利用激光多普勒成像与监测技术分析大鼠脊髓微循环

摘要

本文介绍了一种结合激光多普勒血流成像（LDPI）和激光多普勒血流监测（LDPM）的方法，用于测量脊髓局部血流量和氧饱和度（SO₂），以及一种在大鼠中建立脊髓损伤的标准化操作流程。

摘要

激光多普勒血流仪（LDF）是一种用于测量血流（BF）的无创方法，因此更适合用于测量脊髓微循环的变化。本文中，我们的目标是同时使用激光多普勒成像和监测技术，分析脊髓损伤后血流的变化。实验中同时采用了激光多普勒图像扫描仪和探头/监测仪来获取各项读数。激光多普勒灌注成像（LDPI）的数据提供了血流的局部分布情况，可全面了解损伤部位周围的灌注状态，并便于对不同位置的血流进行比较分析。通过在一段时间内对探测区域进行连续测量，使用组合式探头可同时测量脊髓的血流和氧饱和度，从而反映脊髓整体的灌注和氧气供应情况。LDF技术本身存在一些局限性，例如仅能提供相对流量值、对运动敏感以及存在生物零点信号等问题。然而，由于其设备简单且血流测量速度快，该技术已被广泛应用于临床和实验研究中。

引言

脊髓组织具有丰富的血管分布，对脊髓损伤（SCI）所引起的缺氧极为敏感。我们先前的研究表明，脑震荡损伤后脊髓的血流量显著降低^1,2，这可能与运动功能障碍有关。近期研究显示，SCI 后血管结构的完整性与感觉运动功能的改善密切相关³。已有报道指出，血管化程度的改善可能挽救白质，从而间接促进功能恢复⁴。因此，维持损伤后脊髓的灌注对于保护组织存活能力和功能完整性显得尤为重要。

许多研究者已在脊髓损伤（SCI）的实验模型中采用多种技术，考察了各种治疗对SCI后灌注的影响^5,6,7。激光多普勒作为一种成熟的技术，在多项动物和人体研究中被证实是量化灌注的有效方法^8,9,10,11。该技术基于测量运动中的红细胞对入射光所引起的多普勒频移¹²。自20世纪80年代初该技术实现商业化以来，激光技术、光纤光学以及激光多普勒仪器的信号处理技术均取得了巨大进展¹³，从而使LDF成为一种可靠的技术。

在本研究中，两种激光多普勒测量方法 用于评估脑震荡大鼠脊髓中的血流（BF）。由于该技术具有非侵入性且操作简便，本方案为脊髓血流测量提供了一种敏感、快速且可靠的方法。更重要的是，该方法可在不牺牲动物的情况下，实现对脑震荡后脊髓损伤（SCI）血流的纵向研究。

由于能够评估组织的血流量（BF）以及在刺激过程中灌注的快速变化，本方案可用于评估脑血流量^14,15，也可用于测量其他组织，如肝脏^16,17、皮肤^18,19和肠道²⁰。在大脑中动脉短暂阻塞的大鼠模型中，采用激光多普勒检测以确认血流速率降至预期的缺血半暗带水平¹⁴。在已建立危重度肢体缺血（CLI）模型的大鼠中，应用激光多普勒扫描观察CLI手术前后以及不同治疗后时间段的后肢血流量 ²¹。此外，某些药物的生物利用度和代谢清除率依赖于肝血流量，而后者可通过激光多普勒血流仪（LDF）检测¹⁶。因此，LDF可广泛应用于实验模型、药效动力学及药代动力学评价中。

方案

涉及实验动物的动物实验方案遵循美国国立卫生研究院（NIH）制定的指南，并经首都医科大学动物护理与使用委员会批准。

以下介绍的脊髓损伤（SCI）建模及使用激光多普勒设备测量脊髓血流（BF）的操作步骤，已在已发表的研究中应用¹。

1. 手术准备

1. 用生理盐水配制3% (w/v) 戊巴比妥钠溶液，并以35 mg/kg剂量给药 。
   注意：戊巴比妥钠为管制药品，应详细记录使用情况，并将溶液存放于安全、上锁的场所。
2. 对器械进行灭菌并准备手术区域。
   1. 按以下步骤清洁手术器械：先用75%乙醇清洁，然后在121 °C下高压灭菌30分钟，再于60 °C烘箱中过夜干燥。用75%酒精对手术区域进行消毒。

2. 大鼠手术前准备

1. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（35 mg/kg）对大鼠进行麻醉。整个操作过程应耗时30至40分钟，包括手术、血流（BF）测量和缝合。
2. 将大鼠从下背部至颈部的背部区域毛发剃除，毛发应尽可能剪短。将大鼠置于40 °C加热垫上，以维持恒定的体温。

