技术。重点强调了该技术的关键步骤，以实现低死亡率并高效诱导左心室肥厚。

雄性C57BL/6小鼠（10周龄，25–30 g，n=60）通过腹腔单次注射氯胺酮和赛拉嗪混合物进行麻醉。在动物自主呼吸状态下，行3–4 mm上段部分胸骨切开术，将穿入结扎辅助装置针眼的6/0丝线从主动脉弓下方穿过，并在钝化的27号针头上方打结。假手术组动物接受相同的外科操作，但不进行主动脉缩窄。该手术诱导左心室肥厚（LVH）的有效性通过心脏重量/体重比值的显著升高得以证实。该比值在术后第3、7、14和28天测定（每组每个时间点n = 6–10）。采用本技术，与假手术组动物相比，TAC组从术后第7天至第28天均观察到LVH。手术相关死亡率和晚期（超过28天）死亡率均极低，均为1.7%。

总之，我们这种经济高效的小鼠微创TAC技术具有极低的术中和术后死亡率，且能高效诱导左心室肥厚（LVH）。该方法简化了手术操作，减轻了动物的负担。只要遵循本方案中描述的关键步骤，即可轻松完成该手术。

引言

近年来，心力衰竭的研究主要在可行的动物模型中进行1。与大型动物心力衰竭模型相比，小型动物模型具有多种潜在优势。除了饲养和维护成本较低外，由于所需设施较为简单，更多研究人员能够获得小型动物模型2。

小鼠心力衰竭模型具有与大鼠模型相似的多种优势。除了饲养成本较低3之外，小鼠模型还可利用大量可用的转基因和基因敲除（KO）品系。细胞类型特异性、可诱导的基因敲除或转基因策略的可能性，使小鼠成为研究心力衰竭发病机制以及探索新型治疗方案的宝贵工具3。

在目前使用的小鼠心力衰竭模型中4，横主动脉缩窄术（TAC）是诱导压力超负荷性左心室肥厚（LVH）的首选模型1,3，该模型最初由Rockman描述5。此模型的最大优势在于能够实现LVH的分层研究2，尽管不同小鼠品系对TAC诱导的左心室重构反应存在差异。特别是C57BL/6小鼠在TAC术后会迅速出现左心室扩张，而这种现象在其他品系中可能并不发生4,6,7。

通过TAC诱导的高血压急性发作可在2周内使左心室质量增加约50%，从而能够快速评估旨在调节左心室肥厚（LVH）发展的药物或分子干预措施的效果4。尽管TAC诱导的严重高血压并不能完全模拟临床上主动脉瓣狭窄或动脉性高血压所观察到的渐进性左心室肥厚及心室重构过程，但该模型仍被众多研究者用于识别和调控心力衰竭中的新治疗靶点4。

在小鼠中进行缩窄术（TAC）所需的外科技术水平高于其他诱导左心室肥厚（LVH）及继发性心力衰竭方法所需的技术2。大多数研究人员通过气管插管并进行动物通气来实施该手术2,8，这使得该操作更具挑战性、耗时更长，并增加了动物的手术负担。仅有少数研究者在其研究中采用了微创TAC，并对这一手术方法进行了简要描述9,10,11。

本实验方案的目的是逐步介绍一种简化且易于操作的小鼠微创横主动脉缩窄技术，并重点说明该手术过程中的关键步骤。通过遵循这些关键步骤，研究者可轻松掌握并实施该技术。

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方案

本方案使用雄性 C57BL/6J 小鼠（10 周龄，25 - 30 g，n=60）。动物饲养和实验均遵循法国农业部、高等教育与研究部制定的指导方针，给予人道护理，所有操作均符合 1986 年 11 月 24 日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）及法国相关法律法规。本方案已获"动物实验区域伦理委员会 CREMEAS"（编号：#2016092816207606）批准。

1. 手术准备

  1. 小鼠到达动物房后，在标准笼具中适应环境一周，保持12小时光照/12小时黑暗循环，自由摄食（具体见材料表）和饮水 随意摄取.
  2. 手术当天，在诱导麻醉前几分钟将小鼠分别放入单独的笼子中，以避免对动物造成额外的应激。手术前一天对所有外科器械进行灭菌。
  3. 腹腔注射单剂量的氯胺酮（51.4 mg/kg）与赛拉嗪（3.3 mg/kg）混合物，用生理盐水（0.9% NaCl）稀释后给药。
  4. 通过观察足趾回缩反射消失来确认麻醉深度。
  5. 用市售剃须刀剃除动物颈部和胸部的毛发，并用70%酒精对剃毛区域进行消毒。
  6. 将动物仰卧置于干净的软木工作垫上，并用胶带固定四肢。

