线粒体 Ca2+ 保留能力检测与 Ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测

摘要

本方案旨在逐步描述一种检测SH-SY5Y细胞分离线粒体的Ca²⁺保留能力及Ca²⁺诱导线粒体肿胀的方法。

摘要

通过氧化磷酸化生成ATP是线粒体的主要功能。在高等真核生物中，线粒体还参与细胞质Ca²⁺的缓冲作用，且线粒体内游离Ca²⁺浓度可介导线粒体的ATP生成。Ca²⁺保留能力可被视为线粒体在基质中保留钙的能力。细胞内Ca²⁺的积累会导致线粒体内膜通透性增加，称为线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，从而引起分子量小于1.5 kDa的分子泄漏。由Ca²⁺触发的线粒体肿胀可用于指示mPTP的开放。本文描述了两种用于检测分离线粒体中Ca²⁺保留能力和Ca²⁺触发的线粒体肿胀的实验方法。在加入一定量的Ca²⁺后，所有步骤均可在一天内完成，并由酶标仪记录结果。因此，这两种简单而有效的检测方法可用于评估与Ca²⁺相关的线粒体功能。

引言

线粒体是哺乳动物细胞中主要的细胞器，通过氧化磷酸化产生细胞内近95%的ATP。据报道，线粒体可螯合微摩尔浓度的Ca²⁺，并在ADP和无机磷酸盐存在的情况下，将ADP磷酸化以合成ATP¹。当胞质Ca²⁺浓度超过一定阈值时，线粒体可快速摄取Ca²⁺，并缓慢释放。因此，功能正常的线粒体能够吸收升高的胞质Ca²⁺。除了参与氧化磷酸化外，线粒体内的Ca²⁺还参与调控胞质钙信号，并通过诱导线粒体内膜上mPTP的开放来激活线粒体介导的凋亡机制²。目前普遍认为，细胞内Ca²⁺浓度异常升高可通过打开mPTP导致线粒体发生显著肿胀³。因此，本实验方案旨在通过定量测定线粒体Ca²⁺的保留能力以及Ca²⁺诱导的线粒体肿胀，来评估线粒体功能。

Ca²⁺滞留能力用于衡量线粒体摄取胞质钙离子的能力。线粒体可通过摄取钙离子形成无活性的沉淀物，从而缓冲胞质游离钙浓度，并调控钙依赖性细胞过程。在与能量受限相关的应激现象甚至神经退行性疾病中，均会出现Ca²⁺滞留能力受损^4,5。可通过分离的线粒体或经皂苷（digitonin）透化的细胞来测定Ca²⁺滞留能力，而添加谷氨酸和苹果酸后，分离线粒体积累Ca²⁺的能力增强，这一特性不受线粒体分离操作的影响⁶。应使用经滴定确定的适量皂苷处理不同类型细胞，以实现细胞质膜的选择性透化。Ca²⁺结合型绿色荧光染料的六钾盐是一种对Ca²⁺敏感、细胞不可渗透、可在可见光激发下检测的指示剂，已被广泛应用⁷。该Ca²⁺结合型绿色荧光染料为低亲和力指示剂，可用于显示在长时间（5分钟）刺激过程中，细胞内游离Ca²⁺浓度持续上升的现象⁸。该方法相比放射性滤膜技术灵敏度较低，但操作显著简化。外源添加的Ca²⁺会使钙绿染料荧光增强，而线粒体对Ca²⁺的摄取则使荧光恢复至基线水平。通过连续多次添加Ca²⁺，直至线粒体无法再摄取胞外Ca²⁺为止⁹。可使用荧光酶标仪连续监测钙绿染料的荧光信号变化。

钙²⁺累积后，线粒体发生去极化，将钙²⁺释放到培养基中，并开始肿胀。由钙²⁺触发的线粒体肿胀可用于指示线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放。可通过电子显微镜观察以及在540 nm处光吸收度的降低来检测钙²⁺触发的线粒体肿胀^10,11。线粒体体积还可通过前向角光散射技术直接测定¹²，其中吸收度的降低反映了线粒体基质的被动性肿胀。

