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方法文章

从鸡毛中制备角蛋白水解物及其在化妆品中的应用

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⸱

DOI：

10.3791/56254

⸱

2017年11月27日

 ,  ,  , 
1Department of Polymer Engineering, Faculty of Technology, Tomas Bata University in Zlín, 2Department of Fat, Tenside and Cosmetics Technology, Faculty of Technology, Tomas Bata University in Zlín

本文内容

摘要

本实验方案的目的是通过碱酶法水解鸡羽毛制备角蛋白水解物，并检测将角蛋白水解物添加至化妆品软膏基质中是否能够改善皮肤屏障功能（提高皮肤水合程度并减少经皮水分流失）。实验在男性和女性志愿者中进行。

摘要

角蛋白水解物（KHs）是毛发化妆品中已确立的标准成分。了解KH的保湿效果对护肤化妆品具有重要意义。本实验方案的目标是：（1）通过碱酶法水解将鸡羽毛加工成角蛋白水解物（KH），并采用透析法进行纯化；（2）检测将KH添加至油膏基质（OB）中是否可增加皮肤含水量，并通过降低经皮水分流失（TEWL）来改善皮肤屏障功能。在碱酶法水解过程中，首先将羽毛在高温碱性环境中孵育，随后在温和条件下使用蛋白酶进行水解。所得KH溶液经透析、真空干燥并研磨成细粉。制备由水包油乳剂（O/W）组成的化妆品配方，其中分别含有2%、4%和6%（按油膏基质重量计）的KH。在10名男性和10名女性受试者上测试KH的保湿性能，测试时间点分别为1、2、3、4、24和48小时。将待测配方涂抹于前臂屈侧去脂处理后的皮肤区域。通过测量皮肤电容来评估角质层（SC）的皮肤水合程度，该方法是全球应用最广泛且操作简便的方法之一。经皮水分流失（TEWL）的测定基于单位面积和单位时间内从皮肤表面蒸发的水量。这两种方法均为完全无创性检测。KH具有优良的封闭性能；根据其在油膏基质中的添加量，使用后可使TEWL降低达30%。KH还具有保湿剂功能，能够将表皮深层的水分结合至角质层；在油膏基质中添加最优浓度的KH时，男性皮肤水合度最高可提升19%，女性则可达22%。

引言

屠宰场、食品工业和制革工业每年都会产生大量的固体角蛋白副产品——羊毛、羽毛、鬃毛、蹄、爪、角等。根据最新的统计数据，美国每年屠宰的鸡、火鸡、鸭及其他禽类的活体总重量为625亿磅1；欧盟约为287亿磅/年。考虑到羽毛占禽类总重量的8.5%，仅美国每年就产生约53亿磅的废弃羽毛2。

角蛋白是一种具有高度化学抗性的蛋白质，因其通过二硫键强烈交联，导致其加工困难。要获得可溶性产物，需要断裂这些交联结构，并可能需进行肽键的水解3。二硫键的断裂可通过巯基负离子的反应进行，其反应模式如下4,5：

Sa- + –SbSc– ↔ –Sb- + –SaSc-

在pH值非常高的条件下，二硫键的水解也会发生，其模式与文献6所述一致

–SS- + OH- → –S- + –SOH

在温和条件下（pH 约为 8），亚硫酸氢盐裂解反应仍按以下模式进行：

–SS– + HSO3- → –SH + –SSO3-

降解角蛋白最经济的方法是微生物分解，其特点是在处理过程中反应条件温和且分解效率高（约90%）7,8。某些从土壤和角蛋白废弃物中分离出的细菌能够产生角蛋白酶9。微生物来源的角蛋白酶可水解结构坚硬且高度交联的角蛋白10，所制备的角蛋白水解物富含可溶性蛋白质，且未检测到必需氨基酸的损失11。

为了将蛋白质应用于化妆品制剂（例如，乳剂、乳液和凝胶）中，需满足若干要求：确保此类蛋白质可溶于水，所得体系呈透明状态，并避免肽段因疏水相互作用而发生再聚集。因此，通常采用蛋白质水解物，如水解胶原蛋白、水解弹性蛋白和水解角蛋白。在将水解物加入化妆品乳剂时，应首先将其溶于水中。在某些情况下，期望蛋白质（或其水解物）可溶于乙醇或其他有机溶剂12。