2. 手术

  1. 整个操作过程中均采用无菌外科技术。在自主呼吸的动物身上，使用11号刀片从胸骨上切迹至胸部中段做一条长约10 mm的纵行正中颈部切口，以暴露胸骨（图1）。
  2. 使用Crile-Wood持针器夹持一根4/0单丝聚丙烯固定缝线穿过甲状腺并将其牵开，再用胶带固定于操作垫上。
  3. 用显微外科镊子钝性分离气管前肌肉，暴露气管。
  4. 将尖端光滑的弯头显微外科镊子闭合后轻柔地沿气管表面滑动，并置于胸骨后方。
  5. 通过小心开合尖端光滑的弯头显微外科镊子，在气管前肌肉下方及胸骨后方进行钝性分离，推开胸膜。
  6. 用尖端光滑的直头显微外科镊子夹住右侧锁骨上肌肉，轻柔提起动物胸部。
  7. 将骨剪的下颌插入胸骨下方，进行3–4 mm的上段部分胸骨切开术（图2）。微型胸骨切开术的下端略偏向左侧。
  8. 使用显微外科持针器，将一根7/0单丝聚丙烯固定缝线从微型胸骨切开术两侧第二肋间隙内向外穿出（图4B）。操作时应靠近肋软骨-胸骨角，避免损伤肋间血管、胸廓内血管或胸膜。
  9. 使用两侧的7/0单丝聚丙烯固定缝线牵开胸骨边缘，并用胶带将其固定于操作垫上。
  10. 在低倍放大（2–3倍）下，使用尖端光滑的弯头显微外科镊子轻柔拨开气管前肌肉、纵隔脂肪和胸腺，以显露主动脉弓（图3）。特别注意避免接触或损伤壁层胸膜，以防发生气胸。
  11. 使用结扎钳（图4A）夹住主动脉弓下方的软组织，并轻柔张开其钳口。再用第二把结扎钳在软组织中轻轻开合钳口，于主动脉弓下方建立一个隧道。
  12. 左手持结扎辅助装置（ligation aid），将穿有6/0丝线的一段缝线从其针眼穿过，置于主动脉弓下方；右手持结扎钳，在无名动脉起始部与左颈总动脉起始部之间将其引出（图5）。
  13. 将27号针头截短至5 mm，并用Crile持针器压平两端使其钝化。使用尖端光滑的直头显微外科镊子将钝化的27号针头放置于主动脉弓旁（图6），然后用两把结扎钳在无名动脉与左颈总动脉之间的主动脉处，将缝线紧密地绕针头和主动脉打结（图7）。打结时先打一个双重结作为起始，再加打四个结，确保所有结均平整贴合。
  14. 结扎完成后，迅速但轻柔地抽出针头，以实现直径为0.4 mm的狭窄，形成可重复的横截面积减少65–70%的主动脉缩窄。
  15. 检查主动脉弓周围软组织、胸骨边缘及气管前肌肉的止血情况。在有渗血处放置可吸收止血纱布。移除用于牵开胸骨边缘的7/0单丝聚丙烯固定缝线。
  16. 使用显微外科持针器，将一根6/0单丝聚丙烯间断缝线从左侧第二肋间隙外侧穿入、内侧穿出，再从右侧第二肋间隙内侧穿出、外侧穿出。操作时应靠近肋软骨-胸骨角，避免损伤肋间血管、胸廓内血管或胸膜。
  17. 使用Crile-Wood持针器打结，将胸骨边缘对合。
  18. 使用Crile-Wood持针器，以5/0单丝聚丙烯连续缝合方式单层缝合皮肤。
  19. 假手术组的操作步骤与缩窄手术完全相同，但不围绕主动脉打结。

3. 术后恢复

  1. 密切观察动物。 将小鼠转移至单独的笼子中，并使其呈俯卧位。
  2. 在保温灯下让小鼠恢复直至完全清醒（麻醉诱导后不到1小时）。
  3. 术后镇痛采用腹腔注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡。 根据需要，在术后前三天每8小时进行一次0.1 mg/kg的丁丙诺啡皮下注射。
  4. 将手术后的小鼠放入标准笼具中（每笼最多3只，最少2只）。