本文阐述了检测SH-SY5Y细胞分离线粒体中线粒体Ca²⁺保留能力及Ca²⁺诱导线粒体肿胀的方法。

方案

1. 线粒体的分离

注意：所有溶液和仪器应预冷至 0 - 4 °C，并置于冰上保存。

1. 在10 cm细胞培养皿中接种约3 × 10⁶个SH-SY5Y细胞。使用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）-链霉素（100 µg/mL）的高糖Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。于含5% CO₂的培养箱中37 °C过夜培养。
   注意：每次分离实验至少需要1 - 2 × 10⁷个SH-SY5Y细胞。
2. 吸去培养基，用约1 mL预冷的PBS在10 cm细胞培养皿中洗涤细胞3次。
3. 向10 cm细胞培养皿中加入1 mL预冷的PBS，刮下贴壁细胞并转移至新的1.5 mL离心管中。在4 °C下以800 × g离心10分钟。
4. 在离心过程中，配制5 mL线粒体分离缓冲液（250 mM蔗糖，10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），10 mM KCl，1.5 mM MgCl₂，1 mM EDTA），并加入50 μL蛋白酶抑制剂储备液（100倍 浓度；1片无EDTA蛋白酶抑制剂片剂溶于500 µL ddH₂O中）。
5. 弃去上清液，用1 mL线粒体分离缓冲液重悬沉淀。将1.5 mL离心管置于冰上孵育30分钟。
6. 在冰上使用玻璃匀浆器手动上下匀浆（15 - 25次）裂解悬浮细胞。
   注意：匀浆过程中应避免产生气泡。在显微镜下目视计数完整细胞和裸露细胞核，确认细胞破裂率超过>90%。
7. 将匀浆液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以1,000 × g离心5分钟，以去除碎片（细胞核和残留的完整细胞）。
8. 将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，在4 °C下以1,000 × g离心5分钟。
9. 将上清液转移至新离心管中，在4 °C下以14,000 × g离心15分钟。
10. 弃去上清液，用1 mL线粒体分离缓冲液重悬含有线粒体的沉淀。
11. 在4 °C下以14,000 × g离心15分钟，沉淀线粒体。
12. 所得线粒体沉淀需保持在冰上，并根据沉淀体积用50 - 100 μL KCl培养基（125 mM KCl，2 mM K₂HPO₄，1 mM MgCl₂，20 mM HEPES，5 mM谷氨酸，5 mM苹果酸，2 μM鱼藤酮，pH 7.4）重悬，用于后续实验。
13. 取5 μL线粒体溶液，采用标准BCA法测定线粒体蛋白浓度，使用酶标仪测定OD562¹³。

2. 线粒体 Ca²⁺ 保留能力的测定

1. 准备KCl培养基，并在实验前加入Ca²⁺-结合型绿色荧光染料，使其终浓度为0.5 μM。
2. 将1 mL分离的线粒体（0.4 mg/mL）转移至含有0.5 μM Ca²⁺-结合型绿色荧光染料的KCl培养基中，每孔加入一个6孔板的孔内。
3. 将含有Ca²⁺-结合型绿色荧光染料的线粒体在6孔板中于室温避光孵育1分钟。使用自动分配设置，向每个6孔板孔中加入4 μL的20 mM CaCl₂溶液（20 mM CaCl₂、127 mM KCl、1 mM MgCl₂、20 mM HEPES、5 mM谷氨酸、5 mM苹果酸，pH 7.4），使每毫克线粒体蛋白引入200 nmol Ca²⁺。
4. 使用荧光分光光度计监测荧光变化，每3秒记录一次，持续2分钟，激发波长为506 nm，发射波长为531 nm。仪器软件控制在每次读数之间以600 rpm转速振荡3秒（图1）。
5. 向每个孔中再加入4 μL的20 mM CaCl₂溶液，并每3秒监测一次荧光变化，持续2分钟。重复此步骤，直至荧光随时间增加。
   注意：线粒体受到所添加Ca²⁺的刺激，表现为记录的荧光增强。当mPTP开放时，荧光随时间增加。
6. 将mPTP开放前累计加入的Ca²⁺总量解释为Ca²⁺保留能力。

