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方法文章

微流控干法纺丝及再生丝素蛋白纤维的表征

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DOI：

10.3791/56271

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2017年9月4日

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Modification of Chemical Fibers and Polymer Materials, College of Materials Science and Engineering, Donghua University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于再生丝素蛋白单丝的微流控纺丝及其微观结构表征的实验方案。

摘要

本实验方案展示了一种模拟家蚕吐丝过程的方法。在天然吐丝过程中，收缩的丝道通过剪切力和拉伸力使丝蛋白变得致密且有序。本研究设计了一种仿生微流控通道，以模拟家蚕丝道的特定几何结构。将高浓度掺杂的再生丝素蛋白（RSF）纺丝液通过该微通道挤出，在常温常压下进行干法纺丝制备纤维。在后续处理过程中，初生纤维在乙醇水溶液中进行牵伸并储存。采用同步辐射广角X射线衍射（SR-WAXD）技术分析单根RSF纤维的微观结构，测试时将纤维固定于样品台上，使纤维轴方向垂直于X射线微束。根据WAXD数据计算纤维的结晶度、晶粒尺寸和晶体取向。二维WAXD图谱中赤道附近出现的衍射弧表明，经过后处理的RSF纤维具有较高的取向度。

引言

蜘蛛和蚕能够在常温常压下从水性蛋白质溶液中产生优异的丝纤维。剪切流和拉伸流可在丝腺中诱导形成液晶结构1。近年来，人们高度关注模拟蜘蛛的纺丝过程，以制备高强度的人工纤维。然而，由于蜘蛛具有同类相食的习性，通过养殖蜘蛛无法高效且经济地大量生产蜘蛛丝蛋白。相比之下，通过养殖蚕可轻松获得大量蚕丝。此外，蚕与蜘蛛具有相似的纺丝过程和氨基酸组成。因此，许多研究人员选择蚕丝纤维蛋白作为替代材料，用于纺制人工动物丝。

蜘蛛和蚕通过其纺丝管将蛋白质溶液挤出，在空气中形成纤维。纺丝管内产生的高应力很可能使丝纤蛋白分子拉伸至更伸展的构象2。人工丝纤维已采用传统的湿法纺丝和干法纺丝工艺制备3,4，但这些方法未考虑纺丝管内产生的流体作用力。

首先，采用微流控方法研究了丝蛋白的组装过程5,6。随后，通过模拟剪切力和拉伸力，研究了再生丝素蛋白（RSF）的微流控制备过程7,8。利用微流控湿法纺丝可调控RSF纤维的杨氏模量和直径，但所制得纤维的拉伸强度低于100 MPa7。最终，研究人员成功采用微流控干法纺丝方法制备出高强度的RSF纤维，但纤维直径仅为2 µm8。最近，微流控湿法纺丝已成功应用于高强度重组蜘蛛丝纤维的制备。纺丝后在空气中牵伸可改善人工纤维的表面和内部缺陷9。

本研究介绍了用于再生丝素蛋白（RSF）纤维的改进型微流控纺丝工艺。该工艺旨在模拟蚕丝的纺丝过程，包括纺丝原液、剪切力以及干法纺丝过程。这种纺丝方法不仅能够制备高强度的人工蚕丝纤维，还可调节纤维的直径。首先，RSF纺丝原液在具有二阶指数衰减结构的仿生微通道中受到剪切和拉伸作用。其次，在微流控干法纺丝过程中，研究了相对湿度（RH）对纤维形貌和性能的影响10。与传统的纺丝喷丝板相比，我们的微流控系统具有高度仿生特性，能够在常温下通过干法或湿法纺丝从溶液中制备出高强度纤维。

由于同步辐射微聚焦X射线具有高分辨率、高亮度和高能量，可用于表征直径为几微米的单根纤维的微观结构4,11,12,13,14。本研究采用同步辐射广角X射线衍射（SR-WAXD）技术计算丝素蛋白（RSF）纤维的结晶度、晶粒尺寸和晶体取向。

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方案

警告：使用前请查阅所有相关的化学品安全技术说明书。用于制备模具的多种化学试剂具有急性毒性。请使用个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋底的鞋子）。

