通过整体荧光标记联合方案可视化斑马鱼中的多纤毛细胞 原位 杂交与免疫荧光

摘要

纤毛发育对正常器官形成至关重要。本方案描述了一种优化的方法，用于标记和观察斑马鱼的纤毛细胞。

摘要

近年来，斑马鱼胚胎因其具有诸如 子宫外 胚胎发育与光学透明性。特别是，斑马鱼胚胎已成为研究脊椎动物肾脏器官发生以及多纤毛细胞（MCC）发育的重要模式生物。为了在斑马鱼胚胎肾脏中可视化多纤毛细胞，我们建立了一种整体荧光标记的联合实验方案 原位 荧光原位杂交（FISH）和整体免疫荧光（IF）技术，可实现高分辨率成像。本文描述了我们用于共定位RNA转录本与蛋白质的技术，作为一种通过分析多种谱系因子的表达来深入理解发育程序调控的工具。

引言

在过去的几十年中，斑马鱼（Danio rerio）已成为研究发育生物学的重要模式生物。其胚胎在母体外发育，且具有光学透明性。此外，眼睛、肾脏和前脑等重要器官的形成过程迅速，受精后24小时（hpf）内即可形成基本结构。尤为重要的是，斑马鱼基因组与哺乳动物高度保守^1,2,3。同时，斑马鱼与哺乳动物的器官在解剖结构和生理功能上具有相似性。斑马鱼的胚胎肾脏（即前肾）体现了该模型系统在研究早期肾发生过程中基因功能以及脊椎动物肾单位中保守的上皮细胞群体命运决定方面的价值^{4,5,6,7,8,9,10}。同样，斑马鱼胚胎在研究多纤毛细胞（MCCs）发生发育过程中的作用也日益重要^{11,12,13,14,15,16,17}。

顾名思义，多纤毛细胞（MCCs）是一类上皮细胞，其特征是顶端表面具有一束可运动的纤毛¹⁷。在斑马鱼中，MCCs参与液体流动，并在受精后24小时（24 hpf）以类似“盐与胡椒”"salt-and-pepper"的分布方式散在分布于前肾每个肾单位的中段^{11,12,13,14,15,16,17}。尽管目前仅在少数人类肾脏疾病病例中观察到MCCs的存在^18,19,20,21，但MCCs在其他哺乳动物组织（如脑和气管）中则较为常见^22,23,24，这为实验设计带来了诸多挑战。包括斑马鱼在内的多种脊椎动物模型中的精巧研究表明，MCC命运决定存在一条保守的发育通路，其中Notch信号通路可抑制MCC的发育^{12,17,25,26,27}。因此，斑马鱼前肾为在活体（in vivo）条件下研究MCC发育的遗传机制提供了一个易于操作的模型系统^{11,12,13,14,15,16,17}。

斑马鱼胚胎的透明性及其易于进行遗传操作的特性，在研究调控细胞命运、组织生长以及早期胚胎发育的遗传与分子通路时，已被证明具有极高的价值。^1,2,3因此，传统的蛋白质和基因转录本可视化技术，例如 原位 杂交和整体免疫荧光染色已应用于斑马鱼并进行了优化^{16,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38}通过结合常用的FISH和IF实验方案，可以对MCCs进行标记和分析 体内^16,28,37,38.

