方法文章

通过亚甲蓝染料注射评估尿路连接处梗阻缺陷

DOI：

10.3791/56247

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2017年10月12日

1Cancer and Developmental Biology Laboratory, National Cancer Institute, National Institutes of Health

本文内容

摘要

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将亚甲蓝染料注入小鼠胚胎肾盂，有助于评估泌尿系统发育过程中尿路连接处的梗阻缺陷。本文介绍了一种向肾盂注射亚甲蓝染料的实验方案。

摘要

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泌尿道连接处梗阻缺陷是一类导致肾积水和输尿管积水的先天性畸形。可通过追踪亚甲蓝染料在泌尿系统中的流动情况来评估小鼠泌尿道连接处的梗阻缺陷。将亚甲蓝染料注入围产期胚胎肾脏的肾盂，随后施加静水压力，观察染料从肾脏肾盂经输尿管流入膀胱腔的过程。在正常的围产期泌尿道中，染料会明显积聚于膀胱腔内；若存在泌尿道梗阻，则染料将滞留在肾盂与异常输尿管的末端之间。该方法有助于确认泌尿道连接处的梗阻，并实现对肾积水和输尿管积水的可视化观察。本文描述了一种向肾盂注射亚甲蓝染料以确认泌尿道连接处梗阻的实验方案。

引言

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泌尿系统由一对肾脏和输尿管，以及一个共用的膀胱和尿道组成。泌尿系统的主要功能是通过调节血液中的水分和电解质平衡来维持机体的稳态。肾脏过滤血液，以调控电解质浓度和酸碱平衡，并生成尿液以排出多余的水分以及包括溶质和代谢产物在内的废物。尿液随后从肾脏的肾盂经输尿管单向输送至膀胱，在膀胱中储存，最终通过尿道排出体外1。

输尿管是起源于肾管的直管状结构。在小鼠胚胎发育第10.5天（E10.5）自肾管出芽后，输尿管茎逐渐伸长，并分化为一种多层结构，称为尿路上皮，该结构在小鼠E12.5至E16.5期间具有不透性。包围输尿管茎的间充质细胞也分化为三层，分别为内层的间质细胞、中间较厚的平滑肌细胞以及外层的外膜成纤维细胞。起始于肾盂的输尿管节律性蠕动波通过输尿管壁的平滑肌层向膀胱传播，以输送尿液2,3，尿液的生成始于小鼠E16.5时期1。

肾脏和尿路先天性畸形（CAKUT）是最常见的遗传性疾病之一，约存在于1%的人类胎儿中1,4，其表型多样，包括肾积水和输尿管积水。尿液在肾脏和输尿管中的异常积聚导致肾积水和输尿管扩....

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方案

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小鼠（Wnt5a flox/flox 小鼠 (Wnt5atm1.1Tpy) 和 Dll1Cre 品系，UVJO 小鼠模型）7 的饲养管理遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南，并在经国家癌症研究所-Frederick 动物护理与使用委员会批准的方案下进行研究。

1. 亚甲蓝染料溶液的制备

  1. 称取0.1 g亚甲蓝粉末。
  2. 将亚甲蓝加入10 mL生理盐水或1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过涡旋充分溶解。
  3. 使用注射器滤器（膜孔径0.45 µm）过滤10 mg/mL的亚甲蓝溶液，以防止注射时发生堵塞。
  4. 将无菌头皮静脉输液套件（27G×3/4″）与一支3 mL一次性注射器组装，并用3 mL过滤后的亚甲蓝溶液充满注射器。
    注意：为防止静水压力导致染料自行流出，应将针尖置于盛有亚甲蓝溶液的注射器上方。

2. 产前胚胎的解剖

  1. 用70%乙醇清洁解剖剪和镊子。
  2. 为在E18.5或E19.5收集围产期胚胎，首先使用CO2吸入法对怀孕小鼠实施安乐死，然后根据NIH指南进行颈椎脱位。
    注意：怀孕雌性小鼠通常从E18.5开....

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结果

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肾脏和下尿路位于大多数其他内脏器官（如肝脏和肠道）的背侧。在移除这些其他内脏器官后，可观察到一对肾脏和输尿管以及一个膀胱（图1A）。成功解剖后，注入肾盂的染料将通过输尿管从肾脏流向膀胱。肾盂是输尿管在肾脏内近端呈漏斗状扩张的部分。因此，染料注射点位于与肾脏相连的可见近端输尿管附近，如黑箭头所示（图1B-1C）。向一侧肾脏注射亚甲蓝染料溶液后，染料从肾盂经输尿管流入膀胱，若无泌尿道梗阻，则可在输尿管和膀胱腔内观察到明显的蓝色（图1B）。在正常输尿管中，染料通常在成像前迅速消失，且输尿管内的染色较淡，因为正常输尿管为细管状结构。然而，可通过解剖显微镜观察输尿管内的染料流动。当双侧肾脏均注射染料溶液后，染料经约20秒的持续流动，在膀胱腔内形成明显的蓝色（图1C）。对侧注射后染料在膀胱内的积聚表明另一侧泌尿系统.......

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讨论

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小鼠肾脏自E16.5开始具备功能，理论上从该时间点起即可进行染料注射检测。然而，此时肾脏体积过小，难以注射染料溶液，且诸如肾积水和输尿管积水等表型尚不明显，因为这些表型是由于尿液运输异常导致尿液积聚所引发的继发性效应。由输尿管肾盂连接部梗阻（UPJO）或输尿管膀胱连接部梗阻（UVJO）等阻塞引起的上述表型，在E18.5时已可通过膨大的肾脏和输尿管清晰观察到。E19.5胚胎或新生幼鼠的肾脏体积更大，较E18.5或更早期胚胎更易于操作。然而，双侧尿路梗阻的幼鼠在出生后会死亡。因此，应根据实验小鼠的特性，合理选择围产期胚胎或幼鼠进行实验，以验证CAKUT表型。

在进行染料注射以检测潜在缺陷之前，需仔细解剖以保持泌尿系统的完整。这对于异常的肾积水肾脏和输尿管尤为重要，因为这些组织在去除周围多余组织以暴露肾脏和尿路时极易扩张且容易受损。若在解剖过程中损伤这些器官，将无法全面判断真实的缺陷情况。例如，图2显示了输尿管的明显扩张，但由于染料泄漏，未能显示出远端输尿管积水的末端位置。

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症发育生物学实验室（CDBL/NCI/NIH）的Alan O. Perantoni博士对本论文提交工作的支持。同时感谢CDBL/NCI/NIH的Michael Hall博士和Nirmala Sharma对本文稿的编辑。感谢SAIC的Lai Thang在小鼠饲养方面提供的出色支持。本研究工作由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所及癌症研究中心资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
亚甲蓝Sigma-AldrichM9140
Quality Biological Inc. 生理盐水 - 500 mLFisherscientific50-983-204
带 BD Luer-Lok 接头的 3 mL 一次性注射器BD309657
带 Supor 膜的 Acrodisc 注射器滤器Pall corporation4614
Exel 头皮静脉（蝴蝶型）穿刺针；27G x 3/4" 12" EXELINT26709
精细手术剪Roboz Surgical Instrument Co.RS-6702
显微解剖镊Roboz Surgical Instrument Co.RS-5135
Dumont 镊子；型号 #5Roboz Surgical Instrument Co.RS-5045
BD PrecisionGlide 针头 30 G x 1/2"BD305106

参考文献

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  1. Rasouly, H. M., Lu, W. Lower urinary tract development and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).
  2. Kispert, A. T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract. Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).
  3. Bohnenpoll, T., Kispert, A.

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