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方法文章

斑马鱼激光诱导视网膜变性与再生模型中穆勒胶质细胞的激活

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DOI：

10.3791/56249

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2017年10月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital of Bern, University of Bern, 2Department of Clinical Research, University of Bern, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

本文内容

摘要

斑马鱼是研究脊椎动物视网膜变性与再生机制的常用动物模型。本实验方案描述了一种可诱导局部损伤的方法，该方法可破坏外层视网膜，同时对内层视网膜造成最小损伤。随后，我们进行监测 体内 视网膜形态及Müller胶质细胞在视网膜再生过程中的反应。

摘要

硬骨鱼类与哺乳动物之间一个引人注目的差异在于，硬骨鱼类视网膜具有终生持续产生视网神经元的能力，并能在遭受严重损伤后实现再生。研究斑马鱼中的视网膜再生通路，可能为开发治疗哺乳动物视网膜退行性疾病的创新策略提供新的见解。本文中，我们采用532 nm半导体激光在成年斑马鱼的外层视网膜诱导局灶性损伤。这种局限性损伤可使研究人员直接在损伤区域观察视网膜退变与再生过程中的生物学变化。通过非侵入性光学相干断层扫描（OCT），我们能够准确定位损伤部位，并对后续的再生过程进行动态监测 体内 事实上，OCT成像可产生斑马鱼视网膜的高分辨率横断面图像，提供以往仅能通过组织学分析获得的信息。为验证实时OCT的数据，进行了组织学切片，并通过免疫组织化学方法研究了视网膜损伤诱导后的再生反应。

引言

视觉可能是人类最重要的感官，其功能受损会带来重大的社会经济影响。在工业化国家，视网膜变性疾病是成年人群视力丧失和失明的主要原因1。视网膜色素变性（RP）是20至60岁人群中最常见的遗传性失明病因，全球约有150万人受其影响2,3。RP是一组异质性的遗传性视网膜疾病，其特征是感光细胞（PRs）进行性丧失，随后出现视网膜色素上皮变性，进而导致内层神经元的胶质增生和结构重塑4。该病的病程可归因于两类感光细胞的逐步丧失：通常首先受损的是负责暗光下无色视觉的视杆细胞，以及对色觉和视锐度至关重要的视锥细胞5。单一基因缺陷即可引发RP。迄今为止，已发现超过45个基因中的130多种突变与该疾病相关6。这导致了不同的疾病表型，也是基因治疗难以普适、因而成为一种复杂治疗策略的原因之一。因此，迫切需要开发新的通用治疗方法，以应对致盲性疾病中的视网膜变性问题。

视网膜变性常涉及感光细胞的丧失；因此，感光细胞死亡是视网膜变性过程的标志性特征7已证实PR细胞死亡可刺激穆勒胶质细胞 （MC）活化与增殖8. 作为脊椎动物视网膜中主要的胶质细胞类型，Müller细胞曾被认为不过是 "胶水" 视网膜神经元之间。近年来，许多研究表明，米勒细胞（MCs）的作用远不止于提供结构支持9在多种不同功能中，肥大细胞（MCs）还参与神经发生与修复过程10事实上，响应变性视网膜释放的可扩散因子，Müller细胞（MCs）显著上调胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。因此，GFAP标记可作为Müller细胞在视网膜损伤和变性继发反应中活化的标志11.