角蛋白水解物（KH）通常被用于洗发水、护发素、乳液以及头发营养精华中，同时也应用于睫毛膏、指甲油和眼部化妆品。通常宣称的KH功效包括形成保护膜、平滑毛发或指甲结构、提高处理部位的可塑性和外观、调节产品稠度以及促进泡沫形成13,14。研究还表明，KH能够降低表面张力，因此在化妆品中添加KH有助于减少为稳定乳霜所需的乳化剂用量。KH可减轻清洁剂（表面活性剂）对皮肤、眼睛和毛发引起的刺激作用，从而降低清洁剂对组织可能产生的副作用（例如，皮肤脱水、硬化以及皮肤屏障功能下降）。水解物具有较强的缓冲能力，这一特性也被用于稳定化妆品的pH值；其中较短链的肽具有更强的缓冲效果15,16。尽管KH已成为护发和护甲化妆品中的常规成分，并广泛应用于护肤产品中，但关于KH保湿功效的研究在当代文献中尚不常见。

碱性-酶法技术已开发用于将角蛋白副产物加工为角蛋白水解物（KH），目前正在进行多种化妆品添加剂作用的活性测试17,18,19,20,21,22。利用微生物蛋白酶对鸡羽毛进行两步法碱性-酶解水解，其优势在于温和反应条件下即可实现高效率，且所得KH质量远高于强酸或强碱水解法。第一步是在碱性环境中于较高温度下孵育羽毛，部分破坏角蛋白结构并使羽毛膨胀；调节pH后，在第二步中于温和条件下使用蛋白水解酶对羽毛进行水解。透析后的KH含有高含量的蛋白质。

本文所述方法的目的在于通过碱性-酶法水解将禽类羽毛加工为角蛋白水解物（KH），并检测将KH应用于水包油型（O/W）化妆品乳液后其保湿性能的效果。保湿性能通过仪器化的无创方法进行评估。 体内测量角质层皮肤水合状态和屏障功能的最常用方法包括检测皮肤的电学特性（电导率或电容）。研究角质层水合状态的不同方法还包括近红外多光谱成像法（NIM）、核磁共振波谱法、光学相干断层扫描或瞬态热传递23角质层的屏障功能与其经皮水分流失（TEWL）相关，可通过通风腔室法、非通风腔室法和开放腔室法进行测量。24.

使用MPA 5多探头适配器配合三种探头测定模型配方的性能。第一种探头为角质层水分测试仪（corneometer CM 825），通过检测皮肤表面电容变化来评估皮肤水合程度；测量电容器以角质层水分测试单位显示皮肤表面电容的变化。该仪器仅能对皮肤水合状态提供相对评估25。对于经皮失水率（TEWL）的测定，采用第二种探头——经皮水分流失测试仪（tewameter TM 300），该仪器基于菲克扩散定律，利用开放式腔体装置，通过两对传感器（温度和相对湿度）间接测量从皮肤表面蒸发的水蒸气密度梯度，结果表示为单位面积和单位时间内传输的水量（g/m2/h）。该方法可检测到皮肤屏障功能的轻微损伤26。皮肤pH值是表皮角质层（SC）屏障功能和抗微生物功能的指标之一27。皮肤酸性外膜的pH值通过连接至MPA 5主机的第三种探头——皮肤pH测试仪（skin PH 905）进行测定。该专用探头包含一个平顶玻璃电极，可与皮肤完全接触，并连接至电压计。系统通过测量探头顶端极薄半固态层周围氢阳离子活性所引起的电位变化，将电压变化以pH值形式显示28。

本实验分为三个部分：（1）通过两步碱酶水解法从鸡毛中制备角蛋白水解物（KH），并采用透析法进行纯化（去除盐分和低分子量组分）；（2）制备含有2%、4%和6% KH的化妆品配方；（3）通过测定皮肤含水量、经皮失水率（TEWL）和皮肤pH值来测试KH的性能。实验在10名平均年龄为27.2岁的女性和10名平均年龄为26.2岁的男性中进行。志愿者的筛选方法及实验过程均遵循国际生物医学研究中使用人类受试者的伦理原则29；所有受试者在参与研究前均签署了知情同意书。在测试开始前，志愿者需填写有关其健康状况的问卷。志愿者承诺在测试前24小时及测试期间，不在测试部位及其周围区域使用任何化妆品；此外，仅允许在晚间用流动水进行短暂清洗。