方案

以下实验方案使用由圣母大学斑马鱼研究中心饲养和维护的成年斑马鱼。所有涉及成年斑马鱼及胚胎的操作方法均经机构动物护理与使用委员会批准。

1. 胚胎固定

1. 采用先前描述的方法收集斑马鱼胚胎^39,40。在受精后24小时（24 hpf），向胚胎培养皿的E3培养基中加入500 µL非特异性蛋白酶混合液（50 mg/mL），于室温（RT）孵育。
2. 当胚胎开始从绒毛膜中脱出时，移除胚胎培养皿中的所有液体。
3. 用新鲜E3培养基清洗胚胎2 – 3次：每次加入约20 mL E3培养基，轻轻晃动培养皿使液体旋转混合，然后将液体倾倒至液体废弃物容器中。
4. 在固定前对胚胎实施安乐死，向E3培养基中加入 2 mL 0.2% 三卡因（tricaine）。
5. 使用塑料巴斯德吸管将胚胎转移至5 mL玻璃小瓶中。待胚胎沉降至瓶底后，用吸管吸除大部分三卡因/E3溶液。
6. 用5 mL 4%多聚甲醛（PFA）在室温（RT）下固定24 hpf的胚胎，固定2–4小时，期间不进行振荡。
   警告：PFA具有毒性，操作PFA溶液时应在化学通风橱内进行，并佩戴护目镜、手套和实验服。配制PFA固定液时需格外小心，因颗粒状PFA粉末易因静电而飞散。
   注意：胚胎可在4 °C条件下用4% PFA过夜固定。配制4% PFA时，将1×磷酸盐缓冲液（PBS）加热至沸腾，同时持续搅拌，以完全溶解颗粒状PFA。待溶液冷却至室温后，使用0.45 µm一次性真空过滤装置对4% PFA进行过滤除菌，然后分装至15 mL或50 mL离心管中，于-20 °C保存。
7. 移除4% PFA溶液，在室温下用含0.1% Tween-20的1×磷酸盐缓冲液（PBST）清洗胚胎两次。再于室温下用5 mL 100%甲醇（MeOH）清洗胚胎一次。向胚胎中加入5 mL新鲜的100%甲醇，于-20 °C孵育至少20分钟。
   注意：胚胎可在-20 °C条件下保存于100%甲醇中，直至准备进行后续胚胎处理。

2. 胚胎制备与杂交

1. 在室温下，用 5 mL 含 50% 甲醇的 1× PBST 溶液洗涤胚胎一次，持续 5 分钟，以进行复水。随后在室温下，用 5 mL 含 30% 甲醇的 1× PBST 溶液洗涤 5 分钟，继续复水。最后在室温下，用 5 mL 1× PBST 溶液洗涤胚胎两次，每次 5 分钟。
2. 将胚胎在 5 mL 含 1:1,000 蛋白酶 K（pK）（10 mg/mL）的 1× PBST 溶液中孵育 2 分钟，以实现通透化处理。
   注意：较晚期的胚胎可在上述 pK 浓度下孵育超过 2 分钟；但对于小于 24 hpf 的胚胎，建议使用 5 mg/mL 的 pK 浓度，且孵育时间少于 2 分钟。
3. 移除 pK 溶液，并立即在室温下用 5 mL 1× PBST 溶液洗涤两次。随后在室温下，将胚胎置于 5 mL 4% 多聚甲醛（PFA）中固定至少 20 分钟。
   注意：胚胎可在 4 °C 下用 4% PFA 过夜固定。
4. 移除 PFA 溶液，并在室温下用 5 mL 1× PBST 溶液洗涤两次。
5. 将胚胎连同 5 mL 1× PBST 转移至平底微量离心管中，将管子垂直放置于微量离心管架上，在室温下操作，以促进每个胚胎与后续杂交溶液之间的充分接触。
6. 在室温下，用 1.5 mL 杂交溶液（Hyb+）洗涤胚胎两次。加入 1.5 mL 新鲜的 Hyb+ 溶液，并将胚胎置于 70 °C 杂交炉中孵育 4–6 小时。
7. 将 1.5 mL Hyb+ 溶液替换为足量的探针溶液（每 500 µL Hyb+ 中含 10 µL RNA 探针），确保溶液完全覆盖胚胎。
   注意：反义 RNA 探针的合成可采用先前描述的方法³⁹。
8. 将探针在 70 °C 杂交炉中杂交过夜，将各离心管垂直置于微量离心管架上，不进行振荡。

3. 热洗涤与封闭

注意：高温洗涤是将适当的溶液加入胚胎后，在70 °C的杂交炉中孵育。为保持洗涤溶液的温度在70 °C，当加入探针/Hyb+混合物时，应将每种溶液的50 mL离心管放入杂交炉中。