近期，我们开发了一种利用激光诱导斑马鱼（Danio rerio）视网膜变性的新型局灶性损伤模型。局灶性损伤在研究某些生物学过程方面具有优势，例如细胞向损伤部位迁移以及视网膜再生过程中事件发生的精确时间点12。此外，由于斑马鱼视觉系统与其他脊椎动物视觉系统的相似性，其在视觉研究中变得日益重要。人类与硬骨鱼类视网膜的大体形态学和组织学特征差异甚微。因此，人类和斑马鱼的视网膜均包含相同的主要细胞类型，并以相同的分层模式排列：感光光感受器位于最外层，而作为视网膜投射神经元的神经节细胞则位于最内层，靠近晶状体。视网膜中间神经元，即无长突细胞、双极细胞和水平细胞，则定位于光感受器层与神经节细胞层之间13。此外，斑马鱼视网膜以视锥细胞为主，因此比被广泛研究的啮齿类动物视网膜更接近人类视网膜。硬骨鱼类与哺乳动物之间一个引人注目的差异在于鱼类视网膜中持续存在的神经发生能力以及损伤后的视网膜再生能力。在斑马鱼中，米勒胶质细胞（MCs）可去分化并介导受损视网膜的再生14,15。在鸡中，米勒胶质细胞也具备一定能力重新进入细胞周期并发生去分化。成年鱼类视网膜损伤后，米勒胶质细胞会表现出某些祖细胞和干细胞的特性，迁移至受损的视网膜组织，并生成新的神经元16。对哺乳动物米勒胶质细胞进行的基因表达谱分析揭示了其与视网膜祖细胞之间存在出乎意料的相似性，且越来越多的证据表明鸡、啮齿类动物甚至人类视网膜中的米勒胶质细胞具有内在的神经发生潜能17。然而，目前尚不清楚为何鸟类和哺乳动物的再生反应远低于鱼类所表现出的强烈再生能力。因此，阐明斑马鱼内源性修复机制可能为促进哺乳动物和人类视网膜再生提供新的策略。若能将米勒胶质细胞的内源性修复机制作为治疗视网膜变性患者的治疗工具，将对社会产生重大影响。

本文提供了在眼科研究中应用退化/再生模型所需的步骤。我们首先聚焦于在神经感觉视网膜中诱导局灶性损伤，随后对损伤部位发生的事件进行成像，最后可视化邻近Müller细胞（MCs）的参与情况。该通用方案操作相对简便，为后续视网膜评估提供了广泛的可能性。

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方案

所有实验均遵循视力研究协会（ARVO）关于眼科与视觉研究中动物使用的声明，并遵守政府主管部门的相关规定。

1. 动物

  1. 在水温为 26.5 °C、光照/黑暗周期为 14/10 小时的标准条件下，饲养年龄为 6–9 个月的 TgBAC (gfap:gfap-GFP) 斑马鱼 167 (AB) 品系18。
  2. 在政府主管部门批准后，遵循相关机构规定的动物实验动物护理指南。

2. 可逆性全身麻醉

  1. 通过将400 mg三卡因甲磺酸盐（tricaine）粉末溶解于97.9 mL养殖水和2.1 mL 1 M Tris缓冲盐溶液（TBS）中，配制三卡因甲磺酸盐的储备液。用1 M Tris（pH 9）调节pH至7.0，并在4 °C避光保存，最多可保存一个月。
    注意：三卡因应使用与动物自然生存条件相似的水配制，最好使用原始的养殖水。
  2. 将储备液用养殖水按1:25稀释，并立即使用。
  3. 将斑马鱼放入含有50 mL麻醉液的10 cm培养皿中，直至其失去活动能力且对外界刺激无反应（约2 - 5分钟，具体时间取决于体重和年龄）。
  4. 用手将每条鱼转移至用于激光处理的定制硅胶固定针座中（图1A）。
    警告！鱼体在离开水箱后保持麻醉状态的时间不得超过10分钟。
  5. 处理和/或成像结束后，为逆转麻醉效果，将斑马鱼放入盛有养殖水的容器中。
  6. 为促进恢复，通过在水中来回移动斑马鱼，使其鳃部持续流过新鲜养殖水。

3. 视网膜激光局部损伤

注意：使用532 nm半导体激光器在斑马鱼视网膜上诱导局灶性光损伤。该激光器的实验装置可实现在成年斑马鱼中建立可重复的局灶性视网膜损伤。

  1. 设置激光输出功率：70 mW；光束直径：50 µm；脉冲持续时间：100 ms。
    警告！使用激光光源时需采取适当的个人防护措施，并对操作区域进行明确标识。
  2. 治疗前在眼部表面滴加1–2滴2%羟丙基甲基纤维素，并使用2.0 mm眼底激光镜片将激光瞄准光束聚焦于视网膜。
    警告！羟丙基甲基纤维素滴眼液具有黏性，若进入鳃部可能引起呼吸困难。
  3. 在左眼视神经周围放置四个激光光斑，以未处理的右眼作为内部对照。