1. 丝素蛋白水溶液的微流控纺丝

  1. 丝素蛋白水溶液纺丝液的制备4,15,16
    1. 蚕茧脱胶
      1. 去除胶质 家蚕 用 Na 重复处理茧两次2CO3 水溶液（水中0.5 wt%） 100 °C 每次30分钟，然后用去离子水清洗蚕丝以去除丝胶。
    2. 脱胶蚕茧的溶解
      1. 将脱胶蚕茧丝在空气中干燥；然后按 1:10 (w/v) 的比例将脱胶蚕茧丝溶于 9.0 M LiBr 水溶液中 40 °C 2小时。例如，每1克丝素加入10 mL溴化锂（LiBr）图1a).
    3. 离心与过滤
      1. 将RSF溶液用去离子水稀释1.5倍。离心并过滤以去除杂质。将RSF溶液分装至250 mL离心瓶中进行离心。 4 °C 10 分钟，1,234.8 × g。使用滤器过滤 RSF 溶液 20 µm 滤膜和真空泵。考虑到实验效果，建议使用双层滤纸床。
    4. 透析
      1. 将RSF溶液在去离子水中透析 5 °C 使用纤维素半透膜（截留分子量：14,000 ± 2,000）透析3天。共约1 L的丝素蛋白（RSF）溶液分装于4个透析袋中，将这些透析袋置于盛有10 L反渗透（RO）去离子水的桶中。
        注意：去离子水的 pH 值应高于 6，以避免在浓缩过程中发生凝胶化。本实验方案中，去离子水的 pH 值无需调节。
    5. 浓缩
      1. 通过强制气流将RSF水溶液浓缩至20 wt% 5 °C。加入 3 M CaCl2 将水溶液加入到丝素蛋白（RSF）溶液中，使钙浓度达到 1.0 mmol/g Ca2+ 终浓度；然后通过强制气流浓缩至38-47 wt%。
      2. 在载玻片上称取一滴RSF溶液，然后于烘箱中60 °C干燥2 h 105 °C.
        注意：干燥后剩余固体的重量与干燥前液滴重量的百分比即为蛋白质和CaCl₂的总浓度。2. 在扣除 CaCl₂ 质量后计算得出 RSF 浓度2至少进行了四次重复测量。我们之前的研究表明，Ca的浓度2+ 极大地影响了再生丝素蛋白水溶液的流变性能和可纺性。同时，添加 Ca2+ 促使β-折叠结构的有限形成及丝素蛋白（RSF）的聚集17在天然纺丝液中，CaCl2 在纺丝原液储存过程中，被认为对防止纺丝前发生凝胶化起着重要作用。18
  2. 微流控芯片的制备8,19
    1. 制备光刻掩模
      1. 在 CAD 程序中设计微通道。打印 CAD 文件以制备高分辨率透明掩膜19.
    2. 制备模具
      1. 清洁载玻片
        1. 在通风橱中，将载玻片置于浓硫酸与30 vol%过氧化氢溶液（10:1）的混合液中，在加热板上煮沸20分钟。
          警告：硫酸和过氧化氢蒸气具有极高毒性。
      2. 清洗载玻片
        1. 用去离子水清洗载玻片，并用高纯度氮气吹干。
      3. 包被膜
        1. 使用自制的涂覆装置，在载玻片上涂覆 SU-8 光刻胶，间隙为 100 µm 涂层棒底面与玻璃上表面之间
      4. 旋涂
        1. 使用匀胶机在40.3 × g条件下旋转30秒，将光刻胶均匀涂布在玻璃载片上形成薄膜。该均匀薄膜的厚度约为 85 µm.
      5. 凝固
        1. 在带有温度控制程序的烤箱中固化光刻胶。将温度从室温升至 65 °C 在 2 °C/分钟，并保持在 65 °C 2 分钟。继续加热升温至 65 °C 至 95°C 并保持在 95 °C 15分钟。关闭烘箱，自然冷却至室温。
      6. 紫外线照射
        1. 使用透明掩模通过光刻法将涂有光刻胶的玻片侧面暴露于紫外光下照射12秒19.
          注意：紫外光的波数为 365 nm，曝光能量为 273.6 mJ/cm²2.
          注意：使用紫外灯和烘箱时，应采取适当的安全防护措施。
      7. 按照步骤1.2.2.5中所述固化光刻胶。
      8. 开发中
        1. 将光刻胶在显影液中进行30秒的超声清洗。用异丙醇和显影液交替清洗载玻片，直至载玻片上无任何沉淀物。
      9. 在带有温度控制程序的烘箱中固化光刻胶。将温度从室温升至 170 °C 在 2 °C/分钟，并保持在 170 °C 30 分钟。关闭烘箱，于烘箱内自然冷却至室温。
    3. 软光刻
      1. 将8.8 g液态聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚物倒入模具中，并在 65 °C，以及15分钟 80 °C液态PDMS预聚物由PDMS和固化剂组成（通常按10:1（w/w）比例混合）。
    4. 打孔
      1. 使用直径为1.2 mm的钻头在通道起始处的PDMS复制件上打孔。
    5. 密封
      1. 通过氧等离子体处理两层PDMS表面，将带有微通道的PDMS复制品与无图案的平坦PDMS层密封结合。
        注意：芯片的整体制备过程大约需要72小时。
  3. RSF 纤维的制备
    1. 纺丝液的注射
      1. 将RSF纺丝液注入微通道中 2 µL/min 通过注射泵。
    2. 环境调控
      1. 使用加湿器将相对湿度调节至40 ± 5 RH%或50 ± 5 RH%。在40 ± 5 RH%条件下，初生纤维的固化速度比50 ± 5 RH%时更快。
    3. RSF纤维的制备
      1. 用针尖接触微流控通道出口处的丝素蛋白（RSF）液滴，将RSF纤维牵引至空气中，然后以3 cm/s的速度通过10 cm的空气间隙将其卷绕到滚轮上（图1b).
    4. 将RSF纤维置于密封干燥器中保存24 h。
    5. 纤维后处理
      1. 将初生纤维以 0.9 mm/s 的速度拉伸 4 倍-1 在自制设备中，将纤维浸入80 vol%乙醇溶液中，然后保持拉伸后的纤维固定，继续在该溶液中浸泡1小时。经此处理后，纤维长度由最初的15 mm变为60 mm。
    6. 准备样品以进行表征
      1. 将后处理的纤维固定在标距为10 mm的纸框上。测量所需纤维数量至少为20根，用于拉伸试验、扫描电镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和广角X射线散射（WAXS）。后拉伸纤维的直径范围为5至 10 µm. 图1 显示了纤维制备及WAXD表征的示意图。采用材料试验系统在(25 ± 2) °C 且相对湿度为 (45 ± 5)%。拉伸速率为 2 mm/min，标距长度为 1 cm。