1. 移除探针。在70 °C下，用1.5 mL的50%甲酰胺/2×盐-柠檬酸钠（SSC）缓冲液洗涤胚胎两次，每次20-30分钟。
   注意：探针可在-20 °C下保存于Hyb+中，供日后重复使用。
2. 在70 °C下，用1.5 mL的2×SSC缓冲液洗涤胚胎一次，持续15分钟。再在70 °C下，用1.5 mL的0.2×SSC缓冲液洗涤胚胎两次，每次20-30分钟。弃去0.2×SSC，加入1.5 mL封闭试剂，于4 °C下过夜孵育。
   注意：也可在室温下孵育封闭试剂4小时，代替过夜孵育。

4. 抗体孵育与马来酸缓冲液洗涤

注意：胚胎需避免暴露于环境光下。

1. 用 0.2 mL 封闭剂中的抗 DIG-POD 抗体（按 1:1,000 比例稀释）替换原有的封闭剂，于室温下避光（使用铝箔或其他避光覆盖物）孵育 3 小时。
   注意：也可选择在 4 °C 下孵育过夜。
2. 3 小时后，在 1.5 mL 马来酸缓冲液中于室温下洗涤胚胎 2–4 次，每次 10–15 分钟。随后在 1.5 mL 新鲜的马来酸缓冲液中于 4 °C 下孵育胚胎过夜。
   注意：过夜孵育于马来酸缓冲液中并非必需，但可降低探针背景信号。

5. 探针检测及过氧化物酶的去除

注意：胚胎需避免暴露于环境光下。

1. 移除马来酸缓冲液，加入 1.5 mL 的 1x PBS 替代。在室温下用 1.5 mL 的 1x PBS 洗涤胚胎两次，每次 5 分钟。在室温下用 0.2 mL 的 Cy3 荧光染色液孵育胚胎 60 分钟。
   注意：不同探针的孵育时间可能有所不同。
2. 在室温下，用以下浓度的甲醇（MeOH）与 1x PBS 的混合液各 1.5 mL，依次为 30% MeOH、50% MeOH、75% MeOH 和 100% MeOH，洗涤胚胎一次，每次 10 分钟。
3. 在室温下用 1.5 mL 含 1% H₂O₂ 的甲醇溶液孵育胚胎 30 分钟。在室温下用 1.5 mL 的以下甲醇与 1x PBS 混合液依次洗涤胚胎一次，每次 10 分钟：75% MeOH、50% MeOH 和 30% MeOH。最后在室温下用 1.5 mL 的 1x PBS 洗涤胚胎两次，每次 5 分钟。
   注意：胚胎可在 4°C 的 PBS 中保存过夜。

6. 免疫荧光

注意：胚胎需避免暴露于环境光下。

1. 在室温下，用 1.5 mL ddH₂O 清洗胚胎 5 分钟。在室温下，用 1.5 mL 预冷的丙酮（保存于 -20 °C）清洗胚胎 7 分钟。在室温下，用 1.5 mL ddH₂O 再清洗胚胎一次，持续 5 分钟。在室温下，用 1.5 mL 含 1% DMSO 的 1× PBST（PBDT）清洗胚胎一次，持续 5 分钟。
2. 将胚胎置于 1.5 mL PBDT + 10% 胎牛血清（FBS）中，在摇床上室温孵育 2 小时。
3. 移除 PBDT + FBS，加入 1.5 mL 一抗溶液，其中包含抗乙酰化微管蛋白抗体（小鼠来源）和抗γ-微管蛋白抗体（兔来源），用 PBDT + 1% FBS 按 1:400 比例共同稀释。在 4 °C 下孵育过夜。
   注意：孵育时间可能因一抗不同而有所变化。可能需要测试不同时间间隔以优化标记效果。