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方案

志愿者从本校员工和学生中招募。志愿者的筛选方法依据《涉及人类受试者的生物医学研究国际伦理准则》（国际医学科学组织理事会，日内瓦，2002年）。KH 是一种常见的化妆品成分，广泛用于护发产品（洗发水、护发素）中。 等等。因此，无需获得机构审查委员会的批准。

1. 将鸡毛加工成角蛋白水解物（KH）

  1. 从家禽养殖场收集鸡羽毛。
  2. 用足量的流动（冷水）水彻底清洗鸡羽毛，去除不溶性杂质和残留血液。将羽毛平铺于平板上，在50 °C下干燥过夜。
    注意：本实验方案可在此暂停。
  3. 将50 g干燥羽毛使用切割式研磨机（适用于软至中等硬度及纤维状样品材料）研磨至最终粒径1.0 mm。也可采用更粗的粒径，但不得超过3.0 mm。
    注意：本实验方案可在此暂停。
  4. 脱脂羽毛
    注意：脱除家禽羽毛油脂最有效且经济的方法是使用市售的脂肪酶。
    1. 在带有温度控制的27 L不锈钢反应釜中，将羽毛与预热至40 ± 2 °C的水按质量比1:75混合。加入脂肪酶（酶活力100 KLU/g），添加量为1.5–2.0%（相对于称取的干羽毛质量），并用顶置式搅拌器轻轻搅拌5分钟。
    2. 用1% NaOH或1% H3PO4溶液调节混合物pH至9.0 ± 0.2（此pH值对应脂肪酶的最高活性）。用顶置式搅拌器搅拌5分钟，然后使用实验室台式pH/mV计检测并重新调节pH值。
    3. 在40 ± 0.5 °C下，用顶置式搅拌器轻轻搅拌混合物24小时。也可在40 ± 0.5 °C下静置孵育，并在孵育前6小时内每隔1小时搅拌一次。
    4. 用孔径100 µm的细筛过滤混合物，并用流动的（冷水）水冲洗脱脂后的羽毛。将羽毛平铺于平板上，在干燥箱中50 °C下干燥过夜。
      注意：本实验方案可在此暂停。
  5. 进行鸡羽毛水解的第一阶段。将羽毛与0.3% KOH水溶液按质量比1:50混合，在60 ± 0.5 °C下用顶置式搅拌器轻轻搅拌24小时。混合物的pH在孵育初期约为12.5，孵育结束时降至约11.0。完成第一阶段水解后，加入1% NaOH，用10% H3PO4将混合物pH调节至蛋白酶最适活性对应的pH值（本例中为9.0 ± 0.2）。
  6. 进行鸡羽毛水解的第二阶段。向混合物中加入蛋白酶，添加量为5.0%（相对于第一阶段水解开始时称取羽毛的干物质质量）。在60 ± 0.5 °C下用顶置式搅拌器轻轻搅拌8小时，然后在同一27 L不锈钢反应釜中将混合物加热至沸腾（100 °C），煮沸10分钟以灭活酶。
  7. 通过布氏漏斗上使用低密度滤纸并施加轻微负压，过滤分离KH溶液（步骤1.6制备）与未溶解残渣；也可使用离心法。
    注意：若将KH溶液在5 ± 1 °C下保存，本实验方案可暂停数天。
  8. 在塑料桶（直径26 cm × 高26 cm）中，使用12 K截留分子量（MWCO）透析膜对KH进行透析，以去除小肽和盐类。将400 mL KH溶液装入透析袋中，置于4 L蒸馏水中透析80小时，室温下进行；分别在18、36和60小时更换蒸馏水。
  9. 将透析后的KH溶液按500 mL每1,000 cm2板面积的比例浇注于防粘板（例如，硅胶板）上，在40 ± 0.5 °C下真空干燥成薄膜，过夜。干燥后研磨成细粉，密封保存于干燥器中。
    注意：若KH粉末保存于干燥环境中，本实验方案可暂停数月。

2. 使用 KH 制备化妆品配方

注意：用于测试的油相（OB）为市售亲水性O/W型乳膏基质，其组分包括水、石蜡、液体石蜡、鲸蜡醇硬脂醇、月桂醇聚醚-4、氢氧化钠、卡波姆、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。

