一种在透射电镜中获取微生物连续超薄切片的方法

摘要

本研究为在透射电子显微镜下获取无昂贵设备的微生物的连续超薄切片提供了可靠、简便的程序。

摘要

在透射电镜高倍率下观察三维细胞和细胞成分, 需要制备试样的超薄切片。虽然准备连续超薄的部分被认为是非常困难的, 它是相当容易的, 如果正确的方法是使用。本文介绍了一种安全获取微生物连续超薄切片的 step-by 步骤。该方法的要点是: 1) 使用试样的大部分, 调整试样的表面和刀口, 使其相互平行;2) 在狭缝网格上检索一组连续剖面时, 要在组中切割连续节, 避免在分离时使用一对头发束的困难;3) 使用 "节-保持回路", 避免混淆节群的顺序;4) 使用 "水表面提升回路", 并确保剖面位于水的顶端, 并首先接触网格, 以便将它们放置在栅格上所需的位置;5) 使用铝架上的支撑膜, 使其更容易恢复网格上的剖面, 避免支撑膜起皱;6) 使用染色管, 避免用镊子意外折断支撑膜。这种新的方法可以毫不费力地获得连续的超薄切片。该方法可以对3D 高分辨率的微生物细胞结构进行分析, 使用自动胶带收集 ultramicrotome 法和连续块面或聚焦离子束扫描电子显微镜是无法实现的。

引言

适当的连续超薄切片技术是必不可少的研究细胞和细胞成分三维在电子显微镜水平。研究了酵母细胞周期中纺锤极体的动态变化, 并揭示了其在细胞周期和重复时间上的形态学改变^{1,2,3, 4,5}。在 2006年, 我们创造了一个新词 ' structome ' 通过结合 "结构" 和 "-", 并定义为 ' 定量和三维结构信息的整个细胞在电子显微镜水平 ' ^6,7。

通过 structome 分析, 需要连续超薄切片技术, 发现酵母细胞的酿酒酵母和外 dermatitidis有大约20万核糖体^7,8, 一个大肠杆菌细胞有2.6万核糖体⁹, a 结核分枝杆菌细胞有1700核糖体¹⁰ , Myojin 螺旋菌只有300核糖体¹¹。这些信息不仅可以用来估计每个生物体的生长速率, 也有助于识别物种的⁹。

此外, structome 分析导致发现一个新的有机体;Parakaryon myojinensis在日本海岸的深海中发现, 其细胞结构介于原和真核之间的中间,¹²¹³¹⁴,¹⁵。目前, 连续超薄切片技术被认为是非常困难的, 需要很长时间才能掌握。在这项研究中, 我们开发了一个可靠的方法, 任何人都可以进行连续超薄切片无困难。

方案

注: 本研究中使用的标本为微生物, 在液氮中迅速冷冻, 用丙烷取代含有2% 锇氧化的丙酮, 并嵌入环氧树脂^{1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,}12^{,13 ,14,15,16,17,18}。

1. 支持膜的制备 (图 1-3)

注: 使用 cast-on-glass 方法¹⁹准备了银色的 Formvar 支持胶片。

1. 在二氯化乙烯中加入100毫升 1.5% Formvar 的 Formvar 制造装置 (图 1)。通过用橡皮球¹⁹将溶液与空气通过 "a", 在该装置的上部柱上的 Formvar 溶液中浸 one-half (76 mm x 26 mm x 1.3 mm)。
   1. 通过打开三路塞并通过 "b" 释放空气以减少压力, 从柱上排出溶液。取出装置上的玻璃片, 在空气中晾干, 在玻璃滑梯的表面形成薄膜。使用白炽灯加速干燥的 Formvar 膜。
2. 在用刀片 (图 2a) 将玻璃片上的四边缘刮掉后, 并在幻灯片上呼吸以方便胶片从幻灯片²⁰中分离出来, 将玻璃片浸入水中, 使胶片漂浮在水缓慢地在低水平角度 (约10°,图 2b)。
3. 用铝架 (30 mm x 25 mm x 3 mm) 用孔 (直径 4 mm) 舀出 Formvar 膜 (图 3a)。将机架与 Formvar 胶片放在干燥中直到使用 (图 3b)。

