本实验方案的目的是通过碱酶法水解鸡羽毛制备角蛋白水解物，并检测将角蛋白水解物添加至化妆品软膏基质中是否能够改善皮肤屏障功能（提高皮肤水合程度并减少经皮水分流失）。实验在男性和女性志愿者中进行。
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摘要
摘要
角蛋白水解物（KHs）是毛发化妆品中已确立的标准成分。了解KH的保湿效果对护肤化妆品具有重要意义。本实验方案的目标是：（1）通过碱酶法水解将鸡羽毛加工成角蛋白水解物（KH），并采用透析法进行纯化；（2）检测将KH添加至油膏基质（OB）中是否可增加皮肤含水量，并通过降低经皮水分流失（TEWL）来改善皮肤屏障功能。在碱酶法水解过程中，首先将羽毛在高温碱性环境中孵育，随后在温和条件下使用蛋白酶进行水解。所得KH溶液经透析、真空干燥并研磨成细粉。制备由水包油乳剂（O/W）组成的化妆品配方，其中分别含有2%、4%和6%（按油膏基质重量计）的KH。在10名男性和10名女性受试者上测试KH的保湿性能，测试时间点分别为1、2、3、4、24和48小时。将待测配方涂抹于前臂屈侧去脂处理后的皮肤区域。通过测量皮肤电容来评估角质层（SC）的皮肤水合程度，该方法是全球应用最广泛且操作简便的方法之一。经皮水分流失（TEWL）的测定基于单位面积和单位时间内从皮肤表面蒸发的水量。这两种方法均为完全无创性检测。KH具有优良的封闭性能；根据其在油膏基质中的添加量，使用后可使TEWL降低达30%。KH还具有保湿剂功能，能够将表皮深层的水分结合至角质层；在油膏基质中添加最优浓度的KH时，男性皮肤水合度最高可提升19%，女性则可达22%。
引言
屠宰场、食品工业和制革工业每年都会产生大量的固体角蛋白副产品——羊毛、羽毛、鬃毛、蹄、爪、角等。根据最新的统计数据，美国每年屠宰的鸡、火鸡、鸭及其他禽类的活体总重量为625亿磅1；欧盟约为287亿磅/年。考虑到羽毛占禽类总重量的8.5%，仅美国每年就产生约53亿磅的废弃羽毛2。
角蛋白是一种具有高度化学抗性的蛋白质，因其通过二硫键强烈交联，导致其加工困难。要获得可溶性产物，需要断裂这些交联结构，并可能需进行肽键的水解3。二硫键的断裂可通过巯基负离子的反应进行，其反应模式如下4,5：
Sa- + –SbSc– ↔ –Sb- + –SaSc-
在pH值非常高的条件下，二硫键的水解也会发生，其模式与文献6所述一致
–S....
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方案
志愿者从本校员工和学生中招募。志愿者的筛选方法依据《涉及人类受试者的生物医学研究国际伦理准则》（国际医学科学组织理事会，日内瓦，2002年）。KH 是一种常见的化妆品成分，广泛用于护发产品（洗发水、护发素）中。 等等。因此，无需获得机构审查委员会的批准。
1. 将鸡毛加工成角蛋白水解物（KH）
- 从家禽养殖场收集鸡羽毛。
- 用足量的流动（冷水）水彻底清洗鸡羽毛，去除不溶性杂质和残留血液。将羽毛平铺于平板上，在50 °C下干燥过夜。
注意：本实验方案可在此暂停。 - 将50 g干燥羽毛使用切割式研磨机（适用于软至中等硬度及纤维状样品材料）研磨至最终粒径1.0 mm。也可采用更粗的粒径，但不得超过3.0 mm。
注意：本实验方案可在此暂停。 - 脱脂羽毛
注意：脱除家禽羽毛油脂最有效且经济的方法是使用市售的脂肪酶。- 在带有温度控制的27 L不锈钢反应釜中，将羽毛与预热至40 ± 2 °C的水按质量比1:75混合。加入脂肪酶（酶活力100 KLU/g），添加量为1.5–2.0%（相对于称取的干羽毛质量），并用顶置式搅拌器轻轻搅拌5分钟。
- 用1% NaOH或1% H3PO4溶液调节混合物pH至9.0 ± 0.2（此pH值对应脂肪酶的最高活性）。....