4. 在体 视网膜形态成像

  1. 在第0天，于激光诱导后直接观察斑马鱼视网膜，此时无需从麻醉状态中复苏。在其余所有时间点，均采用全身麻醉（参见第2节：可逆性全身麻醉）。将固定好的斑马鱼置于定制的硅胶固定针架上（图1B，B.1).
  2. 为获得最佳图像，将市售的水凝胶隐形眼镜剪裁至适合斑马鱼眼睛的大小（Ø = 5.2 mm, r = 2.70 mm，中心厚度 = 0.4 mm）的环形切口。将甲基纤维素滴加至镜片的凹面，然后将其覆盖在角膜上。
  3. 使用78D非接触式裂隙灯镜头装配OCT系统。
  4. 在红外（IR）+ 光学相干断层扫描（OCT）模式下聚焦红外（IR）图像（图2A) 以观察眼底并点击获取红外图像 "获取" 按钮（图 2B) 使用系统软件在视网膜上定位激光光斑。
  5. 在 IR + OCT 模式下可视化视网膜各层的三维断面，并通过点击拍摄图像 "获取" 按钮（图 2B）。在这些图像中观察外核层（ONL）损伤的严重程度（参见第3节：视网膜激光局灶性损伤）。
  6. 处理和/或成像后，将斑马鱼置于盛有养殖水的容器中以逆转麻醉。
  7. 为支持恢复，通过在水中来回移动斑马鱼，使其鳃部流过新鲜的水体。
  8. 执行类似操作 在体 第1、3、7、14天及第6周的视网膜形态成像

5. 苏木精 & 伊红（H&E) 染色

  1. 将斑马鱼浸入冰上预冷（4 °C）的麻醉液中至少 10 分钟以实施安乐死，随后立即使用小型弯镊摘除眼球。
  2. 在 4 °C 条件下，用含 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）固定整个眼球 20 小时，然后将样品依次经梯度酒精脱水（二甲苯 100% 处理 5 分钟，重复两次；乙醇 100% 处理 5 分钟，重复两次；乙醇 96% 处理 3 分钟，重复两次；乙醇 70% 处理 3 分钟，一次）。
    注意！PFA 可对眼睛、鼻腔及上呼吸道产生刺激。PFA 是已知的人类致癌物，并可能具有生殖毒性。
  3. 将样品包埋于石蜡中，在视神经头水平切取 5 µm 厚的切片，并将其贴附于载玻片上。
  4. 用 0.1% 酸性苏木精溶液对脱蜡切片染色 5 分钟，随后将载玻片浸入盐酸混合液（250 mL 蒸馏水中含 2 mL 25% HCl）后迅速取出，并重复一次；再将载玻片浸入氨水混合液（250 mL 蒸馏水中含 2 mL 25% 氨水）后迅速取出，并重复一次。苏木精染色后，用自来水冲洗至少 10 分钟以显色，随后用 0.5% 水溶性伊红 G 溶液复染 3 分钟。
  5. 用丙烯酸树脂封片剂对脱水后的载玻片进行封片，并在光学显微镜下观察。

6. 小胶质细胞活化的免疫组织化学

  1. 将脱蜡切片置于抗原修复缓冲液（Tris-EDTA + 0.05% 非离子型去污剂，pH 9.0）中，在合适的蒸锅或微波炉中加热 3 分钟，或微波加热 10 - 15 分钟，随后用 TBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
  2. 用硅胶笔圈出切片区域，并在室温下加入 100 µL 封闭液（TBS + 10% 正常山羊血清 + 1% 牛血清白蛋白，pH 7.6），封闭 1 小时。
  3. 使用抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）兔多克隆抗体和抗谷氨酰胺合成酶（GS）小鼠单克隆抗体进行染色，两种抗体均按 1:200 稀释（每样本 40 µL）。将载玻片置于湿盒中，4 °C 过夜孵育。随后用含 0.1% Tween 20 的 TBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
  4. 使用相应的二抗完成显色。本方案采用 1:500 稀释的山羊抗兔 IgG H&L 绿色荧光二抗用于 GFAP，以及 1:500 稀释的山羊抗小鼠 IgG H&L 亮红色荧光二抗用于 GS，室温孵育 1 小时。
  5. 用含 DAPI 的封片剂封片，并在荧光显微镜下观察载玻片。