2. 丝素蛋白纤维晶体结构的同步辐射表征

  1. 同步辐射表征4,13,17
    1. 光束线调节
      1. 将X射线的波长和光斑尺寸分别调节至0.07746 nm和3 × 2 µm2。
        注：本实验方案使用上海同步辐射设施的BL15U1光束线完成。
    2. X射线光斑定位
      1. 确定X射线光斑的位置。
        注：X射线光斑的位置由同步辐射设施的实验室技术人员进行调节。
    3. 标准样品测试：二氧化铈（CeO2）
      1. 测试标准样品CeO2粉末。通过表征CeO2粉末以计算圆心位置及样品到探测器的距离。
    4. 样品制备
      1. 将RSF纤维平行固定在纸框上，标距为10 mm。将纸框粘贴在测试台上。
        注：保持纤维处于水平状态。
    5. 同步辐射广角X射线衍射（SR-WAXD）测试
      1. 打开快门
        1. 确认室内无人后关闭光束线站的门，打开X射线光源的快门。
      2. 聚焦
        1. 轻微移动纤维直至聚焦。通过软件远程调节纤维在x、y、z方向的位置（图1c）。
      3. 样品曝光
        1. 通过软件远程上下移动纤维，使其位于X射线光斑处。在软件中按下开始按钮，使纤维暴露于X射线光束线20秒（图1c）。
      4. 背景衍射
        1. 以20秒的曝光时间测试空气背景的衍射。通过软件远程将纤维移离X射线光斑。在软件中按下“开始”按钮，使X射线光束线暴露于“空气介质”20秒。
  2. SR-WAXD数据处理13
    1. 软件校准
      1. 使用FIT2D（V12.077）处理WAXD数据。利用CeO2粉末的衍射数据校准圆心位置和样品到探测器的距离。
    2. 二维衍射图样
      1. 使用FIT2D（V12.077）从纤维衍射图样中扣除空气背景。
    3. 结晶度与晶粒尺寸
      1. 对散射角2θ函数的衍射强度进行积分。使用自动峰分离软件（版本4.12）12对强度积分进行解卷积。结晶度（xc）通过以下关系式估算：
        手性方程 \(X_c = \frac{I_c}{I_c + I_a}\)，分析化学公式。
        ，其中Ic为晶态峰积分强度之和，Ia为非晶晕的积分强度4,11。对WAXD图样的积分得到[200]、[020]、[002]衍射峰的峰宽。利用这些峰的半高全宽（FWHM），结合谢乐公式（Scherrer公式）4确定沿a、b、c轴方向的晶粒尺寸。
    4. 晶粒取向的确定
      1. 根据(020)和(210)衍射峰的方位角积分计算晶粒和非晶相的取向11。晶体取向可依据Herman取向函数进行定量计算。此处，(020)和(210)峰均采用两个高斯函数拟合，较窄的峰对应晶态取向，较宽的峰对应取向性非晶物质13。本研究中，通过(002)峰的方位角积分半高全宽（FWHM）比较RSF纤维的晶粒取向。

