研究铁（氧）氢氧化物、微量元素与细菌之间厌氧生物地球化学相互作用的实验柱装置设置

摘要

砷和汞在含水层中的归趋与形态转化与其物理化学条件及微生物活性密切相关。本文介绍了一种原创的实验柱装置，可模拟含水层环境，有助于深入理解厌氧条件下痕量元素的生物地球化学行为。文中展示了两个结合地球化学与微生物学方法的研究实例。

摘要

微量元素（如砷（As）和汞（Hg））在含水层中的归趋与形态转化与其所处的物理化学条件（如氧化还原电位（Eh）和pH值）密切相关，同时也受到微生物活动的影响，这些活动可能直接或间接地影响其形态和/或迁移性。事实上，某些细菌可直接将As(III)氧化为As(V)，或将As(V)还原为As(III)。同样，细菌在汞的循环中也起着关键作用，既可通过甲基化作用生成神经毒素——一甲基汞，也可通过还原作用将汞转化为单质Hg°。As和Hg的归趋还与土壤或含水层的组成密切相关；例如，As和Hg可与有机化合物或（氧）氢氧化物结合，从而影响其迁移能力。此外，细菌介导的过程，如铁（氧）氢氧化物的还原或有机质的矿化，也可能间接影响As和Hg的固定。硫酸盐/硫化物的存在亦可通过形成硫代砷酸盐（与As）或黑辰砂（与Hg）等络合物，显著影响这些元素的行为。

因此，关于砷和汞在环境中的归趋与形态转化，以及如何限制其毒性，人们提出了许多重要问题。然而，由于它们与含水层组分具有较高的反应活性，难以明确区分所发生的生物地球化学过程及其对这些痕量元素归趋的不同影响。

为此，我们开发了一种原创的、可模拟含水层的实验柱装置，该装置包含富砷或汞的铁氧化物区域以及缺铁区域，有助于更好地理解在缺氧条件下痕量元素的生物地球化学行为。以下方案逐步介绍了针对砷或汞的实验柱构建方法，并提供了在铁和硫酸盐还原条件下砷的示例实验。

引言

了解和预测环境中痕量元素（TE）的迁移性及生物地球化学行为，对于监测、制定和实施污染场地的适当管理措施至关重要。这一点尤其适用于砷（As）和汞（Hg）等有毒痕量元素。这些痕量元素在土壤或含水层中的归趋和形态与其所处的理化条件（如Eh和pH）密切相关，同时也受到微生物活动的影响，微生物可能直接改变其形态，或间接影响其迁移性。

事实上，某些细菌能够直接将As(III)氧化为As(V)，或将As(V)还原为As(III)。这一过程影响砷的毒性，因为As(III)是砷最具毒性的形态；同时也影响其迁移性，因为As(III)比As(V)更具移动性，而As(V)容易吸附在铁（氧）氢氧化物或有机质上^1,2。同样，细菌在汞的循环中也起着重要作用，一方面通过硫酸盐还原菌和铁还原菌主导的甲基化作用^3,4，生成神经毒素甲基汞（易在食物链中生物富集），另一方面通过将其还原为易挥发的单质汞（Hg°）⁵。

砷（As）和汞（Hg）的环境归宿也与土壤或含水层的组成密切相关，因为有机质或铁（氧）氢氧化物等化合物会影响它们的固定和生物可利用性。As(V) 能很好地吸附在铁（氧）氢氧化物上⁶，而 Hg 对有机质（OM；主要为巯基）具有极高的亲和力，在缺乏有机质的环境中，也可与胶体态的铁或锰（氧）氢氧化物强烈结合^7,8,9,10,11。

细菌活动可通过还原铁（氧）氢氧化物或矿化有机质，影响吸附在（氧）氢氧化物或有机质上的痕量元素（TEs）的归趋。在硫缺乏区域，细菌直接还原铁是铁还原的主要途径^12,13，其中Fe(III)作为末端电子受体；而间接途径中，Fe(III)可被细菌硫酸盐还原所产生的硫化物还原为Fe(II)¹⁴。此外，硫酸盐的存在还可通过形成硫代砷酸盐¹⁵（与As）或硫汞矿（与Hg）等络合物，改变Hg和As的形态分布。

因此，更深入地理解铁和硫酸盐循环对痕量元素（如 Hg 和 As）归趋的影响，有助于我们更好地管理污染场地，并维持土壤和水质。相关数据还可用于完善现有的金属迁移模型。微生物介导的 Fe(III) 还原^16,17,18 可导致痕量元素的解吸。理论上，由硫酸盐微生物还原产生的硫化物对铁（氧）氢氧化物的间接还原也可能影响痕量元素的迁移性。然而，这些反应的程度和动力学通常在均质批量体系或批量微宇宙系统中进行研究^16,18,19,20。批量实验的局限性在于无法区分所发生的各种现象；实际上，反应活性依赖于且受限于体系中存在的资源，仅能提供物种形态变化和吸附行为的最终结果。采用柱实验方法则可实现流入介质的持续更新，并能够对痕量元素在时间和空间上的归趋进行监测。与含水层实际情况相比，这些条件更具代表性，因为真实环境中的过程与连续渗透条件密切相关。此外，含水层沉积物中铁（氧）氢氧化物的非均质分布十分常见^21,23，固相矿物学和化学组成的空間变化无疑会驱动微生物活性。

