本研究提供了在透射电子显微镜下无需昂贵设备即可获得微生物连续超薄切片的可靠且简便的操作方法。
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摘要
摘要
在透射电子显微镜下以高倍率观察细胞及细胞组分的三维结构，需要制备样品的连续超薄切片。尽管制备连续超薄切片通常被认为非常困难，但如果采用正确的方法，则相对容易实现。本文介绍了一种安全获取微生物连续超薄切片的逐步操作流程。该方法的关键要点包括：1）利用样品的较大区域，并调整样品表面与刀刃，使其相互平行；2）以组为单位切割连续切片，在将一组连续切片转移至狭缝载网上时，避免使用两根毛发分离切片所带来的困难；3）使用“切片保持环”以防止切片组顺序混乱；4）使用“水面上升环”，确保切片位于水的顶端，并首先接触载网，从而将其准确放置在载网的预定位置；5）将支持膜置于铝制支架上，便于将切片回收至载网，并防止支持膜起皱；6）使用染色管，避免镊子操作时意外破坏支持膜。这一新方法可轻松获得连续超薄切片，使得以高分辨率进行微生物细胞结构的三维分析成为可能，而这是自动胶带收集超薄切片机方法、连续块面扫描电镜或聚焦离子束扫描电镜所无法实现的。
引言
正确的连续超薄切片技术对于在电子显微镜水平上三维研究细胞及细胞组分至关重要。我们研究了酵母细胞细胞周期中纺锤极体的动态变化，揭示了其超微结构在细胞周期中的形态变化以及复制时间1,2,3,4,5。2006年，我们将“structure”与“-ome”组合，提出一个新词“structome”，并将其定义为“在电子显微镜水平上，整个细胞的定量三维结构信息”6,7。
通过需要连续超薄切片技术的结构组分析发现，Saccharomyces cerevisiae 和 Exophiala dermatitidis 的酵母细胞约含有 200,000 个核糖体7, 8，大肠杆菌（Escherichia coli）细胞含有 26,000 个核糖体9，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）细胞含有 1,700 个核糖体10，而 Myojin 螺旋菌仅含有 300 个核糖体11。这些信息不仅有助于估算每种生物的生长速率，还可用于物种鉴定9。
此外，结构组学分析促成了一种新生物体的发现；在日本近海深海区域发现了Parakaryon myojinensis，其细胞结构介于原核生物与真核生物之间12,13,14,15。目前，连续超薄切片技术被认为难度较高，需要较长时间才能掌握。在本研究中，我们建立了一种可靠的方法，使任何人都能够轻松地进行连续超薄切片操作。
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方案
注意：本研究中使用的样品为微生物，采用液氮中的丙烷快速冷冻，经含2%四氧化锇的丙酮进行冷冻置换，最后包埋于环氧树脂中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18。
1. 支持膜的制备（图1-3）
注意：银色的明胶膜（Formvar support film）采用玻璃浇铸法制备19。
- 向Formvar制膜装置中加入100 mL 1.5%的二氯乙烯Formvar溶液图1）将载玻片（76 mm × 26 mm × 1.3 mm）的一半浸入装置上部柱体中的Formvar溶液中，方法是使用橡胶球通过“a”处向溶液加压空气19.
- 打开三通旋塞，通过“b”处释放空气以减小压力，排出柱中的溶液。从装置中取出载玻片，在空气中晾干，使表面形成薄膜。使用白炽灯加速Formvar膜的干燥。
- 用剃刀刀片刮去载玻片上薄膜的四个边缘后（图2a，并向载玻片呼气以促进薄膜与载玻片的分离20，通过将载玻片以较低的水平角度（约10°）缓慢浸入水中，使薄膜在水面上漂浮起来 图2b).
- 使用带有孔洞（直径 4 mm）的铝架（30 mm × 25 mm × 3 mm）从水中捞起 Formvar 膜图3a）。将带有福尔马林薄膜的架子置于干燥器中，直至使用。图3b).