  1. 制备含有2%、4%和6% KH（按软膏基质重量计）的制剂。将相应量的KH粉末称重至聚乙烯容器（直径7 cm，高10 cm）中，并加入OB，使制剂总重量达到50 g；参见表1中的配方。
化妆品配方软膏基质重量 [g]角蛋白水解物重量 [g]总重量 [g]
软膏基质50050
软膏基质 + 2 % KH491
软膏基质 + 4 % KH482
软膏基质 + 6 % KH473

表1：制备化妆品配方所需的软膏基质与角蛋白水解物的称样量。

  1. 使用三叶实验室搅拌器在134.16 × g 条件下均质化混合物10分钟，并用机械顶置式搅拌器搅拌。将配制好的制剂在5 ± 1 °C 条件下保存，使用前于室温下预热2小时。
    注意：OB与KH混合物的均质化也可使用非数字式搅拌器完成。非数字式搅拌器上标有近似转速（rpm）刻度。此步骤中轻柔搅拌效果最佳。
    注意：若将制剂保存在5 ± 1 °C 条件下，本方案可在此处暂停，最长可达5个月。

3. 通过测量皮肤水合度、经皮水分流失和pH值来测试KH的特性

注意：所有测量均需在温度为 23 ± 2 °C、相对湿度为 56 ± 3% 的恒温恒湿环境中进行。

  1. 将5条滤纸条（尺寸为2 × 4 cm）放入生理溶液（0.90% NaCl）中，浸泡约1分钟。
  2. 将其中两条贴于右前臂内侧，三条贴于左前臂内侧，并用胶布固定4小时。此步骤旨在脱脂并消除局部皮肤的个体差异。4小时后取下滤纸条，并用永久性记号笔标出区域，见图1。

前臂局部软膏测试；对照组与不同KH浓度的比较图表。
图1：测试制剂在左右上肢前臂部位的应用方法。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用注射器在脱脂后的前臂各测试点分别涂抹0.1 mL待测配方，并将其均匀涂抹至整个标记区域。在左前臂的第一个测试点不涂抹任何物质（作为空白对照），第二个点涂抹OB，第三个点涂抹OB + 2% KH；在右前臂的测试点分别涂抹OB + 4% KH和OB + 6% KH。
  2. 在每个测试点及每个时间间隔（1、2、3、4、24和48小时），对每一样本进行测量：使用皮肤水合度检测仪探头测量皮肤水合度，取5次读数；使用经皮失水率（TEWL）检测仪探头测量皮肤TEWL，取15次读数；使用皮肤pH计探头测量皮肤pH值，取1次读数。在测试期间，志愿者不得在测试区域及其周围使用任何化妆品，仅允许晚间用流动水短暂清洗。
    注意：本实验方案可在此处暂停。
  3. 使用电子表格软件对所得读数进行描述性统计学的基本数值特征分析。对于每个样本测得的5次水合度读数，剔除最高值和最低值，仅基于剩余3个读数计算算术平均值和标准差；对于每个样本测得的15次TEWL读数，剔除前5次读数，仅基于后续10次读数计算算术平均值和标准差。

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结果

按照本文所述方法制备的KH（见图2）呈黄色，易溶于水，蛋白质含量高（无机固体含量＜2.0%）；1.0% KH溶液的pH为5.3，符合化妆品级水解物的质量要求。以50 g原料制备KH的产率约为30%。KH的分子量分布通过SDS-PAGE测定，结果如图3所示。

用于晶体学分析和分离研究的含矿物碎片的培养皿
图 2：角蛋白水解物的代表性图片。

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讨论

碱性酶解法的优点在于可根据角蛋白水解物（KH）未来的应用需求进行调整。例如，在护发化妆品应用中，若产品呈现轻微的棕褐色不影响使用，则可在水解过程中采用较高温度，从而提高KH的产率。此外，技术流程两个阶段的加工时间延长会显著影响整体工艺效率——KH的产率可提升至85%。

水合度测量结果表明，在监测的测量时间间隔内（1 - 48 小时），在 OB 中添加 2% 的 KH 最为理想，因其可使男性志愿者角质层（SC）水合度提高 11 - 19%，女性志愿者提高 12 - 22%。所添加的 KH 具有较宽的分子量分布。我们推测，其中一部分低分子量组分（MW <20 kDa）在应用于皮肤后可渗透进入表皮。使用含 KH 配方后皮肤水合度的增加，可通过 KH 将来自表皮深层的水分结合至角质层结构中来解释，从而在 KH 分子与水之间形成氢键。该作用机制也得到部分作者的支持30。KH 的保湿效果与常规保湿剂（例如甘油、尿素和透明质酸）相当，这些保湿剂已在乳剂和凝胶配方中进行过测试22