为了阐明这些非均质性对地球微生物现象及铁相关痕量元素（TE）归趋的影响，我们开发了一种实验室连续进料柱装置，用以模拟简化的含水层模型。该柱体填充方式可在柱体入口处形成一个缺铁区，而在顶部形成一个富铁区。规则分布的取样口使我们能够分别研究各个区域以及与界面相关的过程。该实验装置在研究汞（Hg）的归趋与形态转化方面的应用实例已有报道²⁴。本文将详细描述该实验系统的构建，并提供其应用于研究砷（As）在污染含水层中行为的第二个实例。

方案

1. 实验准备

1. 将所有与样品接触的材料（玻璃、聚四氟乙烯（PFTE））用酸清洗（体积分数为20%的硝酸（HNO₃）浸泡5天，随后用体积分数为10%的盐酸（HCl）浸泡5天）。用超纯水冲洗数次，并在使用前于层流罩下干燥。
2. 所有涉及化学品的操作步骤均需佩戴聚乙烯手套（或类似材质手套）并在通风橱中进行。

2. 制备加标无定形铁氧化物（含汞和砷）

1. 准备约 20 g 的水合氧化铁（Fe(OH)₃）：在玻璃反应器中，将 50 g FeCl₃-6H₂O 溶于 500 mL 超纯水（电阻率 >18 MΩ cm^-1），使用不锈钢搅拌桨或磁力搅拌器搅拌。初始 pH 值 <2。
2. 手动加入 10 M NaOH 溶液以沉淀水合氧化铁。
   注意：沉淀全部铁（氧）氢氧化物约需 50 mL。调节 pH 至 6，并持续搅拌 1 小时以使其稳定。
   1. 对于加标 Hg 的（氧）氢氧化物：配制 10 mL 浓度为 10 g L^-1 的 HgNO₃ 溶液，并向（氧）氢氧化物悬液中加入 350 µL。
      注意：这将使湿态（氧）氢氧化物中的最终 Hg 含量约为 ~4 µg g^-1（氧）氢氧化物。
   2. 对于加标 As 的（氧）氢氧化物：配制 100 mL 浓度为 10 g L^-1 的 As₂O₃²⁵ 溶液，并向氧化铁溶液中加入 70 mL。这将使最终 As(III) 含量达到约 ~70 mg/g（氧）氢氧化物。
3. 继续使用不锈钢搅拌桨或磁力搅拌器搅拌 3 小时，然后在 2,000 × g 条件下离心 20 分钟。弃去上清液，并将（氧）氢氧化物重新悬浮于 500 mL 超纯水中。重复离心和洗涤步骤两次。回收湿润的（氧）氢氧化物（固体含水量为 85–90% 质量分数），并于 4 °C 保存备用。
4. 通过 γ 射线辐照对湿润的加标 Hg 或 As 氧化铁进行灭菌处理，吸收剂量至少为 25 kGy。
5. 检测 Hg 和 As（氧）氢氧化物的含量
   1. 测定沉淀物中的 Hg 含量²⁶。
      注意：我们测得结果为 3.90 ± 0.08 µg Hg g^-1 固体。因此，在每根柱中加入的 18.3 g 氧化铁所含总汞量为 71.4 ± 1.51 µg。
   2. 测定沉淀物中的 As 含量。采用热酸消解法（5 N HCl 8 mL，50 °C 下反应 4 小时），并通过原子吸收光谱法（AAS）进行分析。
      注意：我们测得结果为 70 mg As g^-1 固体。因此，在 18.3 g 氧化铁中加入柱内的总 As 量约为 1.3 g。

3. 准备硅胶和沙基质

注意：使用疏松的硅胶基质可防止细铁氧化物在水流作用下从砂/铁氧化物混合物中迁移。最终的凝胶基质为6%硅胶，以避免形成堵塞，仅使氧化物松散聚集。

1. 在加热板上将4 g硅胶加入40 mL 7% KOH溶液中，用磁力搅拌子搅拌至溶解，制备10%硅胶混合液。
2. 加入60 mL超纯水，然后将溶液冷却至约20 °C。迅速用稀释的磷酸（20%）滴定至pH 7.5。在硅胶溶液凝固前，迅速将其与320 g无菌沙子以及先前加入的18.3 g加标汞或加标砷的铁氧化物混合均匀。
3. 用刮勺将“凝胶化”的混合物打散，并在使用前保持无菌状态，用于步骤4。