3. 脊椎板切除术与脊髓挫伤

注意：仅对假手术组进行椎板切除术时，请遵循步骤 3.1 至 3.6。

1. 将动物背侧朝上放置。使用无菌棉球先以碘液、再以75%酒精对 shaved 区域进行消毒。在胸椎T7至T11节段的椎板切除部位上方，用手术刀做一长度为4 cm的皮肤切口。
2. 从T8至T10节段两侧切开附着的肌肉，暴露棘突、椎板及关节突关节。
3. 使用手术刀切断T10与T11之间的连接处，并通过仔细分离肌肉层进一步暴露骨性结构。
4. 使用剪刀以小幅度剪切方式进一步清除椎板及椎弓根周围的肌肉组织，从而在T10与T11椎骨之间打开一小片空隙（图1A）。将一把止血钳缓慢而轻柔地插入该间隙，折断椎弓根（图1B）。确保止血钳的弯曲方向始终朝向外侧，远离脊髓。在另一侧重复此操作。
5. 暴露脊髓（图1C），小心抬起并去除椎板，注意不得遗留任何游离或锋利的骨碎片。
6. 重复上述操作，进一步去除T9和T8节段的椎板。
7. 将动物转移至撞击装置操作台，使用固定在台上的Adson镊子夹住T7和T11的棘突以稳定脊柱，然后调节镊子使脊柱伸直（图1D）。
8. 将动物置于撞击装置下方，将撞击杆对准暴露的脊髓中心位置，并将其下降至距离脊髓表面3–5 mm处。
9. 设定撞击参数，如撞击力（160 KD）和停留时间（1 s）。
   1. 在软件界面上点击 "Start Experiment" 按钮以诱导脊髓损伤（SCI），随后在弹出界面点击 "yes"，启动自动撞击。撞击完成后，软件将在设定参数旁显示实际撞击数据，请核对数据以确保其接近设定值（图1E）。
      注意：实验成功的典型表现为撞击后出现短暂的尾部不自主摆动及肢体运动。也可通过刺激尾部检查肢体反射情况。然而，必须采用如Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）运动功能评分量表^22,23等运动功能评估方法，以确定所诱导损伤的有效性。

4. 激光多普勒扫描

1. 参见材料表了解本研究中所用激光多普勒扫描仪的详细信息。为扫描暴露的脊髓，将大鼠背侧朝上放置于黑色、无反光的背景上。
2. 设置扫描参数：打开扫描软件，点击 "Measure" 进入测量图形用户界面，然后点击 "Scanner setup" 按钮以打开扫描仪设置界面。为扫描小区域（如本实验），在 "Scan Size and Display Options" 下选择 "High Resolution"，以启用高分辨率精细扫描模式（256 × 256 个点覆盖 4 × 10 cm²）（图 2A）。点击 "Image Scan" 选项以检查扫描范围（图 2B）。
3. 点击 "Video and Distance" 选项以查看实时视频图像。将扫描仪置于手术窗上方 10–13 cm 处，并移动带有动物的背景，使暴露的脊髓位于扫描窗口中央（图 2C）。
4. 使用 "auto distant" 功能微调扫描高度，注意在整个实验的所有测量中应保持扫描高度一致（图 2C）。
5. 使用带窗口的无反光覆盖物，仅暴露手术区域，以进一步最小化背景干扰，并标记动物的方向。
6. 点击 "Repeat Scan"，设置扫描次数（本实验中使用 8 次重复扫描），然后点击 "OK" 打开重复扫描界面。点击开始按钮以启动扫描，整个过程大约需要 3–4 分钟（图 2D）。

5. 激光多普勒监测

1. 使用带有 VP3 钝针端输送探头的扫描仪监测仪随时间监测 BF 和 SO₂。将激光多普勒探头垂直固定于立体定位仪上，以搭建监测设备。
2. 将大鼠背侧朝上置于立体定位装置上，必要时在动物下方垫一小块聚苯乙烯泡沫塑料，以使暴露的脊髓保持水平。
3. 将探头下降至脊髓表面以监测 BF。
   注意：第 5.3 步对测量的可重复性至关重要，因为数据读数对探头施加的压力敏感，因此必须格外小心，避免探头位置过高或过低。
   1. 检查切口，并使用无菌棉垫清除多余的液体或血液。
   2. 利用装置的 X 和 Y 轴，将探头定位至暴露的脊髓中心点或损伤点头侧 2 mm 处，并避开中央静脉。
   3. 使用 Z 轴缓慢降低探头，直至刚好接触脊髓表面。探头应刚好接触脊髓表面，但不可过松，以免强光从接触点侧面逸出。
4. 数据记录
   1. 打开数据采集软件，点击 "new experiment" 按钮以打开设置界面。在 "General" 选项下检查系统配置，然后点击 "Next"（图 3A）；在显示设置中选择 BF 和 SO₂ 的通道，然后点击 "Next"（图 3B）。
   2. 输入文件信息，然后点击 "Next"（图 3C）进入数据记录界面，点击绿色三角形按钮开始从探头记录数据（图 3D）。
   3. 待信号稳定后，连续记录 8 分钟数据。随后抬起探头，将动物从立体定位装置上移下，缝合切口，并将动物转入术后护理。