4. 心脏收获

  1. 在分析当天，通过腹腔注射生理盐水配制的氯胺酮（300 mg/kg）和赛拉嗪（20 mg/kg）溶液，处死小鼠。
  2. 首先从下腔静脉采集血液，然后通过同一通路注入5 mL含2.6 mM EDTA的生理盐水溶液。
  3. 取出心脏，去除心房，并称量心脏重量（左心室和右心室，不含心房）。
  4. 将左心室与右心室分离，室间隔保留在左心室部分。分别称量两个组织样本，并在液氮中速冻保存。

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结果

手术存活率与远期存活率
整个系列（TAC 和假手术动物）的手术存活率非常高，达 98.3%（60 只中存活 59 只）。唯一一例手术死亡发生在计划接受假手术的小鼠，死因为出血并发症。在为期 28 天的观察期内，术后存活率也极为理想，达 98.3%（59 只中存活 58 只）。唯一一例晚期术后死亡发生于 TAC 小鼠术后第 16 天，可能由心脏原因所致。

技术验证
本研究所采用的技术具有很高的可靠性和可重复性。在所有接受TAC手术的动物组织取材过程中，均证实缝线正确放置于右侧无名动脉与左侧颈总动脉之间。

通过测定术后第3、7、14和28天的心脏重量/体重比值（HW/BW，mg/g），验证了该技术诱导左心室肥厚的有效性。HW指去除心房后左心室和右...

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讨论

本实验方案的目的是逐步展示小鼠微创横主动脉缩窄术的手术技术。其他研究人员已报道过小鼠横主动脉缩窄术的详细技术描述2,8。然而，这些研究者在实施手术时需对动物进行气管插管和机械通气。额外的插管-通气步骤增加了整个操作的复杂性和持续时间，也增加了动物所承受的整体应激。由于这些原因，微创横主动脉缩窄术的概念已受到一定关注。小鼠微创横主动脉缩窄术可用于诱导左心室肥厚及其向心力衰竭的进展9,10,11。这些研究主要关注左心室肥厚和心力衰竭发生过程中的相关通路，而非手术技术本身的描述9,10,11。

在本实验...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由一项资助（N° 瑞士心血管基金会对 RT 的资助编号为 32016。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
手术显微镜OlympusSZX2-TR30
剃刀RowentaNomad TN3650FO
缝合线：
聚丙烯缝合线 7/0EthiconBV-1X
聚丙烯缝合线 6/0BBraunC0862061
丝线结扎线 6/0 FST18020-60
聚丙烯缝合线 4/0Ethicon8683
聚丙烯缝合线 5/0EthiconZ303
药物：
氯胺酮MerialImalgène 1000, LBM154AD
赛拉嗪BayerRompun 2%, KP09PPC
丁丙诺啡CevaVetergesic, 072013
器械： 
咬骨钳Fine Surgical Tools16101-10
结扎辅助工具Fine Surgical Tools18062-12
打结钳Fine Surgical Tools18026-10
克里尔-伍德缝合针持Fine Surgical Tools12003-15
显微外科镊 Fine Surgical Tools11003-12
显微外科镊 Fine Surgical Tools11002-12
组织镊Fine Surgical Tools11021-12
显微外科缝合针持Fine Surgical Tools12076-12
显微外科剪Fine Surgical Tools91501-09
梅奥剪Fine Surgical Tools14511-15
11号刀片Fine Surgical Tools10011-00
RNA 提取与定量 PCR：
TriReagentEuromedexTR-118-200
RNeasy Mini 试剂盒Qiagen74704
Qubit 荧光定量 RNA 检测试剂盒Fisher Scientific10034622
RNA 6000 Nano 试剂盒Agilent5067-1511
高容量 cDNA 试剂盒Fisher Scientific10400745
TaqMan 主混合液Fisher Scientific10157154
TaqMan BNP 引物Fisher ScientificMm01255770_g1
TaqMan ANP 引物Fisher ScientificMm01255747_g1 
TaqMan ACE 引物Fisher ScientificMm00802048_m1
TaqMan Col1a1 引物 Fisher ScientificMm00801666_g1
TaqMan TGFb 引物Fisher ScientificMm01178820_m1
TaqMan Gapdh 引物Fisher ScientificMm99999915_g1
ABIPrism  热循环仪Applied Biosystems7000
软件：
GraphPad PrismGraphPadPrism 7
动物饲料
成年大鼠/小鼠全价饲料SafeUB220610R

参考文献

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