斑马鱼激光诱导视网膜变性与再生模型中穆勒胶质细胞的激活

摘要

斑马鱼是研究脊椎动物视网膜变性与再生机制的常用动物模型。本实验方案描述了一种可诱导局部损伤的方法，该方法可破坏外层视网膜，同时对内层视网膜造成最小损伤。随后，我们进行监测 体内 视网膜形态及Müller胶质细胞在视网膜再生过程中的反应。

摘要

硬骨鱼类与哺乳动物之间一个引人注目的差异在于，硬骨鱼类视网膜具有终生持续产生视网神经元的能力，并能在遭受严重损伤后实现再生。研究斑马鱼中的视网膜再生通路，可能为开发治疗哺乳动物视网膜退行性疾病的创新策略提供新的见解。本文中，我们采用532 nm半导体激光在成年斑马鱼的外层视网膜诱导局灶性损伤。这种局限性损伤可使研究人员直接在损伤区域观察视网膜退变与再生过程中的生物学变化。通过非侵入性光学相干断层扫描（OCT），我们能够准确定位损伤部位，并对后续的再生过程进行动态监测 体内 事实上，OCT成像可产生斑马鱼视网膜的高分辨率横断面图像，提供以往仅能通过组织学分析获得的信息。为验证实时OCT的数据，进行了组织学切片，并通过免疫组织化学方法研究了视网膜损伤诱导后的再生反应。

引言

视觉可能是人类最重要的感官，其功能受损会带来重大的社会经济影响。在工业化国家，视网膜变性疾病是成年人群视力丧失和失明的主要原因¹。视网膜色素变性（RP）是20至60岁人群中最常见的遗传性失明病因，全球约有150万人受其影响^2,3。RP是一组异质性的遗传性视网膜疾病，其特征是感光细胞（PRs）进行性丧失，随后出现视网膜色素上皮变性，进而导致内层神经元的胶质增生和结构重塑⁴。该病的病程可归因于两类感光细胞的逐步丧失：通常首先受损的是负责暗光下无色视觉的视杆细胞，以及对色觉和视锐度至关重要的视锥细胞⁵。单一基因缺陷即可引发RP。迄今为止，已发现超过45个基因中的130多种突变与该疾病相关⁶。这导致了不同的疾病表型，也是基因治疗难以普适、因而成为一种复杂治疗策略的原因之一。因此，迫切需要开发新的通用治疗方法，以应对致盲性疾病中的视网膜变性问题。

视网膜变性常涉及感光细胞的丧失；因此，感光细胞死亡是视网膜变性过程的标志性特征⁷已证实PR细胞死亡可刺激穆勒胶质细胞 （MC）活化与增殖⁸

方案

所有实验均遵循视力研究协会（ARVO）关于眼科与视觉研究中动物使用的声明，并遵守政府主管部门的相关规定。

1. 动物

1. 在水温为 26.5 °C、光照/黑暗周期为 14/10 小时的标准条件下，饲养年龄为 6–9 个月的 TgBAC (gfap:gfap-GFP) 斑马鱼 167 (AB) 品系¹⁸。
2. 在政府主管部门批准后，遵循相关机构规定的动物实验动物护理指南。

2. 可逆性全身麻醉

1. 通过将400 mg三卡因甲磺酸盐（tricaine）粉末溶解于97.9 mL养殖水和2.1 mL 1 M Tris缓冲盐溶液（TBS）中，配制三卡因甲磺酸盐的储备液。用1 M Tris（pH 9）调节pH至7.0，并在4 °C避光保存，最多可保存一个月。
   注意：三卡因应使用与动物自然生存条件相似的水配制，最好使用原始的养殖水。
2. 将储备液用养殖水按1:25稀释，并立即使用。
3. 将斑马鱼放入含有50 mL麻醉液的10 cm培养皿中，直至其失去活动能力且对外界刺激无反应（约2 - 5分钟，具体时间取决于体重和年龄）。
4. 用手将每条鱼转移至用于激光处理的定制硅胶固定针座中（图1A）。

