线粒体 Ca2+ 保留能力检测与 Ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测

摘要

本方案旨在逐步描述一种检测SH-SY5Y细胞分离线粒体的Ca²⁺保留能力及Ca²⁺诱导线粒体肿胀的方法。

摘要

通过氧化磷酸化生成ATP是线粒体的主要功能。在高等真核生物中，线粒体还参与细胞质Ca²⁺的缓冲作用，且线粒体内游离Ca²⁺浓度可介导线粒体的ATP生成。Ca²⁺保留能力可被视为线粒体在基质中保留钙的能力。细胞内Ca²⁺的积累会导致线粒体内膜通透性增加，称为线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，从而引起分子量小于1.5 kDa的分子泄漏。由Ca²⁺触发的线粒体肿胀可用于指示mPTP的开放。本文描述了两种用于检测分离线粒体中Ca²⁺保留能力和Ca²⁺触发的线粒体肿胀的实验方法。在加入一定量的Ca²⁺后，所有步骤均可在一天内完成，并由酶标仪记录结果。因此，这两种简单而有效的检测方法可用于评估与Ca²⁺相关的线粒体功能。

引言

线粒体是哺乳动物细胞中主要的细胞器，通过氧化磷酸化产生细胞内近95%的ATP。据报道，线粒体可螯合微摩尔浓度的Ca²⁺，并在ADP和无机磷酸盐存在的情况下，将ADP磷酸化以合成ATP¹。当胞质Ca²⁺浓度超过一定阈值时，线粒体可快速摄取Ca²⁺，并缓慢释放。因此，功能正常的线粒体能够吸收升高的胞质Ca²⁺。除了参与氧化磷酸化外，线粒体内的Ca²⁺还参与调控胞质钙信号，并通过诱导线粒体内膜上mPTP的开放来激活线粒体介导的凋亡机制²。目前普遍认为，细胞内Ca²⁺浓度异常升高可通过打开mPTP导致线粒体发生显著肿胀³。因此，本实验方案旨在通过定量测定线粒体Ca²⁺的保留能力以及Ca²⁺诱导的线粒体肿胀，来评估线粒体功能。

Ca²⁺滞留能力用于衡量线粒体摄取胞质钙离子的能力。线粒体可通过摄取钙离子形成无活性的沉淀物，从而缓冲胞质游离钙浓度，并调控钙依赖性细胞过程。在与能量受限相关的应激现象甚至神经退行性疾病中，均会出现Ca²⁺滞留能力受损^4,

方案

1. 线粒体的分离

注意：所有溶液和仪器应预冷至 0 - 4 °C，并置于冰上保存。

1. 在10 cm细胞培养皿中接种约3 × 10⁶个SH-SY5Y细胞。使用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）-链霉素（100 µg/mL）的高糖Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。于含5% CO₂的培养箱中37 °C过夜培养。
   注意：每次分离实验至少需要1 - 2 × 10⁷个SH-SY5Y细胞。
2. 吸去培养基，用约1 mL预冷的PBS在10 cm细胞培养皿中洗涤细胞3次。
3. 向10 cm细胞培养皿中加入1 mL预冷的PBS，刮下贴壁细胞并转移至新的1.5 mL离心管中。在4 °C下以800 × g离心10分钟。
4. 在离心过程中，配制5 mL线粒体分离缓冲液（250 mM蔗糖，10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），10 mM KCl，1.5 mM MgCl₂，1 mM EDTA），并加入50 μL蛋白酶抑制剂储备液（100倍 浓度；1片无EDTA蛋白酶抑制剂片剂溶于500 µL ddH₂O中）。
5. 弃去上清液，用1 mL线粒体分离缓冲液重悬沉淀。将1.5 mL离心管置于冰上孵育30分钟。
6. 在冰上使用玻璃匀浆....

结果

Ca的代表性结果²⁺ 保留能力：
结果以荧光值表示。通过额外的 Ca 脉冲²⁺ （200 nmols/mg 线粒体蛋白），随着mPTP开放，荧光强度较基线水平增加了一倍。 5 μM 邦克列酸（BKA），一种Ca²⁺-诱导的mPTP开放，或 1 μM atractyloside（ATR），一种Ca的激活剂²⁺诱导的mPTP开放，在分离的线粒体中加入。所加入的总钙量²⁺ 直到mPTP开放，表现为荧光强度较基线水平升高两倍，被解读为Ca²⁺ 保留能力。我们的数据显示，线粒体 Ca²⁺ BKA治疗组的保留能力远高于ATR组。这些数据证实了线粒体Ca测量的适宜性²⁺ 保留能力（图3).

Ca

讨论

本文介绍了一种简单且有效的线粒体Ca²⁺蓄积能力检测以及Ca²⁺诱导的线粒体肿胀检测方案。

进行线粒体分离时，确保所有材料和离心管均置于冰上，尤其是在细胞匀浆过程中。可使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下处理5分钟，以使细胞从培养皿上脱落。经过15至25次研磨后，必须在显微镜下观察细胞膜的完整性，并避免线粒体膜破裂。然而，我们所获得的线粒体为粗制线粒体，可通过1.0 M/1.5 M不连续蔗糖梯度离心进一步纯化获得纯化的线粒体。由于周围培养基成分浓度的影响，活细胞中线粒体的生物学特性比分离后的线粒体更接近体内（in vivo）状态。线粒体Ca²⁺保留能力或Ca²⁺诱导的线粒体肿胀实验均在供能条件下测定。为评估线粒体功能，可添加5 mM琥珀酸作为呼吸底物，替代谷氨酸和苹果酸⁶。

Ca²⁺-结合型绿色荧光染料（与Ca²⁺的结合亲.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SH-SY5Y 细胞系	ATCC（全球生物资源中心）	ATCC 编号：CRL-2266
钙绿-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+结合型绿色荧光染料
完全蛋白酶抑制剂	Roche 分子生化公司	4693116001
玻璃匀浆器	Kimble Chase	9885303002
谷氨酸	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
苹果酸	Sigma-Aldrich	46940-U
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan Flash 仪器	Thermo Scientific	IC100E
棒曲霉素	Biovision	1820-100
乌头苷	Sigma-Aldrich	C4992
高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基	Hyclone	SH30022	含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠
胎牛血清	Hyclone	SV30087
青霉素	Sigma-Aldrich	P3032
链霉素	Invitrogen	11860-038
BCA 检测试剂盒	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm 细胞培养皿	NEST	704001