7. 二抗

注意：胚胎需避免暴露于环境光下。

1. 为去除胚胎中过量的未结合抗体，在室温下将胚胎置于 1.5 mL PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl 中，在摇床上洗涤 1 分钟。
2. 在室温下，将胚胎在 1.5 mL PBDT + 1% FBS + 0.1 M NaCl 中洗涤 5 次，每次 30 分钟，置于摇床上；随后在 1.5 mL PBDT + 1% FBS 中于室温下继续在摇床上洗涤 30 分钟。
3. 将胚胎在 4 °C 下避光孵育过夜，加入 200 µL 二抗溶液（Alexa 488 山羊抗小鼠 IgG 和 Alexa 647 山羊抗兔 IgG），用 PBDT 按 1:500 比例共同稀释。

8. DAPI 染色

注意：胚胎需避免暴露于环境光下。

1. 在室温下，用 1.5 mL PBDT 快速清洗胚胎两次。弃去 PBDT，加入 1.5 mL DAPI（用 1× PBST 稀释至 1:15000），在摇床上室温孵育 15 分钟。
2. 用 1.5 mL PDBT + 1% FBS + 0.1 M NaCl 在室温下清洗胚胎三次，每次 15–20 分钟。将胚胎保存在 1.5 mL PBDT 中，置于 4 °C，待后续封片和成像时使用。

9. 斑马鱼前肾的封片与成像

1. 将胚胎侧卧置于载玻片上，加入约 10 µL 的 PBDT 溶液。
2. 用精细镊子在胚胎眼睛后方轻轻挤压，去除头部及部分卵黄球。
3. 使用精细镊子轻轻刮除胚胎体部残留的卵黄球。用细纸巾吸除载玻片上离散的卵黄和多余液体。
4. 在胚胎剩余的尾部滴加一滴封片介质，调整位置使尾部侧向平铺。盖上盖玻片以压平样品，随后放入带盖的玻片盒中。
5. 在共聚焦显微镜下以 60 倍放大倍数观察肾脏纤毛，使用以下通道：DAPI 显示为蓝色（激光波长 408.0 nm），FITC 显示为绿色（激光波长 488.0 nm），Cy3 染料标记显示为红色（激光波长 561.0 nm），Alexa 680 显示为白色（激光波长 637.0 nm）。

结果

野生型斑马鱼胚胎在受精后24小时（24 hpf）进行固定，并立即按照上述方法进行处理。图1展示了实验流程以及部分代表性发育阶段。步骤1至8所概述的流程包括样本获取、固定以及对固定组织进行操作，以利用反义核糖探针标记内源性转录本，随后通过免疫荧光标记目标蛋白。流程中的第9步涉及专为优化斑马鱼胚胎躯干部位成像而设计的封片与成像技术。在第9步的示意图中，我们展示了将组织置于载玻片上时的操作方法。在此步骤中，需去除胚胎的头部和卵黄球，仅保留尾部，并将其侧向置于载玻片与盖玻片之间。建议去除卵黄球和头部，以便更佳地观察前肾中驻留的多纤毛细胞（MCC）群体，因为卵黄球具有自发荧光，会干扰成像并阻碍封片过程。

使用共聚焦显微镜获得的代表性图像见图2，其中展示了同一野生型胚胎在60倍放大倍数下的图像以及相同放大倍数下的数字放大图像。上方图板显示各个独立通道的图像，下方两个图板为这些成像数据的合并叠加图像。白色方框（左列图像中）标示出数字放大的区域（右列图像）。在数字放大合并图像的最末图板中，细胞核以DAPI标记，多纤毛细胞（MCCs）通过设计用于识别odf3b的反义核糖探针进行检测，其中γ-微管蛋白抗体标记基体，α-微管蛋白标记纤毛。在合并叠加图像的数字放大图中，黄色虚线圆圈标示一个MCC的边界，该MCC因含有odf3b转录本、多个基体及纤毛而被识别。相邻的单纤毛细胞以黄色点状圆圈标记，其识别依据为具有单个基体和单根纤毛的表型。