3. 钙的测定 ²⁺诱导的线粒体肿胀

1. 实验前准备好KCl培养基。
   1. 将1 mL分离的线粒体（0.4 mg/mL）置于KCl培养基中，分别加入6孔板的每个孔中。
2. 向线粒体蛋白中加入10 μL 20 mM CaCl₂水溶液（500 nmol/mg线粒体蛋白），以诱导线粒体肿胀。
3. 使用软件控制的酶标仪，每3秒记录一次540 nm处吸光度的下降，持续10分钟（图2）。荧光变化是由溶质穿过线粒体内膜流入所引起的。
   注意：540 nm处吸光度的降低对应于线粒体肿胀。若未观察到吸光度下降，可采用更长的读数间隔或延长读数时间。

结果

Ca²⁺保留能力的代表性结果：
结果以荧光值表示。随着Ca²⁺的逐次脉冲式添加（200 nmol/mg线粒体蛋白），在线粒体通透性转换孔（mPTP）开放时，荧光值较基线升高至两倍。在分离的线粒体中分别加入5 μM博吉克雷酸（BKA）——一种抑制Ca²⁺诱导mPTP开放的抑制剂，或1 μM乌头苷（ATR）——一种促进Ca²⁺诱导mPTP开放的激活剂。以荧光值较基线升高两倍作为mPTP开放的标志，此时所累计添加的Ca²⁺总量即被定义为Ca²⁺保留能力。我们的数据显示，BKA处理组的线粒体Ca²⁺保留能力显著高于ATR组。这些结果证实了线粒体Ca²⁺保留能力测定的可靠性（图3）。

Ca

讨论

本文介绍了一种简单且有效的线粒体Ca²⁺蓄积能力检测以及Ca²⁺诱导的线粒体肿胀检测方案。

进行线粒体分离时，确保所有材料和离心管均置于冰上，尤其是在细胞匀浆过程中。可使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下处理5分钟，以使细胞从培养皿上脱落。经过15至25次研磨后，必须在显微镜下观察细胞膜的完整性，并避免线粒体膜破裂。然而，我们所获得的线粒体为粗制线粒体，可通过1.0 M/1.5 M不连续蔗糖梯度离心进一步纯化获得纯化的线粒体。由于周围培养基成分浓度的影响，活细胞中线粒体的生物学特性比分离后的线粒体更接近体内（in vivo）状态。线粒体Ca²⁺保留能力或Ca²⁺诱导的线粒体肿胀实验均在供能条件下测定。为评估线粒体功能，可添加5 mM琥珀酸作为呼吸底物，替代谷氨酸和苹果酸⁶。

Ca²⁺-结合型绿色荧光染料（与Ca²⁺的结合亲...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SH-SY5Y 细胞系	ATCC（全球生物资源中心）	ATCC 编号：CRL-2266
钙绿-5N	Life Technologies	c-3737	Ca2+结合型绿色荧光染料
完全蛋白酶抑制剂	Roche 分子生化公司	4693116001
玻璃匀浆器	Kimble Chase	9885303002
谷氨酸	Sigma-Aldrich	RES5063G-A7
苹果酸	Sigma-Aldrich	46940-U
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	00457
K2HPO4	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl2	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan Flash 仪器	Thermo Scientific	IC100E
棒曲霉素	Biovision	1820-100
乌头苷	Sigma-Aldrich	C4992
高糖 Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基	Hyclone	SH30022	含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠
胎牛血清	Hyclone	SV30087
青霉素	Sigma-Aldrich	P3032
链霉素	Invitrogen	11860-038
BCA 检测试剂盒	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
10 cm 细胞培养皿	NEST	704001