瞬时耗竭TIP60后乳腺上皮细胞迁移的活体成像

摘要

本文展示了利用TIP60缺失的MCF10A乳腺上皮细胞在伤口愈合实验中对细胞迁移进行实时监测。本方案中采用的活细胞成像技术使我们能够实时并跨时间分析和可视化单个细胞的运动。

摘要

划痕愈合实验是体外研究细胞迁移的一种高效且最经济的方法之一。in vitro。传统方法通常使用相差显微镜在实验开始和结束时拍摄图像，并通过伤口闭合程度来评估细胞的迁移能力。然而，细胞运动是一种动态现象，传统方法无法追踪单个细胞的运动过程。为了改进现有的划痕愈合实验，我们采用活细胞成像技术对细胞迁移进行实时监测。该方法使我们能够基于细胞追踪系统确定细胞迁移速率，并更清晰地区分细胞迁移与细胞增殖。本文中，我们展示了在划痕愈合实验中应用活细胞成像技术，研究TIP60的存在对乳腺上皮细胞不同迁移能力的影响。由于细胞运动具有高度动态性，与传统划痕愈合实验所采用的静态图像记录相比，本方法可提供关于伤口愈合过程更深入的见解。

引言

HIV-Tat 相互作用蛋白 60 kDa（TIP60）是一种赖氨酸乙酰转移酶，能够乙酰化组蛋白和非组蛋白^1,2。研究表明，TIP60 在多种信号通路中发挥功能，包括转录调控、DNA 损伤修复以及细胞凋亡^{1,3,4,5,6,7,8}。此外，TIP60 在多种癌症中常呈下调表达，其表达降低与肿瘤转移及较差的生存率相关^{9,10,11,12,13,14}。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，该过程包含多个步骤，其中转移的初始阶段涉及肿瘤细胞向邻近组织的迁移和侵袭^15,16。为此，肿瘤细胞首先必须从原发性肿瘤团块中脱离，可表现为集体侵袭的细胞片层形式，或以单个游离细胞的形式脱离¹⁷。在此过程中，肿瘤细胞常经历上皮-间质转化（EMT），从而导致细胞形态和细胞黏附能力的改变^17,18。

已开发出一些技术用于研究肿瘤细胞的迁移和侵袭能力 体外其中，伤口愈合实验是最高效且经济的方法¹⁹首先，该方法涉及在融合的单层细胞上人为制造一个间隙，从而允许细胞迁移并闭合该间隙。其次，可在实验开始和结束时拍摄间隙的图像。最后，通过比较间隙闭合程度来确定细胞迁移速率。通常使用相差显微镜采集传统伤口愈合实验的图像。伤口愈合实验的另一优势在于其在一定程度上模拟了 体内 肿瘤细胞迁移。类似于 体内 肿瘤转移，通过伤口愈合实验可观察到上皮细胞片层的集体迁移以及脱离的单个细胞的迁移。

然而，细胞迁移具有动态性，因此需要实时记录细胞的运动过程。例如，传统的伤口愈合实验无法实现对单个细胞运动的分析。另一方面，用于伤口愈合实验的细胞在培养时常需进行血清饥饿处理，以抑制细胞增殖。这样做的目的是排除因细胞增殖导致的间隙闭合。尽管如此，实验过程中仍会存在一定程度的细胞增殖和细胞死亡，而实验前后拍摄的相差显微图像无法区分这两种情况。

活细胞成像技术克服了传统伤口愈合实验的这一局限性。通过将活细胞成像显微镜与CO₂培养箱及适当的温度控制系统相结合，研究人员能够随时间测量间隙大小及其闭合速率，同时追踪位于侵袭前沿尖端的活跃迁移细胞的运动。因此，采用活细胞成像技术监测细胞迁移不仅能够更清晰地可视化细胞迁移过程，还能区分细胞迁移与细胞增殖，从而实现对细胞迁移更为可靠的分析。

本研究采用MCF10A乳腺上皮细胞，演示了划痕愈合实验与活细胞成像相结合的方法，用于研究TIP60在细胞迁移中的作用。TIP60的缺失会导致MCF10A细胞的迁移能力增强。

方案

1. 准备

1. 准备 MCF10A 培养基：DMEM/F12 (1:1) 培养基，添加 5% 马血清、20 ng/mL 表皮生长因子、0.5 mg/mL 氢化可的松、100 ng/mL 霍乱毒素和 10 µg/mL 胰岛素。
2. 准备无血清培养基：DMEM/F12 (1:1) 培养基，添加 20 ng/mL 表皮生长因子、0.5 mg/mL 氢化可的松、100 ng/mL 霍乱毒素和 10 µg/mL 胰岛素。
3. 使用以下 siRNA 序列：
   siControl：
   正向链：5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
   反向链：5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
   siTIP60：
   正向链：5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
   反向链：5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
4. 使用 10 cm 细胞培养皿和 24 孔板。