6. 缝合与术后护理

1. 缝合切口：将缝合针插入切口两侧的肌肉组织中，拉紧缝线使组织对合，从而覆盖椎板切除部位暴露的脊髓。使用持针器将缝线完全拉出，打三个方结，并尽可能靠近结处剪断线头。
2. 以与缝合切口相同的方法缝合皮肤，打3–4个方结，然后将线头在距离结约1 cm处剪断。
3. 将大鼠侧卧放置于笼内，避免手术部位接触笼底。笼子应置于加热垫上。
4. 密切观察动物直至从麻醉中苏醒，以确保无术后出血且缝合口保持闭合。
5. 术后连续3天皮下注射青霉素钠（Benzyl Penicillin Sodium），剂量为120 mg/kg/天；手术后立即腹腔注射布托啡诺（Buprenorphine）（0.05 mg/kg），之后每6小时注射一次，持续1天。
6. 为确保动物能够充分获取食物和饮水，使用加长型水瓶嘴，并将食物放置在笼内靠近动物的位置。
   注意：我们采用BBB评分量表在损伤后24小时评估动物后肢运动功能，排除BBB评分高于0的动物，以确保动物因所诱导的损伤而出现瘫痪。
7. 术后如需辅助，每日两次通过轻柔按压腹部手动排空膀胱。

结果

采用激光多普勒灌注成像（LDPI）测量脊髓中的血流（BF），并通过提取线性轮廓沿脊髓头尾轴进行定量分析（图4）。图5A 和 图5B 分别表示假手术组和脊髓损伤（SCI）组脊髓的血流灌注成像结果。图5C 和 图5D 分别表示假手术组和SCI组沿脊髓头尾轴血流（BF）的变化情况。通过比较 图5A 与 图5B 可知，脊髓损伤（SCI）导致血流（BF）减少，且损伤中心部位的血流量低于头侧和尾侧脊髓。

LDPM 显示了时域 LD 信号以及 SO

讨论

进行本实验方案时应注意一些细节。首先，麻醉和手术过程应尽可能迅速且娴熟地完成，以最大限度减少对动物造成的应激。为减少对实验结果的干扰，应使动物保持相对平静和稳定的状态。其次，在使用激光多普勒仪器进行测量时需特别注意出血情况，因为血液可能干扰读数。最后，在数据记录过程中，应将动物置于温度可控的环境中，以避免因温度波动导致结果不一致。

研究人员在使用激光多普勒扫描时应考虑几个重要因素。如实验方案中所述，为了获得可比较的结果，扫描距离应在整个实验过程中保持一致。对于较小区域，我们建议采用高分辨率并进行多次扫描，以获得可靠的血流（BF）数据。此外，我们建议在手术区域覆盖带有标记动物方向的无菌纱布，并仅留出一个小窗口暴露脊柱，以进一步最小化背景干扰。

探头定位是在调整和实施监测方案时的关键考虑因素。探头应垂直于被测表面，并避免施加过大的压力。为实现这一目标，必要时可通过在动物身下垫入泡沫塑料来拉直并调平大鼠脊柱，同时应使用仪器和坐标定位探头，以确保测量位置大致相同。

正如我们在之前...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
激光多普勒线扫描仪	Moor Instruments	moorLDLS2
激光多普勒血流监测仪	Moor Instruments	moorVMS-LDF
监测仪探头	Moor Instruments	VP3	钝针端输送探头
撞击器	Precision Systems and Instrumentation	IH-0400
苯巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761
丁丙诺啡	Sigma-Aldrich	B-908
注射器	Becton Dickinson Medica (s) Pte.Ltd	300841
带缝合线的外科缝合针	上海浦东金环医疗用品有限公司		18T0329（批号）/4-0
手术刀	上海医疗器械有限公司手术器械厂	J11030 4#
手术刀片	上海医疗器械有限公司手术器械厂	J12130 20#
眼科镊	上海医疗器械有限公司手术器械厂	JD1040
止血钳	上海医疗器械有限公司手术器械厂	J31050
青霉素钠	华北制药股份有限公司		F6072116（批号）
75% 酒精	德州安捷高科消毒制品有限公司		150421R（批号）
碘伏	山东利尔康医疗科技股份有限公司		20170102（批号）
大鼠	军事医学科学院实验动物中心		Sprague-Dawley（大鼠品系）