4. 装填色谱柱

1. 使用带有水夹套冷却系统的玻璃柱（内部体积 = 400 mL，高度 = 30 cm，直径 3.5 cm），并在柱体上每隔 5 cm 均匀设置五个硅胶隔垫，以便沿柱体不同位置进行取样。
2. 截取足够长度的聚四氟乙烯（PTFE）管（PTFE 内径 Ø 3 mm），确保柱体进、出口端均有足够长度。将进水管连接至蠕动泵管，再连接至水或培养基供应系统。
3. 将所有材料（玻璃器皿、管路）通过高压灭菌（110 °C 下灭菌 1 小时）进行灭菌处理。
4. 将柱体垂直固定。
5. 将水夹套连接至水冷却系统，以维持平均温度为 20 °C。
6. 从顶部开始填充柱体，步骤如下：
   - 铺设一层湿润的岩棉，以防止固体流失；
   - 加入 320 g 无菌砂（枫丹白露砂，D₅₀ = 209 µm）；
   - 加入 320 g 无菌砂，与 18.3 g 水合无定形氧化铁（掺入 Hg 或 As，见步骤 1）混合，并固定于 6% 硅胶基质中（见步骤 2）。
7. 将柱体垂直固定，并连接持续通入经 N₂ 鼓泡的超纯无菌水的上行流，流速保持较低（约 2 mL h^-1）。
8. 用铝箔包裹柱体，以避光保护。

图1：柱装置的示意图与照片。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

示例1. 铁还原对砷迁移性和形态的影响

As 柱直接接种了来自某地的地下水，该地地下水中的砷浓度高于饮用水标准（Bracieux，卢瓦尔-谢尔省，法国）。地下水采集至无菌瓶中，并在 5 °C 下保存直至使用。该柱从底部以较低流速（2 mL h^-1）持续供给含有天然内源微生物群落的地下水，以促进细菌在砂粒表面的附着。实验初期温度设定为 25 °C，以利于微生物生长；在连续运行 54 天后，温度降低至 14 °C，即含水层的实际温度。在初始接种阶段（第 0 天至第 17 天），向进水溶液中添加硫酸盐、乳酸盐和酵母提取物（分别为 370 mg L^-1、830 mg L^-1 和 250 mg L^-1），以激活硫酸盐的生物还原过程。

讨论

实验柱装置被证明是一种方便的实验室设备，可用于在连续条件下研究厌氧生物地球化学过程。与泥浆批量系统或微宇宙系统相比，连续柱系统能够更接近真实含水层的条件进行操作。连续系统可模拟地下水通过含水层沉积物的运动。

该方案中最关键的步骤是制备TE-铁（氧）氢氧化物及其与硅胶和沙子的混合物，必须快速完成以获得均匀的质地。除这一总体关键步骤外，还需谨慎设计污染物加标（氧）氢氧化物的制备过程，以使其能够充分代表所研究自然系统的合适模型¹⁷。

该柱体设计为可在不同深度进行取样，从而获取物理-化学及生物参数的剖面信息。因此，该系统可包含多个模拟层 原位 非均质性。此处模拟了天然含水层中铁浓度的非均质性；然而，通过调整硅胶中添加的合成矿物类型，也可研究其他类型的矿物学非均质性。硅胶基质有效阻止了铁（氧）氢氧化物细小颗粒的移动。在所述示例中，柱体接种了来自地下水的天然微生物群落¹⁹然而，由于色谱柱及所有相关设备均可灭菌，因此可考虑使用纯...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃柱	博卡维尔，法国	具体要求	色谱柱由三个独立部分组成：主柱体，包含冷却套和5个取样口（GL14规格，带橄榄形接头），以及顶部和底部部件，它们与主柱体相连接，并通过硅胶接头和螺钉（RIN F 40x38）固定 &以及 SVL 42）。注意：此设计已与公司直接讨论。我们建议寻找当地的玻璃安装商。
聚四氟乙烯/硅胶隔垫，直径 20 mm	Sigma-Aldrich	508608
PTFE 管道内径 3 mm	VWR	228-0745
蠕动泵	多米尼克·杜舍尔股份有限公司	66493
Peristaltic pump tubing LMT 55	VWR	224-2250	Tygon® LMT 55
Fontainbleau 砂，D50=209 µm	法国西贝尔科
N2 用于产生气泡	法国液化空气集团，法国
伽马辐照	Ionisos，Dagneux，法国
自动汞分析仪（AMA 254）	法国 Courtage Analyses 公司
Varian SpectrAA 300 Zeeman	安捷伦
<强>名称	<强>公司	<强>货号	<强>评论
<强>化学品
HNO3 超纯	VWR	1.00441.1000	制造商：Merck
HCl 30% Supra pur	VWR	1.00318.1000	制造商：Merck
Hg(NO3)2	默克	516953
作为2O3	默克	202673
FeCl3-6H₂O	默克	207926
硅胶	Sigma-Aldrich	336815-500G