2. 使用 siRNA 瞬时耗竭 TIP60

1. 第1天，取15 µL转染试剂（例如， Lipofectamine RNAiMAX) 和 2 mL 低血清培养基（例如， Opti-MEM）分别与10 µL的每种siRNA（10 µM储存液）混合。
2. 将混合物在室温下孵育20分钟。
3. 接种 1 × 10⁶ 在10 cm培养皿中加入MCF10A细胞和3 mL培养基。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
4. 将siRNA混合物逐滴加入10 cm培养皿中。
5. 轻轻摇晃培养皿，确保细胞均匀分布，然后放入37 °C培养箱中。
6. 孵育6小时后，将含有siRNA的培养基更换为8 mL新鲜培养基。
7. 第2天，配制另一批siRNA混合物，室温孵育20分钟。
8. 吸出第1天加入的8 mL培养基，更换为3 mL新鲜培养基。
9. 将第二批siRNA混合物逐滴加入培养皿中。轻轻晃动培养皿，确保试剂充分混匀后再放入培养箱。
10. 6小时后，将含有siRNA的培养基更换为8 mL新鲜培养基。

3. 用于伤口愈合实验的种子细胞

1. 第3天，弃去培养基，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，弃去PBS缓冲液。
2. 向培养板中加入1 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA缓冲液，对siControl和siTIP60处理的细胞进行消化，放回培养箱中孵育20分钟。
3. 每块培养板中加入4 mL完全培养基，用移液器吹打重悬细胞，并转移至15 mL离心管中。
4. 以200 g离心5分钟，弃去上清液。
5. 用5 mL无血清培养基重悬细胞，使用血细胞计数板对细胞进行计数。
6. 将siControl和siTIP60组细胞均配制成6 × 10⁵ 个细胞/mL的细胞悬液，确保细胞充分混匀。每孔加入500 µL细胞悬液至24孔板中，以保证达到100%融合度。siControl和siTIP60组各接种5至6孔。
7. 轻轻前后摇动培养板，再左右摇动，以确保细胞均匀分布，避免画圈式摇动。将培养板置于培养箱中培养24小时。
8. 收集剩余细胞以检测TIP60的敲低效率：将剩余的细胞悬液以200 g离心5分钟，弃去上清液。
9. 使用商品化试剂按照生产商说明书提取RNA，并进行实时定量PCR分析，以评估敲低效率。

4. 创造伤口

1. 在相差显微镜下观察，确保细胞已完全贴壁。在显微镜下（4X、10X 和 20X 放大倍数）观察细胞，确认细胞已完全贴附并形成融合的单层。
   注意：siControl 细胞通常比 siTIP60 细胞贴壁更好。这是预期现象，因为 TIP60 的缺失会使细胞更倾向于呈现间充质样表型²⁰。此处使用的是普通的台式白光相差显微镜。
2. 用 200 µL 移液枪头轻轻在孔板中央划一条直线以制造伤口；所产生的划痕长度与孔板直径相同。对所有剩余的孔重复此步骤。每个孔均需使用新的移液枪头。
3. 用无血清培养基轻轻洗涤每个孔 5 次，以去除脱落的细胞。
4. 向每个孔中加入 1 mL 无血清培养基，并立即进行活细胞成像。

5. 活细胞成像的设置

1. 在进行活细胞成像实验前至少1小时打开显微镜和温控装置，以确保培养腔内的温度达到37 °C。
2. 开始活细胞成像前打开二氧化碳（CO₂）气体供应，将CO₂浓度设定为5%。
3. 将24孔板放置在显微镜载物台上，选择10X 倍率的物镜进行成像。将发射光引导至目镜而非相机，并调节焦距以定位伤口及其周围的细胞。
   注意：本实验中使用了带相差的白光照明。
4. 使用活细胞观察系统标记每个孔中伤口的位置。
   注意：活细胞成像系统的自动载物台支持在多个位置采集图像，系统将在每个标记位置按设定的时间间隔进行成像。
5. 设置时间条件：时间间隔为1小时，总时长为72小时；根据此设置，系统将每小时在每个标记位置拍摄一次图像，持续72小时。可根据需要设定合适的时间间隔和监测时长。
   注意：此处选择72小时的监测时长最为合适，因为这些细胞在无血清培养基中培养超过72小时后开始死亡。