2. 在体视显微镜下使用超声波修块刀片和剃刀刀片修整样本块 21（图4）
- 使用光学显微镜观察块状样本的顶端，确认其表面存在细胞（图4a）。
- 将样本块安装在卡盘（块状样本夹持器）中，并将卡盘安装到修整台上21（图4b）。该修整台具备从样本背面照射的照明装置。
- 将样本块修整至0.7 mm × 1.0 mm大小（图4c、图5d）。由于环氧树脂非常坚硬，应首先使用超声波修整刀进行初步修整。超声波修整刀是一种新引入的设备，可轻松完成样本块的修整。随后再用剃刀进一步修整样本块。切去一侧肩部以标记切片方向（见图5d、图8）。
3. 使用切片机和金刚石刀修整样本块（图5）
- 将样品块夹头安装在超薄切片机的样品 holder 中。当进行连续超薄切片时，将样品相对于实际位置逆时针旋转 90° 放置（见图 5d）。
- 使用金刚石修块刀切割样品块表面（见图 5d）。将金刚石刀刃与样品块表面平行，尽可能少地切去样品表面，以避免丢失任何样品部分（图 5d）。
注意：此步骤旨在使样品表面平整。样品块窄部的表面部分保持原样（因此该区域不像镜面般反光，图 5d），以确保连续切片时不会损失任何样品，因为样品已暴露在块表面。 - 将一面镜子（Mesa 切法，M）放置于刀座上，用于监测样品块的切削过程（图 5c）。
- 将刀座向左旋转 30°，使用修块刀切割样品块的左侧边缘（该侧在连续切片中将成为样品的上侧，图 5d）（图 5a）。
- 将刀座向右旋转 30°，从样品左侧边缘约 100 µm 处切割样品块表面（该侧在连续切片中将成为样品的下侧，图 5d）（图 5b）。
注意：连续切片将从尺寸约为 90 nm × 约 1 mm 的样品窄部区域获取。较大区域用于调整样品表面与刀刃之间的平行度。在完成样品表面与刀刃的平行校准后，使用剃刀片去除该较大部分。通过切片机切割样品的上下两侧，可使样品两侧表面光滑且彼此精确平行（图 5d），这是获得平直且连续不断的带状切片所必需的条件。
4. 调整样本表面与刀刃，使其相互平行21
- 取下修块刀，将样品块顺时针旋转90°。
- 将超薄切片刀安装至刀架上。
- 利用样品表面的较大区域，调整样品表面与刀刃，使其相互平行。
注意：使用样品的较大区域进行调整，是因为连续切片的切割面非常小，仅依靠该区域难以精确调整样品表面与刀刃的相对位置，尤其是在垂直方向上。因此，利用样品的较大区域可使调整更为简便。
5. 在样品块上涂布氯丁橡胶溶液（图6）
- 为将样本夹准确放置到与原始位置完全相同的位置，需在切片机的样本夹和夹持座上贴上胶带，并在边界处剪开（图6a）。
- 从切片机中取出样本夹，置于体视显微镜下（图6b），用剃刀片切去样本的大部分，仅保留用于连续切片的细窄部分。
- 使用巴斯德吸管，将约1 µL的0.5%氯丁橡胶溶液（图6b）滴加至待连续切片的样本上，使切片侧面具有黏附性。用氯丁橡胶溶液完全覆盖整个样本，并立即用靠近样本的滤纸吸去多余的溶液。获得连续切片带对于拍摄连续细胞切片图像至关重要，而氯丁橡胶胶水在使切片彼此粘连方面非常有效。
- 准备三狭缝载网（狭缝尺寸：中间为0.4 mm × 2.2 mm，两侧为0.2 mm × 2.2 mm）（图6c），通过将载网柄弯曲至60°，用0.5%氯丁橡胶溶液处理载网，并通过辉光放电处理使载网具有亲水性，以用于拾取连续切片22。
6. 连续切片的制备（图7-9）
- 通过将带子部分对齐，将样品块夹头重新放回切片机中，位置与5.1相同（图6a），以保持样品表面与刀刃完全平行。然后将刀片移近样品。