图1：实验流程示意图。 该流程图展示了一个实验工作流程，并配有关键步骤的示意图，其中雪花表示低温孵育，三条弯曲的线代表加热，时钟表示长时间孵育。整个流程最少可在6天内完成（见各步骤右上角标注的天数），但某些步骤可根据实验方案延长操作时间。图中详细绘制了封片过程，展示了最终位于载玻片与盖玻片之间的胚胎尾部。黑色虚线框标出了以60倍放大倍数成像的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：斑马鱼前肾多纤毛细胞（MCC）成像的代表性结果。 对一个24小时受精龄（hpf）的野生型斑马鱼胚胎在60倍放大倍数下的共聚焦显微镜最大投影图像，以及同一胚胎在60倍放大倍数下共聚焦图像的数字放大图。白色方框标示了数字放大所聚焦的区域。各单独染色图像包括DAPI（细胞核）、odf3b（多纤毛细胞）、γ-微管蛋白（基体）和α-微管蛋白（纤毛），分别标注后合并显示于下方两个图面板中。在数字放大图中，我们对细胞位置进行了如下近似标注：虚线黄色圆圈标示一个多纤毛细胞，点线黄色圆圈标示一个单纤毛细胞。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

上述方案经过优化，适用于在24小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎前肾管中对odf3b转录本和α-微管蛋白标记多纤毛细胞（MCCs）。为获得最佳结果，建议使用新鲜固定并制备的胚胎。若胚胎经固定后于-20 °C条件下保存在甲醇（MeOH）或Hyb+溶液中超过一周，仍可使用，但随着保存时间延长，非特异性背景染色的可能性会增加。

对该技术进行修改和故障排除是必要的，以便将该方法适用于其他特定标记组合，例如其他反义核糖探针和其他抗体。针对整体装片过程中各步骤参数调整的多种方法 原位 杂交已在我们团队及其他团队先前的研究中有所记载^{31,34,36,38,39}同样，每种蛋白质抗体在染色时间方面均需进行一定的优化，而针对每种一抗的稀释比例和孵育时间的大致范围，最好通过评估已有文献记录的结果来确定。^28,35对于年龄小于24 hpf的胚胎，pK处理时间应短于2分钟；而对于年龄大于24 hpf的胚胎，pK处理时间应长于2分钟。此外，年龄大于24 hpf的胚胎在pK处理前应进行色素漂白。

使用荧光染色液染色后，必须通过一系列甲醇和过氧化氢洗涤步骤，彻底去除残留的染料、抗体以及过氧化物酶。随后立即进行PBS洗涤，以清除胚胎中多余的甲醇。重要的是，在进行免疫荧光抗体操作之前，我们发现丙酮和去离子水洗涤可降低胚胎彼此之间或与离心管之间的黏附倾向。根据我们的经验，针对特定转录因子及其他基因的抗体，尽管在Western blot中可能具有良好的效果，但在斑马鱼的免疫荧光（IF）实验中效果不佳。然而，一些高度保守且丰度较高的蛋白，如α-微管蛋白（α-tubulin）和β-连环蛋白（β-catenin），在斑马鱼的免疫荧光实验中表现良好^16,37。