结果

实时光学相干断层扫描（OCT）：为了分析小胶质细胞（MCs）在视网膜修复中的作用，我们采用了一种激光损伤模型，在斑马鱼视网膜中诱导出边界清晰的损伤区域。损伤部位首次通过活体in vivo OCT成像（第0天），即在损伤后60分钟内完成（图3）。为补偿鱼类眼球的光学特性，将一枚定制的角膜接触镜置于角膜表面。激光处理后即刻，外层视网膜出现弥散性高反射信号（箭头所示），其范围从视网膜色素上皮层（RPE）延伸至外丛状层（OPL）。第1天仍可检测到类似信号。至第3天后，该弥散信号逐渐变得更为致密且结构清晰，稳定出现在外核层（ONL），并延伸至光感受器层。第一周后（第7天），病灶平均尺寸显著缩小，仅残留微弱的高反射信号。从第14天起直至实验最晚时间点（第6周），在红外（IR）和OCT图像中均不再可见激光损伤斑点。

视网膜变性/再生的组织学.......

讨论

斑马鱼视网膜的再生与退变已通过多种方法进行研究，例如细胞毒素介导的细胞死亡²²、机械损伤²³和热损伤²⁴。我们采用532 nm半导体激光器对斑马鱼视网膜造成损伤。该模型具有多项优势：例如，我们能够快速在视网膜外层、特别是感光细胞层（PRs层）形成边界清晰的损伤区域。此外，该实验装置可进行调整，以产生更大范围的损伤，用于研究其他生物学过程，例如通过损伤Bruch膜以诱导脉络膜新生血管形成。该方法的附带损伤极小，且再生反应的时间进程可被精确、可重复地调控。

为追踪表型随时间的变化，我们采用了海德堡Spectralis系统及海德堡Eye Explorer软件。因此，眼底红外成像在斑马鱼中被证明尤为有用。与眼底自发荧光（AF）相比，红外成像能更清晰地定位损伤部位，因为自发荧光在激光照射点与周围区域之间对比度较低。这使我们能够检测变化并监测再生过程 在体，而这是AF模式无法实现的。正如先前所报道的^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
酸性苏木精溶液	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	2852
白蛋白	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	A07030
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	5470
Dako笔	Dako, Glostrup, 丹麦	S2002
DAPI封片剂	Vector Labs, Burlingame, CA, 美国	H-1200
0.5%伊红G水溶液	Carl Roth, Arlesheim, 瑞士	X883.2
乙醇	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	2860
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	ED
EuKitt	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	3989
山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor® 488	Life Technologies, Zug, 瑞士	A11008
山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor® 594	Life Technologies, Zug, 瑞士	A11020
正常山羊血清	Dako, Glostrup, 丹麦	X0907
水凝胶隐形眼镜	Johnson & Johnson AG, Zug, 瑞士	n.a.	1-Day Acuvue Moist
2%羟丙基甲基纤维素	OmniVision, Neuhausen, 瑞士	n.a.	Methocel 2%
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	A5040	Tricaine, MS-222
Visulas 532s	Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, 德国	n.a.	532 nm激光
小鼠抗GS单克隆抗体	Millipore, Billerica, MA, 美国	MAB302
HRA + OCT成像系统	Heidelberg Engineering, Heidelberg, 德国	n.a.	Spectralis
Heidelberg眼部检查软件	Heidelberg Engineering, Heidelberg, 德国	n.a.	版本 1.9.10.0
多聚甲醛（PFA）	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	P5368
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	P5368
兔抗GFAP多克隆抗体	Invitrogen, Waltham, MA, 美国	180063
硅胶固定针夹具	Huco Vision AG 瑞士	n.a.	根据灭菌托盘中的硅胶针垫手工裁剪而成
裂隙灯BM900	Haag-Streit AG, Koeniz, 瑞士	n.a.
裂隙灯适配器	Iridex Corp., Mountain View, CA, 美国	n.a.
Superfrost Plus载玻片	Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, 德国	10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB)品系	KIT, Karlsruhe, 德国	15204	http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris缓冲盐水（TBS）	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	P5912
吐温20	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	P1379
78D非接触式裂隙灯镜头	Volk Optical, Mentor, OH, 美国	V78C
二甲苯	Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士	534056
眼底激光镜片	Ocular Instruments, Bellevue, WA, 美国	OFA2-0
2100 Retriever	Aptum Biologics Ltd., Southampton, 英国	R2100-EU	蒸锅