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结果

实时光学相干断层扫描（OCT）：为了分析小胶质细胞（MCs）在视网膜修复中的作用，我们采用了一种激光损伤模型，在斑马鱼视网膜中诱导出边界清晰的损伤区域。损伤部位首次通过活体in vivo OCT成像（第0天），即在损伤后60分钟内完成（图3）。为补偿鱼类眼球的光学特性，将一枚定制的角膜接触镜置于角膜表面。激光处理后即刻，外层视网膜出现弥散性高反射信号（箭头所示），其范围从视网膜色素上皮层（RPE）延伸至外丛状层（OPL）。第1天仍可检测到类似信号。至第3天后，该弥散信号逐渐变得更为致密且结构清晰，稳定出现在外核层（ONL），并延伸至光感受器层。第一周后（第7天），病灶平均尺寸显著缩小，仅残留微弱的高反射信号。从第14天起直至实验最晚时间点（第6周），在红外（IR）和OCT图像中均不再可见激光损伤斑点。

视网膜变性/再生的组织学...

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讨论

斑马鱼视网膜的再生与退变已通过多种方法进行研究，例如细胞毒素介导的细胞死亡22、机械损伤23和热损伤24。我们采用532 nm半导体激光器对斑马鱼视网膜造成损伤。该模型具有多项优势：例如，我们能够快速在视网膜外层、特别是感光细胞层（PRs层）形成边界清晰的损伤区域。此外，该实验装置可进行调整，以产生更大范围的损伤，用于研究其他生物学过程，例如通过损伤Bruch膜以诱导脉络膜新生血管形成。该方法的附带损伤极小，且再生反应的时间进程可被精确、可重复地调控。

为追踪表型随时间的变化，我们采用了海德堡Spectralis系统及海德堡Eye Explorer软件。因此，眼底红外成像在斑马鱼中被证明尤为有用。与眼底自发荧光（AF）相比，红外成像能更清晰地定位损伤部位，因为自发荧光在激光照射点与周围区域之间对比度较低。这使我们能够检测变化并监测再生过程 在体，而这是AF模式无法实现的。正如先前所报道的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Martin Zinkernagel 博士和 Miriam Reisenhofer 博士在建立模型过程中提供的科学指导，以及 Federica Bisignani 在技术上的出色协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酸性苏木精溶液Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士2852
白蛋白Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士A07030
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士5470
Dako笔Dako, Glostrup, 丹麦S2002
DAPI封片剂Vector Labs, Burlingame, CA, 美国H-1200
0.5%伊红G水溶液Carl Roth, Arlesheim, 瑞士X883.2
乙醇Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士2860
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士ED
EuKittSigma-Aldrich, Buchs, 瑞士3989
山羊抗兔IgG H&L Alexa Fluor® 488Life Technologies, Zug, 瑞士A11008
山羊抗小鼠IgG H&L Alexa Fluor® 594Life Technologies, Zug, 瑞士A11020
正常山羊血清Dako, Glostrup, 丹麦X0907
水凝胶隐形眼镜Johnson & Johnson AG, Zug, 瑞士n.a.1-Day Acuvue Moist
2%羟丙基甲基纤维素OmniVision, Neuhausen, 瑞士n.a.Methocel 2%
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士A5040Tricaine, MS-222
Visulas 532sCarl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, 德国n.a.532 nm激光
小鼠抗GS单克隆抗体Millipore, Billerica, MA, 美国MAB302
HRA + OCT成像系统Heidelberg Engineering, Heidelberg, 德国n.a.Spectralis
Heidelberg眼部检查软件Heidelberg Engineering, Heidelberg, 德国n.a.版本 1.9.10.0
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P5368
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P5368
兔抗GFAP多克隆抗体Invitrogen, Waltham, MA, 美国180063
硅胶固定针夹具Huco Vision AG 瑞士n.a.根据灭菌托盘中的硅胶针垫手工裁剪而成
裂隙灯BM900Haag-Streit AG, Koeniz, 瑞士n.a.
裂隙灯适配器Iridex Corp., Mountain View, CA, 美国n.a.
Superfrost Plus载玻片Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, 德国10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB)品系KIT, Karlsruhe, 德国15204http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris缓冲盐水（TBS）Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P5912
吐温20Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士P1379
78D非接触式裂隙灯镜头Volk Optical, Mentor, OH, 美国V78C
二甲苯Sigma-Aldrich, Buchs, 瑞士534056
眼底激光镜片Ocular Instruments, Bellevue, WA, 美国OFA2-0
2100 RetrieverAptum Biologics Ltd., Southampton, 英国R2100-EU蒸锅

参考文献

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