2. 在显微镜 (图 4) 下, 用超声波修剪刀片和刀片式服务器²¹修剪试样块

1. 通过用光学显微镜 (图 4a) 观察块的尖端, 确保块表面有细胞。
2. 将试样块装入卡盘 (块座), 然后在修剪阶段安装卡盘²¹ (图 4b)。这种修剪阶段有一个从标本背面的照明机制。
3. 修剪块的大小为 0.7 mm x 1.0 mm (图 4c, 5d)。由于环氧树脂是非常硬, 修剪的方块首先使用超声波修剪刀片。超声波修边刀是一种新引进的机器, 其块体易于修剪。然后用剃刀刀片进一步修剪木块。剪切一个肩膀以标记切削方向 (请参见图 5d,图 8)。

3. 使用切片用金刚石刀修整试样块 (图 5)

1. 在 ultramicrotome 标本夹中设置试样块夹头。在执行连续超薄切片时, 将试样的90°逆时针放置到实际位置 (请参见图 5d)。
2. 用菱形修剪刀切割块的表面 (参见图 5d)。将菱形刀边与试样块面平行, 并切下试样表面的最小量, 以免丢失任何标本 (图 5d)。
   注意: 这一步是做抚平的标本表面。细长部分的试样表面部分保持完好 (因此, 这部分不像镜子那样闪亮,图 5d), 这样就不会丢失样本的任何部分进行连续切片。这是因为标本是暴露在表面的块。
3. 在刀台上放置一面镜子 (台面切割, M), 以监视试样块的切割 (图 5c)。
4. 切割左边缘 (这成为上侧,图 5d, 在序列切片的样本) 的块使用修剪刀旋转刀阶段30°向左 (图 5a)。
5. 从试样的左边缘切下100µm 的块面 (这成为序列切片中试样的下部,图 5d), 通过将刀阶段30°向右旋转 (图 5b)。
   注: 该系列的部分将削减约 90 nm x 约1毫米大小的标本薄部分。大的部分将用于调整试样表面和刀口, 使其平行。在将试样表面调整到与刀口平行的地方后, 将用刀片将大零件移除。通过使用切片切割试样的上下两侧, 试样的两侧变得平滑且完全平行 (图 5d), 这是获得平直和完整的带状剖面所必需的。

4. 调整试样表面和刀口, 使其与其他²¹平行

1. 取下裁切刀, 顺时针旋转试样块90°。
2. 把超薄切片刀放到刀台上
3. 调整试样表面和刀口, 使其与试样表面的大部分面平行。
   注: 试样的大部分用于调整, 因为连续切片的切割面很小, 很难用这部分来调整试样表面和刀口, 特别是在垂直方向。因此, 使用的大部分标本, 使调整容易。

5. 在试样块上散布氯丁橡胶溶液 (图 6)

1. 要将标本夹头放置在与原始位置完全相同的位置, 请在卡盘和切片的卡盘上应用磁带, 并在边界处剪切 (图 6a)。
2. 从切片取出标本夹头, 并将其置于显微镜 (图 6b) 下。用剃刀刀片切断标本的大部分, 留下纤细的部分, 从中可以获得串行部分。
3. 使用巴斯德吸管, 下降约1µL 0.5% 氯丁橡胶解决方案 (图 6b) 上的标本, 以用于串行切片, 使节方胶粘剂。用氯丁橡胶溶液覆盖整个试样。立即吸收过剩的氯丁橡胶解决方案与一块滤纸放置在靠近标本。获得一条丝带的部分是必不可少的拍照的串行细胞部分, 和氯丁橡胶胶水是非常有用的, 以坚持节。
4. 准备3狭缝网格 (狭缝尺寸: 中间, 0.4 毫米 x 2.2 毫米, 两侧 0.2 mm x 2.2 mm) (图 6c) 通过将网格的手柄弯曲到60°, 用0.5% 氯丁橡胶溶液处理网格, 并使网格亲水性辉光放电²²。

6. 制作串行部分 (图 7-9)