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本文在兹林托马斯·巴塔大学项目 IGA/FT/2017/007 的支持下完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>材料或化学品
LIPEX 100T诺维信LJP30020Lipex - 由基因改造微生物经深层发酵产生的酶，活性为 100 KLU/g
Savinase Ultra 16L诺维信PXN40001Savinase - 由基因改造微生物经深层发酵产生的酶，活性为 16 KNPU-S/g
氢氧化钾，KOHSigma-Aldrich302510289氢氧化钾，KOH，97.0%，相对分子质量 56.11
磷酸溶液，H3PO4Sigma-AldrichW290017磷酸溶液，H3PO4, 水中85 wt. %浓度，Mr 98,00
氯化钠生理溶液Sigma-Aldrich52455BioUltra NaCl生理溶液片剂；每1000 mL水中加入1片可配制0.9% NaCl溶液
氢氧化钠，NaOHPenta s.r.o.40216氢氧化钠，NaOH，97.0%，相对分子质量 40.00
AmiFarm（Cremor 基质-A）Fagron608425亲水性油包水（O/W）乳膏基质；成分：水、石蜡、液体石蜡、鲸蜡醇，月桂醇聚醚-4、氢氧化钠、卡波姆、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯。
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>仪器设备
IKA EUROSTAR POWER control-visc 搅拌器IKA实验室技术Z404020数字式实验室搅拌器，适用于高粘度范围内的操作，230 V，1/cs
IKA 三叶螺旋桨式搅拌器IKA-实验室技术R 1381三叶螺旋桨式搅拌器，搅拌器 Ø：45 毫米，轴 Ø：8 mm，轴长：350 mm
透析袋封口器Sigma-AldrichZ371017-10EA透析袋封口夹，红色，110 mm 规格
透析管 cellulose 膜Sigma-AldrichD9402-100FT透析管透析袋纤维素膜，平均平展宽度 76 mm（3.0 in.）
DOMO 不锈钢电锅，带液晶显示屏DOMO ElektronicDO42325PC保存锅炉用不锈钢，2000 W，27 L 容器（直径 37 cm，高度 30 cm），温度控制范围 30–100 ° C，操作液晶显示屏
Hettich 离心机 Universal 32杰明尼 bv2770 GS1R中型台式离心机，转速 18000 rpm
LT 3 摇床装置Fischer Scientific6470.0002轨道摇床装置
KERN 440-47N科尔恩440-47N实验室天平
KERN 770科尔恩770 -N实验室分析天平
VENTICELL 222 - 舒适型BMT，MMM 小组C 131749干燥箱，温度控制 30-100 ° C，空气循环控制
Vacucell 55 - EVOBMT，MMM 小组B 050328真空干燥箱，温度控制 30-100 ° C
PULVERISETTE 19Fritsch19.1030.00通用切碎机，带V型切割刃的转子及固定刀具
多探针适配器系统 MPA 5勇气 &和 Kazaka 电子10225237MPA 5 站点——用于测量水合度、经皮失水率（TEWL）和 pH 的设备
皮肤pH计PH 905探头勇气 &和 Kazaka 电子用于特异性测量皮肤表面或头皮pH值的探针
Corneometer CM 825 探头勇气 &和 Kazaka 电子用于测定皮肤表面（角质层）水合程度的探针。
Tewameter TM 300勇气 &和 Kazaka 电子用于评估经表皮水分流失（TEWL）的探头
Heidolph RZR 2020Heidolph13-225-007-03-1overhead搅拌器，机械调速，无级变速；转速范围40-2000 rpm
Heidolph 机械搅拌器 BR 10HeidolphZ336688-1EA叶片式涡轮搅拌器
Fagor FS 12FagorBTT-138带冷冻空间的实验室冰箱
WTW 台式 pH/mV 计WTWZ313165适用于科研或质量控制实验室常规及高精度测量的高性能台式pH计及pH/电导率仪
容器RPC Superfos13 升塑料桶，直径 26 cm，高度 26 cm
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>软件
Microsoft Office 2010微软
C+K 软件Courage和Khazaka Electronic GmbHMPA 5 站点操作软件

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从鸡毛中制备角蛋白水解物及其在化妆品中的应用
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