- 向刀槽中注满水。
- 用塑料罩盖住切片机，以防止气流干扰（图7）。
注意：在超薄切片及收集切片过程中，气流常会引起问题。塑料罩上有三个孔：一个用于双目镜，另外两个用于手臂操作，以便在罩子覆盖时仍可进行操作。木质扶手用于在进行精细操作（如用载网收集连续切片）时支撑手臂。木质扶手应放置在与切片机台面不同的桌面上（图7，箭头所示），以避免操作者手部振动传递至切片机。 - 以200 nm的切片厚度开始切片（图8）。设置为200 nm厚度有助于节省将刀片调整至样品表面所需的时间。
- 切下第一片后，将切片厚度设为70 nm（图8）。
- 当连续切片数量达到20片时（准确地说，当切片带长度达到约1.8 mm时；切片数量因切片宽度而异），在继续切片的同时将切片厚度设为10 nm（图8）。
注意：由于切片机无法切割10 nm厚的切片，因此不会产生新的切片，而已切下的切片会从刀刃处分离。获得分离的切片组（图9）对于拾取连续切片至关重要，可避免使用两根毛发手动分离切片时的困难。由于透射电子显微镜的视场为2.0 mm，切片长度最多应为1.8 mm。 - 将切片厚度设为60 nm（图8）。由于仪器会叠加之前设置的10 nm厚度，因此实际将产生70 nm的切片（图8）。
- 将切片厚度恢复至70 nm（图8），并继续切片，直至获得长度为1.8 mm的切片。
- 重复步骤6.6–6.8，直至获得五组长度为1.8 mm的切片（图9）。我们通常制备五组切片，因为本实验室的透射电子显微镜配有五个样品 holder，但五组并非上限。
7. 捞取连续切片（图 10-12）
- 放置“切片固定环”23 （环的内径：5.0 mm）图10a）在第三组切片上（图10b).
注意：必须按照切片的顺序取下组织片以便按正确顺序拍照。然而，由于刀架上有五组切片，常常难以分辨各组对应顺序。通过将环置于第三组上，可明确靠近操作者一侧的两组为第一组和第二组，远离操作者的两组为第四组和第五组图10b这将防止顺序混淆。 - 放置“水面提升环”23 （WSRL，环内径：4.0 mm）图11a）置于刀片台上（图11b）。由于底部装有磁铁，WSRL 将牢固地固定在刀片台上。
- 将WSRL的环置于连续切片上方，通过移动其杆部和手柄进行调整。将WSRL的环缓缓降至水面上，使环完全包围切片。
- 通过向下旋转螺丝使环向下移动，从而借助表面张力使水面升高（图11c-d）。将切片移至环的中央，置于水的顶端，并利用一根毛发调整切片的方向。21.
- 用镊子夹住裸露的狭缝网格，保持其与水面平行，通过接触来拾取切片组（图11d）。切片应先接触载网，再接触水，以确保切片准确地位于载网中心图11d).
- 将带有切片的载网连同一小滴水置于Formvar支持膜上16 (图12），并用滤纸吸去多余水分。
注意：当使用带有支持膜的载网捞取切片时，支持膜出现皱褶通常是一个常见问题，因为膜（切片）会直接接触膜（支持膜）。通过将带有切片的载网连同一小滴水液滴置于Formvar支持膜上，可显著减少支持膜产生皱褶的问题。16.
8. 染色切片16, 24（图13）
- 切片完全干燥后，从载网周围撕下聚乙烯醇缩醛膜，并取下带有切片的载网。
- 将载网放入染色管的凹槽中16 正确的顺序图13），并用醋酸铀和柠檬酸铅染色切片24.
注意：用剃刀刀片沿管的长轴切割出一条深0.6 mm的凹槽。该管在使用镊子时可有效防止支撑膜意外破裂，因为在染色和洗涤过程中无需直接操作载网。16.