1. 将样本块卡盘放回切片, 并将其与 5.1 (图 6a) 对齐, 使其与录音部件对准。这使块面和刀边完全平行。然后把刀靠近标本。
2. 把刀船装满水。
3. 用塑料盖盖住切片以防止气流 (图 7)。
   注: 在超薄切片和剖面提取过程中的气流通常会引起问题。塑料盖有三孔: 一个孔是为双目透镜, 另外两个孔是为胳膊允许操作, 当盖子是。木扶手是用来放置武器, 而做微妙的工作, 如检索串行部分与网格。木扶手被放置在不同的表从切片表 (图 7, 箭头), 以便不传送操作员的手的振动到切片。
4. 开始切割 200 nm 截面厚度的试样 (图 8)。设置在 200 nm 厚度将节省时间把刀的表面上的标本。
5. 剪切第一个截面后, 将截面厚度设置为 70 nm (图 8)。
6. 当连续区段的数量到达 20 (确切地说, 在丝带以后到达大约1.8 毫米; 区段的数量根据区段的宽度变化), 设置部分厚度到10毫微米 (图 8), 当继续切开。
   注: 由于切片不能切割10纳米厚的截面, 没有新的节出现, 和以前的切割部分成为分离的刀口。重要的是要获得分离的节组 (图 9) 来拾取串行部分, 以避免使用一对头发线手动分离分区的困难。因为视野在传输电子显微镜是2.0 毫米, 部分应该是1.8 毫米长至多。
7. 将截面厚度设置为 60 nm (图 8)。这将生成 70 nm 剖面 (图 8), 因为该计算机将添加以前的 10 nm 厚度。
8. 将截面厚度设置回 70 nm (图 8), 并继续切削, 直到获得 1.8 mm 长的剖面。
9. 重复 6.6-6.8, 直到五 1.8 mm 长剖面得到 (图 9)。我们通常做五节组, 因为有五标本持有人在透射电子显微镜可在我们的实验室, 但五不是极限。

7. 拾取串行部分 (图 10-12)

1. 将 "节保持环路"²³ (循环的内径: 5.0 mm) (图 10a) 放在第三个分区组 (图 10b) 上。
   注意: 有必要按其切片顺序检索各节以按正确顺序拍摄图片。然而, 由于在刀船上有五节组, 它往往会混淆哪些群体是哪一组。通过将循环放在第三个组上, 就可以清楚地看出, 运算符附近的两个组是第一和第二类, 而从运算符到距离的两个群是第四和第五组 (图 10b)。这将防止混合订单。
2. 将 "水面提升回路"²³ (WSRL, 循环的内径: 4.0 mm) (图 11a) 放在刀台上 (图 11b)。WSRL 将坚定地站在刀台上, 因为它在底部装有磁铁。
   1. 通过移动轴和手柄, 将 WSRL 的环路放在串行节的上方。把 WSRL 的环放在水面上, 这样循环就会包围这些部分。
   2. 通过将螺钉向下转动来推动循环, 使水面表面张力升高 (图 11 c-d)。将剖面移动到循环的中心, 将其放置在水的顶点上, 并使用发束²¹调整剖面的方向。
   3. 拿起部分组通过触摸它与一个裸露的狭缝网格, 这是由镊子举行, 并保持平行的水面 (图 11d)。对于部分来说, 首先接触网格 (而不是水), 将剖面精确地放置在网格的中心 (图 11d) 是很重要的。
3. 将网格与剖面一起放置在 Formvar 支持膜上的小水滴¹⁶ (图 12), 并使用滤纸去除多余的水。
   注: 由于膜 (切片) 直接触及膜 (支撑膜), 支撑膜的皱起通常是一个问题。通过在 Formvar 支持膜上放置一个带截面的网格和少量的水来减少支撑膜上的皱纹的问题,¹⁶。

8. 着色部分^16,24 (图 13)

1. 在切片完全干燥后, 将 Formvar 膜从网格周围撕裂, 并取下带有剖面的网格。
2. 在染色管的凹槽中设置网格¹⁶ , 按正确的顺序 (图 13), 并将铀醋酸盐和柠檬酸铅²⁴的着色切片。
   注: 有一个沟槽0.6 毫米深沿长轴的管切割与刀片。该管用于防止在使用镊子时的辅助薄膜发生意外破损, 因为在染色和洗涤过程中, 不需要直接处理网格,¹⁶。

9. 对串行部分的观察 (图 14)