利用FISH技术，可以对斑马鱼中尚无特异性抗体的基因的RNA转录本进行可视化观察。通过将FISH与IF相结合（如本方案所示），可实现RNA转录本与蛋白质的共定位检测 体内 (图2该方案的灵活性使其能够快速排查问题，从而在多种组织和时间点实现对各种RNA转录本和蛋白质的可视化。结合斑马鱼胚胎本身已被广泛认可的优势，FISH + IF方案为研究发育通路调控相关基因和蛋白质的表达提供了又一有力工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
非特异性蛋白酶混合溶液	罗氏	11459643001，链霉菌蛋白酶（pronase from Streptomyces griseus）	在 E3 中稀释 <强>无 亚甲蓝配制成50 mg/mL储存液；于-20℃保存°C
E3 溶液			将50倍浓缩的E3溶液（250 mM NaCl、8.5 mM KCl、16.5 mM CaCl₂、16.5 mM MgSO₄溶于蒸馏水中）用蒸馏水稀释；加入1 × 10⁻⁵ M亚甲蓝（sigma M9140）以抑制污染
三卡因（氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	Fluka	A5040-250G	配制0.2%的储存液：将1 g三卡因粉末溶于10 mL pH 9.5的Tris溶液中，再用蒸馏水定容至500 mL
胚胎培养皿	VWR	351029
5 mL 玻璃小瓶	Wheaton	225012
一次性塑料巴斯德吸管	VWR	414004-004
4% 多聚甲醛（PFA）溶液	电子显微镜服务	19210	将4% PFA溶于1×PBS中，在通风橱内加热至沸腾。冷却后分装，于-20℃保存°C. 解冻后请勿再次冷冻。
10X PBS	American Bioanalytical	AB11072	用蒸馏水稀释，配制成1X工作液
Tween-20 储存液	American Bioanalytical	AB02038	用蒸馏水稀释配制0.1% Tween-20储存液。
含0.1% Tween 20的1X磷酸盐缓冲液（PBST）	Sigma	P9416	1× PBS 中含 0.1% Tween-20
甲醇（MeOH）	Sigma	34860-4L
蛋白酶K	罗氏	3115879001	溶于蒸馏水中，配制成10 mg/mL的储存液；分装后于-20℃保存°C
平底微量离心管	VWR	87003-300; 87003-298
甲酰胺	American Bioanalytical	AB00600	-20储存°C
杂交溶液（HYB+）			50% 甲酰胺，5X SSC，0.1% Tween-20，5 mg/mL 酵母多聚 RNA，50 μ克/μL 肝素；于 -20 ℃ 保存°C
杂交炉	Fisher Scientific	13-247-10Q
20X 盐水-柠檬酸钠（SSC）缓冲液	American Bioanalytical	AB13156	用蒸馏水稀释，配制成 2X 和 0.2X 储存液
封闭试剂溶液	罗氏	11096176001	用马来酸缓冲液稀释，配制成10%的储存液；4℃保存°C
马来酸缓冲液	Sigma	M0375 和 S7653	150 mM 马来酸，100 mM NaCl（pH 7.5）
抗地高辛-POD，Fab片段	罗氏	11207739910	4℃保存°C
Cy3荧光染色液	PerkinElmer, Inc.	NEL744001KT，TSA Plus Cyanin3 系统	4℃保存°C；通过将试剂盒中的TSA试剂（溶于60 μL DMSO中）用缓冲液按1:50比例新鲜配制染色液
过氧化氢（H2O2）	Sigma	H1009-500mL	4℃保存°C
分子生物学级蒸馏水（ddH₂O）	Mediatech	25-055-CM
丙酮	American Bioanalytical	AB00636-01000	在 -20 保存一份等分试样°C
DMSO	American Bioanalytical	AB00435-01000
胎牛血清（FBS）	Gibco	10438-034	分装并保存于 -20°C
单克隆抗乙酰化微管蛋白抗体 克隆 6-11B-1	Sigma-Aldrich	T6793	分装并保存于 -20°C
抗-γ兔源抗-tubulin抗体	Sigma-Aldrich	T5192	分装并储存在 -20°C
odf3b cDNA 克隆 MGC:63985	OpenBiosystems	图像：6792478	将细菌甘油菌种保存于 -80°C
NaCl	American Bioanalytical	AB01915-05000
Alexa Fluor 647 山羊抗兔 IgG	Life Technologies	A21245	4℃保存°C；避光保存
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG	Life Technologies	A11029	4℃保存°C；避光保存
DAPI	Life Technologies	D1306	分装并保存于 -20°C
载玻片	赛默飞世尔科技	4445
玻璃盖玻片	赛默飞世尔科技	12-540A	18 x 18 mm
精细镊子	Roboz	RS-1050	Dumont 镊子 55 型
封片剂	Polysciences, Inc.	18606，Aqua-Poly/Mount	4℃保存°C
共聚焦显微镜及配套软件			我们使用配备 NIS-elements AR 软件的尼康 C2plus 共聚焦显微镜
摇床	伯乐（Bio-Rad）	1660710EDU