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结果
按照本文所述方法制备的KH（见图2）呈黄色，易溶于水，蛋白质含量高（无机固体含量＜2.0%）；1.0% KH溶液的pH为5.3，符合化妆品级水解物的质量要求。以50 g原料制备KH的产率约为30%。KH的分子量分布通过SDS-PAGE测定，结果如图3所示。
图 2：角蛋白水解物的代表性图片。
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讨论
碱性酶解法的优点在于可根据角蛋白水解物（KH）未来的应用需求进行调整。例如，在护发化妆品应用中，若产品呈现轻微的棕褐色不影响使用，则可在水解过程中采用较高温度，从而提高KH的产率。此外，技术流程两个阶段的加工时间延长会显著影响整体工艺效率——KH的产率可提升至85%。
水合度测量结果表明，在监测的测量时间间隔内（1 - 48 小时），在 OB 中添加 2% 的 KH 最为理想，因其可使男性志愿者角质层（SC）水合度提高 11 - 19%，女性志愿者提高 12 - 22%。所添加的 KH 具有较宽的分子量分布。我们推测，其中一部分低分子量组分（MW <20 kDa）在应用于皮肤后可渗透进入表皮。使用含 KH 配方后皮肤水合度的增加，可通过 KH 将来自表皮深层的水分结合至角质层结构中来解释，从而在 KH 分子与水之间形成氢键。该作用机制也得到部分作者的支持30。KH 的保湿效果与常规保湿剂（例如甘油、尿素和透明质酸）相当，这些保湿剂已在乳剂和凝胶配方中进行过测试22
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本文在兹林托马斯·巴塔大学项目 IGA/FT/2017/007 的支持下完成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料或化学品 | |||
| LIPEX 100T | 诺维信 | LJP30020 | Lipex - 由基因改造微生物经深层发酵产生的酶，活性为 100 KLU/g |
| Savinase Ultra 16L | 诺维信 | PXN40001 | Savinase - 由基因改造微生物经深层发酵产生的酶，活性为 16 KNPU-S/g |
| 氢氧化钾，KOH | Sigma-Aldrich | 302510289 | 氢氧化钾，KOH，97.0%，相对分子质量 56.11 |
| 磷酸溶液，H3PO4 | Sigma-Aldrich | W290017 | 磷酸溶液，H3PO4, 水中85 wt. %浓度，Mr 98,00 |
| 氯化钠生理溶液 | Sigma-Aldrich | 52455 | BioUltra NaCl生理溶液片剂；每1000 mL水中加入1片可配制0.9% NaCl溶液 |
| 氢氧化钠，NaOH | Penta s.r.o. | 40216 | 氢氧化钠，NaOH，97.0%，相对分子质量 40.00 |
| AmiFarm（Cremor 基质-A） | Fagron | 608425 | 亲水性油包水（O/W）乳膏基质；成分：水、石蜡、液体石蜡、鲸蜡醇，月桂醇聚醚-4、氢氧化钠、卡波姆、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯。 |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| IKA EUROSTAR POWER control-visc 搅拌器 | IKA实验室技术 | Z404020 | 数字式实验室搅拌器，适用于高粘度范围内的操作，230 V，1/cs |
| IKA 三叶螺旋桨式搅拌器 | IKA-实验室技术 | R 1381 | 三叶螺旋桨式搅拌器，搅拌器 Ø：45 毫米，轴 Ø：8 mm，轴长：350 mm |
| 透析袋封口器 | Sigma-Aldrich | Z371017-10EA | 透析袋封口夹，红色，110 mm 规格 |
| 透析管 cellulose 膜 | Sigma-Aldrich | D9402-100FT | 透析管透析袋纤维素膜，平均平展宽度 76 mm（3.0 in.） |
| DOMO 不锈钢电锅，带液晶显示屏 | DOMO Elektronic | DO42325PC | 保存锅炉用不锈钢，2000 W，27 L 容器（直径 37 cm，高度 30 cm），温度控制范围 30–100 ° C，操作液晶显示屏 |
| Hettich 离心机 Universal 32 | 杰明尼 bv | 2770 GS1R | 中型台式离心机，转速 18000 rpm |
| LT 3 摇床装置 | Fischer Scientific | 6470.0002 | 轨道摇床装置 |
| KERN 440-47N | 科尔恩 | 440-47N | 实验室天平 |
| KERN 770 | 科尔恩 | 770 -N | 实验室分析天平 |
| VENTICELL 222 - 舒适型 | BMT，MMM 小组 | C 131749 | 干燥箱，温度控制 30-100 ° C，空气循环控制 |
| Vacucell 55 - EVO | BMT，MMM 小组 | B 050328 | 真空干燥箱，温度控制 30-100 ° C |
| PULVERISETTE 19 | Fritsch | 19.1030.00 | 通用切碎机，带V型切割刃的转子及固定刀具 |
| 多探针适配器系统 MPA 5 | 勇气 &和 Kazaka 电子 | 10225237 | MPA 5 站点——用于测量水合度、经皮失水率（TEWL）和 pH 的设备 |
| 皮肤pH计PH 905探头 | 勇气 &和 Kazaka 电子 | 用于特异性测量皮肤表面或头皮pH值的探针 | |
| Corneometer CM 825 探头 | 勇气 &和 Kazaka 电子 | 用于测定皮肤表面（角质层）水合程度的探针。 | |
| Tewameter TM 300 | 勇气 &和 Kazaka 电子 | 用于评估经表皮水分流失（TEWL）的探头 | |
| Heidolph RZR 2020 | Heidolph | 13-225-007-03-1 | overhead搅拌器，机械调速，无级变速；转速范围40-2000 rpm |
| Heidolph 机械搅拌器 BR 10 | Heidolph | Z336688-1EA | 叶片式涡轮搅拌器 |
| Fagor FS 12 | Fagor | BTT-138 | 带冷冻空间的实验室冰箱 |
| WTW 台式 pH/mV 计 | WTW | Z313165 | 适用于科研或质量控制实验室常规及高精度测量的高性能台式pH计及pH/电导率仪 |
| 容器 | RPC Superfos | 13 升塑料桶，直径 26 cm，高度 26 cm | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>软件 | |||
| Microsoft Office 2010 | 微软 | ||
| C+K 软件 | Courage和Khazaka Electronic GmbH | MPA 5 站点操作软件 |
参考文献
- United States Department of Agriculture - National Agricultural Statistics Services. Poultry Slaughter, 2016 Summary. , (2016).
- McGovern, V. Recycling poultry feathers: more bang for the cluck. Environ.Health Perspect. 108 (8), A336-A339 (2000).
- Gousterova, A., et al.
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