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结果

采用微流控纺丝方法成功制备了高强度的再生丝素纤维（RSF）。拉伸后的 RSF 纤维 C44R40 的应力-应变曲线和 SEM 图像如图 2所示。拉伸测试中至少测量了 10 根纤维。应力-应变曲线根据纤维断裂应力和断裂应变的平均值进行选取。纤维的广角 X 射线衍射（WAXD）数据如图 3所示。根据 WAXD 数据计算了纤维的结晶度和晶粒取向。在样品命名中，使用 C 和 R 分别表示纺丝液中 RSF 的浓度和相对湿度。例如，在 40 ± 5% 相对湿度（RH）下，由 44 wt% RSF 纺丝液纺制并以 4 倍拉伸比进行后拉伸的纤维记为 C44R40。其他纤维根据相同命名规则分别记为 C44R50、C47R40 和 C47R50。

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讨论

在丝素蛋白（RSF）溶液透析过程中，pH值对后续的浓缩过程至关重要。如果去离子水的pH值低于6，RSF溶液在浓缩过程中更容易发生凝胶化。为防止凝胶化，需向RSF溶液中添加CaCl2，其添加浓度为每重量RSF加入1 mmol的CaCl2。

我们之前的研究已证明，可以通过微流控干法纺丝技术对丝素蛋白（RSF）水溶液进行纺丝8。此前微流控通道的几何结构采用简化的单级指数函数设计。而对于蜘蛛和家蚕，纺丝原液在形成纤维前，需经过两级指数衰减型纺丝管道进行牵伸1,20。本研究中，微流控通道的几何结构仿照家蚕纺丝管道的二级指数衰减函数进行设计1。微流控通道的宽度从初始的 2,065 µm 逐渐减小至末端的 265 µm，牵伸通道的长度为 21.5 mm。在之前的研究中，所获得的 RSF 纤维直径为 2 µm，因此必须使用一束 RSF 纤维进行...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家自然科学基金（21674018）、国家重点研发计划（2016YFA0201702 / 2016YFA0201700）、上海市教育发展基金会和上海市教育委员会支持的“曙光计划”（15SG30）、东华大学杰出青年教授计划（A201302）、中央高校基本科研业务费专项资金以及“111 计划”（编号：111-2-04）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
B. mori 蚕茧中国浙江省桐乡市农户
碳酸钠，无水，99.8%上海凌峰化学试剂有限公司，中国分析纯
溴化锂，99.1%上海中锂实业有限公司，中国分析纯
氯化钙，无水，96.0%上海凌峰化学试剂有限公司，中国分析纯
乙醇，无水，99.7%国药集团化学试剂有限公司，中国10009218分析纯
SU-8 光刻胶MicroChem Corp.，美国
显影液MicroChem Corp.，美国
Sylgard 184道康宁公司（Dow Corning），美国
异丙醇上海凌峰化学试剂有限公司，中国分析纯
浓硫酸平湖化学试剂厂，中国分析纯
30 体积% 过氧化氢上海金路化学试剂有限公司，中国分析纯
丙酮上海正兴化工试剂厂，中国分析纯
氧气等离子体处理DT-01，苏州欧米伽机电科技有限公司，中国
注射泵 KD Scientific，美国KDS 200P
加湿器SEN 电气
钻机杭州博阳机械有限公司，中国台式钻床 Z406c
材料试验系统Instron，美国型号：5565
PeakFitSystat Software, Inc.，美国版本 4.12

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