方法文章

人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化 关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

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DOI：

10.3791/56274

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2017年10月30日

 , 
1Center for Stem Cell Biology and Engineering, University of California, Santa Barbara

本文内容

摘要

本方案描述了如何从多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮细胞（RPE）。该方法通过联合使用生长因子和小分子化合物，在14天内将干细胞定向分化为未成熟RPE，并在三个月后获得成熟且具有功能的RPE细胞。

摘要

我们介绍一种将多能干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞（RPE）的稳健方法。提供详细而全面的实验方案旨在清晰展示每一步操作，以便本领域研究人员能够方便地使用。该方案可获得均一的RPE细胞层，几乎无需或完全无需手动分离。本文所述方法已被证实对诱导性多能干细胞（iPSC）和人胚胎干细胞均有效。此外，我们还描述了中间细胞库的冷冻保存方法，可实现长期储存。采用本方案生成的RPE细胞可能适用于iPSC疾病模型构建或临床应用。

引言

视网膜色素上皮是一层由色素细胞组成的单层结构，为光感受器提供至关重要的支持。视网膜色素上皮细胞（RPE）在视觉功能中具有多种作用，包括光吸收、营养物质和离子转运、视黄醇循环、光感受器外节的吞噬作用以及生长因子的分泌1。多种视网膜营养不良性疾病会影响RPE的功能，导致视力丧失，其中包括年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性。利用多能干细胞生成RPE细胞有助于深入研究这些眼病，并可为细胞治疗提供无限来源的RPE细胞2。事实上，目前已有多个临床试验正在使用来源于多能干细胞的RPE细胞3。

该分化方案最初由 Buchholz 描述4 并基于 Clegg 之前发表的方法5该步骤模拟了正常的 在体内 通过调控胰岛素样生长因子（IGF）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2；FGF-basic）、转化生长因子β（TGF-β）和WNT信号通路，引导未分化的多能干细胞向视网膜色素上皮（RPE）细胞命运分化的发育过程4,5在方案后期添加WNT信号通路激动剂显著优化了该实验流程，获得了97.77% ± 0.1%的早期内体蛋白（PMEL）阳性细胞，并已调整为无异源条件。6,7所产生的RPE在转录和蛋白水平均表达RPE标志物，能够以适当的极性分泌已知的RPE生长因子，并吞噬光感受器外节段8. 本方案比 "自发的" 通过简单去除碱性成纤维细胞生长因子诱导分化的方案8此外，RNA测序数据表明，采用本方案获得的视网膜色素上皮（RPE）细胞与采用更常见的自发分化方法获得的RPE细胞非常相似。814天方法生成的RPE符合 "5P原则" Mazzoni 提到9 （有色素的、极化的、具有吞噬作用的、有丝分裂后的、多边形的）9尽管该实验步骤已在多个实验室中被证明具有可重复性，但我们希望指出近年来已发表的其他几种定向分化方法10,11,12,13.

方案

1. 准备实验方案第0天至第14天所需的试剂

  1. 准备以下培养基成分：
    1. 在96 mL的Dulbecco改良必需培养基/营养混合物F12（DMEM/F12）中加入1 mL 100倍N2添加剂、2 mL 50倍B27添加剂以及1 mL 100倍非必需氨基酸（NEAA），配制100 mL视网膜分化培养基（RDM）。
    2. 将1.221 g烟酰胺（NIC）溶解于8 mL无菌水中，涡旋混匀后用无菌水定容至10 mL，配制成10 mL 1 M的烟酰胺溶液。经无菌滤膜过滤除菌。
  2. 准备以下生长因子和小分子化合物：
    1. 将重组小鼠noggin、人Dickkopf WNT信号通路抑制因子1（DKK-1）和IGF-1分别用含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，配制成浓度均为100 µg/mL的溶液。根据需要分装，于-20 °C保存，最长可保存3个月。
    2. 将碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）溶解于含0.1% BSA的PBS中，配制成10 µg/mL的溶液；将重组人/小鼠/大鼠Activin A溶解于含0.1% BSA的PBS中，配制成100 µg/mL的溶液。根据需要分装，于-80 °C保存，最长可保存1年。
    3. 将SU 5402（FGF受体特异性酪氨酸激酶抑制剂）和CHIR99021（糖原合酶激酶3，GSK-3β抑制剂）分别用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成浓度均为10 mM的溶液。分装后分别于-20 °C保存，最长可保存1年或6个月。
  3. 准备第0天和/或第14天所需的以下试剂：1×乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（每升PBS中含0.2 g EDTA）、1×不含钙镁离子的PBS（PBS -/-，pH 7.4）、1×类胰蛋白酶解离酶（TDE）、DPBS（Dulbecco's PBS）、视网膜色素上皮支持培养基（RSM）以及Y-27632二盐酸盐（使用浓度为10 µM）。