1. 按照正确的顺序 (图 14a) 将 multi-specimen 托架中的5网格设置为垂直于试样夹轴的网格狭缝的长轴。网格的手柄 (箭头) 不必被切割, 因为 "网格毒贩" 不会触及手柄。
2. 用 "网格毒贩" (图 14b) 固定网格, 并将标本夹插入透射电子显微镜。
   注意: 使用所有单元格部分 (图 15) 的低放大图像通常是有用的, 以便在拍摄目标单元格之前, 在没有污染和良好的固定状态下找到有趣的微生物或细胞。
3. 在高倍率下拍摄所有单元格中目标单元格的图片。

结果

在该协议中, 三-狭缝网格用于拾取串行段。网格是由镍或铜制成的。串行部分放置在中间狭缝上。双方的狭缝是必要的, 以查看的部分时, 他们拿起网格。在用镊子 (图 11d) 拾取时, 为了使网格与串行剖面保持平行, 手柄弯曲 (图 6c, 右)。一个小手柄有利于防止网格主体的弯曲, 在拾取时会引起严重的问题, 并防止在染色过程中掉节。该网格优于传统的 2.0 mm x 1.0 mm 孔网格。也就是说, 剖面由两个 0.4 mm 的金属棒直接支撑 (窄于1.0 毫米), 在三狭缝网格中由 Formvar 支持膜支撑, 而剖面仅由传统孔网格中的支撑膜支撑。因此, 使用三狭缝网格进行高倍率照相时, 可以防止试样漂移。

图 15显示了带有串行部分的五网格的低放大率视图。由于每个截面都粘在...

讨论

这里提出的方法不需要昂贵的设备。它只需要一个铝架 (图 3)、三狭缝网格 (图 6c)、节保持环路 (图 10a)、water-surface 提升环路 (图11a) 和染色管 (图 13)。目前的方法有许多特点。试样的大部分用于调整试样的表面和刀口, 使其彼此平行。在将一组串行剖面检索到狭缝网格时, 将序列切片分成组, 以避免使用一对头发线分隔节的困难。"节保持环" 用于避免混合节组的顺序。"水表面提升回路" 用于确保剖面位于水的顶端, 并且首先接触网格, 以便将它们放置在栅格上的所需位置。铝架上的 Formvar 支撑膜用于使网格上的剖面恢复更容易, 并避免支撑膜起皱。采用染色管, 避免用镊子意外折断支撑膜。

最近, 一个自动的磁带收集 ultramicrotome 被开发了

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Formvar 制造设备	Nisshin EM Co. Ltd.，东京	652	W 180 x D 180 x H 300 mm
载玻片	Matsunami Co. Ltd.，大阪	-	76 x 26 x 1.3 mm
带 4 mm 孔的铝制机架	Nisshin EM Co. Ltd.，东京	658	W 30 x D 25 x H 3 mm，请参阅此论文
立体显微镜	Nikon Co. Ltd.，		Tokyo-SMZ 645
用于立体显微镜的 LED 照明	Nikon Co. Ltd.，		Tokyo-SM-LW 61 Ji
修剪台	Sunmag Co.Ltd..，Tokyo	-	配备倾斜机构，参考本文
修剪台的 LED 照明	Sunmag Co.Ltd..， 东京	-	参考本文
超声波修剪刀片	Nisshin EM Co. Ltd.， 东京	5240	EM-240，请参阅此纸
用于修整	Diatome Co. Ltd.，	Switzerland-45	°
超薄切片金刚石刀	Diatome Co. Ltd.，		Switzerland-45°
超薄切片机	徕卡显微系统，维也纳	-	Ultracut S
台面切割	徕卡显微系统，维也纳	镜	面
0.5% 氯丁橡胶 W 溶液	Nisshin EM Co. Ltd.，东京	605
特殊 3 缝镍网格	Nisshin EM Co. Ltd.，东京	2458	参考本文
特殊 3 缝铜网格	Nisshin EM Co. Ltd.，东京	2459	参考本文
切片固定环	Nisshin EM Co. Ltd.， Tokyo	526	参考本文
水面提升环	Nisshin EM Co. Ltd.， Tokyo	527	参考本文
染色管	Nisshin EM Co. Ltd.， Tokyo	463	参考本文
多样品支架	JEOL Co. Ltd.，	Tokyo-EM-11170
JEM-1400	JEOL Co. Ltd.， 东京	-	透射电子显微镜