9. 连续切片的观察（图14）
- 将多标本 holder 中的 5 个载网按正确顺序放置（图 14a），使载网狭缝的长轴方向垂直于标本 holder 的轴线。载网的手柄部分（箭头所示）无需剪除，因为“载网固定器”不会接触手柄部位。
- 使用“载网固定器”固定载网（图 14b），然后将标本 holder 插入透射电子显微镜中。
注意：在拍摄目标细胞图像之前，通常先对所有细胞切片进行低倍成像（图 15），以寻找形态良好、无污染且固定效果理想的感兴趣微生物或细胞，这一步骤十分有用。 - 以高倍镜对所有细胞切片中的目标细胞进行拍照。
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结果
本方案中，使用三缝网格捞取连续切片。网格由镍或铜制成，连续切片置于中间的狭缝上。两侧的狭缝在用网格捞取切片时用于观察切片位置。为在用镊子夹持网格捞取切片时保持网格与连续切片平行（图11d），需将手柄部分弯曲（图6c，右图）。较小的手柄有助于防止网格主体发生弯曲——这种弯曲会导致切片捞取困难，并有助于避免染色过程中切片脱落。相比传统的2.0 mm × 1.0 mm单孔网格，这种三缝网格具有优势：在三缝网格中，切片由相距0.4 mm（窄于1.0 mm）的两条金属条以及聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）支持膜直接支撑；而在传统单孔网格中，切片仅由支持膜支撑。因此，使用三缝网格可在高倍摄影时有效防止样品漂移。
图15 显示了承载连续切片的五个载网的低倍视野。由于每张切片均保持完整贴合，...
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讨论
本文介绍的方法无需昂贵的设备，仅需一个铝制支架（图3）、三狭缝网格（图6c）、切片保持环（图10a）、抬升水表面环（图11a）以及染色管（图13）。本方法具有多个特点：利用样本的大部分区域来调节样本表面与刀刃，使其相互平行。将连续切片分组切割，以避免在将一组连续切片转移至狭缝网格时，使用两根毛发分离切片所带来的困难。使用“切片保持环”可防止切片组的顺序混乱。使用“抬升水表面环”可确保切片位于水的顶端，并首先接触网格，从而将其准确放置在网格的预定位置。在铝制支架上使用聚乙烯醇缩甲醛（Formvar）支撑膜，有助于将切片回收至网格上，并防止支撑膜起皱。使用染色管可避免镊子意外损坏支撑膜。
最近开发了一种自动胶带收集超薄切片机25，可将超薄切片自...
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
我们衷心感谢北 士刚（Shigeo Kita）提出的宝贵建议和讨论。同时感谢 John 和 Sumire Eckstein 对手稿的认真审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Formvar 制膜装置 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 652 | W 180 x D 180 x H 300 mm |
| 玻璃载片 | Matsunami Co. Ltd., Osaka | - | 76 x 26 x 1.3 mm |
| 带 4 mm 孔的铝制支架 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 658 | W 30 x D 25 x H 3 mm，参见本文 |
| 体视显微镜 | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SMZ 645 |
| 体视显微镜用 LED 照明 | Nikon Co. Ltd., Tokyo | - | SM-LW 61 Ji |
| 修块台 | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | 带倾斜机构，参见本文 |
| 修块台用 LED 照明 | Sunmag Co.Ltd., Tokyo | - | 参见本文 |
| 超声修块刀片 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240，参见本文 |
| 修块用金刚石刀 | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| 超薄切片用金刚石刀 | Diatome Co. Ltd., Switzerland | - | 45° |
| 超薄切片机 | Leica Microsystems, Vienna | - | Ultracut S |
| 台面切割装置 | Leica Microsystems, Vienna | - | 镜面 |
| 0.5% 氯丁橡胶 W 溶液 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
| 特制三狭缝镍网 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2458 | 参见本文 |
| 特制三狭缝铜网 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2459 | 参见本文 |
| 切片承载环 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 526 | 参见本文 |
| 水面提升环 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 527 | 参见本文 |
| 染色管 | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | 参见本文 |
| 多标本持载器 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | EM-11170 |
| JEM-1400 | JEOL Co. Ltd., Tokyo | - | 透射电子显微镜 |
参考文献
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