6. 单细胞运动追踪

1. 72 小时后导出数据，以 JPEG 格式导出图像，以 AVI 格式导出视频。
   注意：这一点非常重要，因为 ImageJ 软件仅能识别 AVI 格式的视频。siTIP60 细胞与 siControl 细胞之间不同的迁移速度可在视频中清晰观察到。
2. 在 ImageJ 软件中打开 AVI 视频。
3. 打开 MTrackJ 插件（该插件需单独下载并安装）：插件 > MtrackJ。
4. 在 MtrackJ 工具栏中点击 "添加" 选项卡，从视频中选择单个细胞并添加轨迹。选择位于侵袭前沿的一个细胞以及能够独立迁移的细胞（单细胞迁移）。在视频中跟踪所选细胞的运动，并使用 MtrackJ 进行轨迹绘制。
5. 点击工具栏上的 "测量" 选项卡，测量细胞移动的距离。
   注意：在此处，siControl 组中几乎没有任何细胞以单细胞形式移动，因此难以测量单细胞迁移；而 siTIP60 组中有大量细胞以单细胞形式迁移。然而，在 siControl 和 siTIP60 细胞中，仍可对位于侵袭前沿的细胞运动进行追踪和计算。
6. 以 AVI 格式保存带有轨迹的视频。

7. 细胞迁移能力的定量分析

1. 进行定量分析时，选择 0 h 的图像和 "n" h 的图像，其中 "n" 表示 siTIP60 或 siControl 细胞的伤口完全闭合的时间点。
   注意：此处选择 48 h，因为 siTIP60 细胞的伤口已几乎完全闭合。
2. 使用 ImageJ 和以下公式计算迁移百分比：(0 h 时的伤口面积 - "n" h 时的伤口面积) / 0 h 时的伤口面积 × 100。

结果

基于活细胞成像的细胞迁移实验通用示意图
图1A为本实验方案的示意图。转染siControl的MCF10A细胞呈现典型的上皮细胞形态。TIP60耗竭后，MCF10A细胞相较于对照组细胞表现出更明显的间充质样特征（图1B）。

检测TIP60敲低效率
图2展示了TIP60的敲低效率。经siTIP60处理后，TIP60的表达水平显著降低。除了TIP60外，还检测了多种与细胞迁移相关蛋白的表达²⁰。例如，上皮标志物上皮细胞黏附分子（EpCAM）的表达减少，而两种EMT驱动因子纤连蛋白（FN1）和SNAIL2（SN...

讨论

已知在细胞迁移过程中，细胞可以以贴壁的细胞片层、松散的细胞簇或单个孤立细胞的形式移动。细胞侵袭的方式和动态会因条件不同而有所差异，且表型可能在数小时内发生变化。传统的伤口愈合实验依赖于显微镜下间隔较长时间（如12或24小时）拍摄的静态图像，这使得难以捕捉伤口闭合的动态过程以及细胞运动的模式。

另一方面，活细胞成像系统可在较短的时间间隔内（30分钟或1小时）对同一位置进行连续监测，这是手动拍摄图像所无法实现的。该系统具有自动化特性，研究人员只需在实验结束时导出数据即可。这使得实时监测细胞运动模式以及伤口闭合过程成为可能。在本研究中，将定量活细胞成像系统应用于伤口愈合实验，可捕捉对照细胞或TIP60缺失细胞中细胞动态迁移及伤口闭合的全过程。通过活细胞成像系统拍摄的视频可见，大多数siControl细胞以贴壁细胞片层的形式移动，而TIP60缺失细胞则以孤立的单个细胞形式移动（图3 和 图5）。

细胞增殖和细胞死亡可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MCF10A 细胞	ATCC	CRL-10317TM	乳腺上皮细胞
DMEM/F12 培养基 (1:1)	Gibco	11330-032	MCF10A 培养用培养基
表皮生长因子 (EGF)	Peprotech	AF-100-15	MCF10A 培养基添加剂
霍乱毒素	Sigma-Aldrich	C-8052	MCF10A 培养基添加剂
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H-0888	MCF10A 培养基添加剂
胰岛素	Sigma-Aldrich	I-1882	MCF10A 培养基添加剂
马血清	Gibco	16050-122	MCF10A 培养基添加剂
胰蛋白酶	Gibco	25200-056	用于 MCF10A 细胞从培养皿脱离
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110	用于细胞计数
Opti-MEM 低血清培养基	Gibco	31985-070	用于 siRNA 混合物配制
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen/Life Technologies	56532	转染试剂
Trizol 试剂	Invitrogen/Life Technologies	15596-026	用于 mRNA 提取
iScript cDNA 合成试剂盒	Bio-Rad	170-8891	用于 cDNA 合成
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5125	用于实时定量 PCR
7500 Fast 实时定量 PCR 系统	Biosystems		实时定量 PCR 仪器
10 cm 培养皿	Greiner bio-one	664160	用于基因敲低实验
24 孔板	Cellstar	662160	用于伤口愈合实验
siControl siRNA	自行设计	自行设计	CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNA	自行设计	自行设计	UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
活细胞观察系统	Zeiss		Zeiss 倒置活细胞观察系统，用于活细胞实验