2. 第0天：多能干细胞传代分化日

  1. 在传代前，将干细胞集落培养于无饲养层、无血清条件下，直至汇合度达到约80%。
    注意：有关此步骤优化的详细信息，请参见讨论部分。
  2. 按照生产商推荐方法，用基于细胞外基质的水凝胶（ECMH）包被12孔板。室温下静置1小时，或4 °C过夜。
  3. 分装第0天所需的RDM和PBS -/-体积，并在水浴中预热至37 °C，然后加入生长因子。将EDTA恢复至室温。
  4. 向预热的RDM中加入第0天所需的生长因子，包括10 mM NIC、50 ng/mL noggin、10 ng/mL DKK-1和10 ng/mL IGF-1。根据步骤1.2中所述的储备液，向10 mL RDM中加入100 µL NIC、5 µL noggin、1 µL DKK-1和1 µL IGF-1。
  5. 根据形态学特征挑取并去除将用于分化传代的干细胞中所有已分化的集落。使用P10移液枪头手动移除已分化的细胞。
    注意：集落之间的成纤维样细胞以及集落内部的不透明细胞均为应去除的已分化细胞。有关已分化细胞的详细信息，请参见讨论部分。
  6. 将一个6孔板中的单孔细胞以1:4比例传代至12孔板中的4个孔。
    注意：有关此阶段干细胞传代的详细信息，请参见讨论部分。
    1. 吸除干细胞培养基，并用2 mL预热的PBS -/-洗涤一次。
    2. 吸除PBS -/-，然后用每孔1 mL EDTA对6孔板的每个孔进行三次冲洗。
    3. 轻轻倾斜培养板并吸除EDTA。切勿晃动培养板，以免细胞过早脱落。
    4. 第三次洗涤后，加入1 mL EDTA，在生物安全柜中室温孵育3–5分钟。孵育期间勿扰动培养板。
    5. 吸除EDTA，向每个待接种的孔中加入1 mL RDM，并额外加入0.5 mL培养基。例如，用4.5 mL RDM洗涤6孔板中的1个孔，以接种至12孔板的4个孔中。
    6. 使用细胞刮轻轻刮下细胞。将所有细胞收集至锥形管中，用移液器在RDM中上下吹打5次以重悬细胞。分散较大的细胞团块，但不要吹打至单细胞悬液。在移液过程中均匀分布细胞。此步骤需迅速完成，以防细胞重新贴壁。
    7. 将细胞接种至ECM包被的12孔板中（每孔加入1 mL细胞悬液）。
    8. 轻轻前后倾斜培养板，使细胞在各孔中均匀分布。随后轻柔地放入37 °C、5% CO2的细胞培养箱中，直至下次换液。
    9. 记录确切时间，并每天在同一时间更换培养基。

3. 第1至14天：添加生长因子

  1. 第1天：使用含有第0天生长因子成分的RDM培养基（每孔1 mL）更换所有孔中的培养基（参见步骤2.4）。
  2. 第2天：使用含有10 mM NIC、5 ng/mL FGF-basic、10 ng/mL noggin、10 ng/mL DKK-1和10 ng/mL IGF-1的RDM培养基（每孔1 mL）更换培养基。根据步骤1.2中所述的储存液，向10 mL RDM培养基中加入100 µL NIC、5 µL FGF-basic、1 µL noggin、1 µL DKK1和1 µL IGF1。
  3. 第4天：使用含有100 ng/mL activin A、10 ng/mL DKK-1和10 ng/mL IGF-1的RDM培养基（每孔1 mL）更换培养基。根据步骤1.2中所述的储存液，向10 mL RDM培养基中加入10 µL activin A、1 µL DKK1和1 µL IGF-1。
    注意：观察此时细胞已达到汇合状态。
  4. 第6天：使用含有100 ng/mL activin A和10 µM SU 5402的RDM培养基（每孔1 mL）更换培养基。根据步骤1.2中所述的储存液，向10 mL RDM培养基中加入10 µL activin A和10 µL SU 5402。
  5. 第8、10和12天：使用含有100 ng/mL activin A、10 µM SU 5402和3 µM CHIR99021的RDM培养基（每孔1 mL）更换培养基。根据步骤1.2中所述的储存液，向10 mL RDM培养基中加入10 µL activin A、10 µL SU 5402和3 µL CHIR99021。

4. RPE细胞富集至第0代传代

  1. 按照制造商建议，用生长因子减少的ECMH包被6孔板。室温下静置1小时，或4 °C过夜。
  2. 分装所需体积的DPBS，以及每孔富集用1 mL RDM，并在水浴中预热至37 °C。将TDE恢复至室温，并将所需体积的RSM、抗菌试剂和Y-27632预热至37 °C。
  3. 向RSM中加入抗菌试剂和Y-27632，使其终浓度分别为0.5x和10 µM。在最初4–7天使用该培养基以提高细胞贴壁率。
  4. 吸除所有孔中的废弃培养基，每孔加入1 mL预热的RDM（无需添加生长因子）。
  5. 在解剖显微镜下，使用P10移液枪头手动解剖并刮除所有非RPE细胞。
    注：参见代表性结果部分中的示例。
  6. 解剖后，吸除RDM及所有细胞碎片。每孔用1 mL预热的DPBS洗涤两次。
  7. 每12孔板孔中加入0.5 mL TDE，37 °C孵育5分钟。使用细胞刮轻轻将细胞从培养板上刮下。用P1000移液器轻轻吹打细胞/TDE悬液3–4次，以形成均匀的单细胞悬液。
  8. 用预热的RSM（不含Y-27632）将细胞/TDE悬液按1:10稀释。室温下以173 × g离心5分钟。
  9. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于含10 µM Y-27632的RSM中（每富集孔加1 mL）。
  10. 使用孔径为40 µm的尼龙网细胞滤器过滤细胞。用血细胞计数板计数特定体积内的细胞数量，并计算滤过溶液中的细胞浓度。
  11. 在涂有生长因子减少型ECM的培养板上，以1 × 105 细胞/cm2 的密度接种细胞，每孔加入4 mL含10 µM Y-27632的RSM。
  12. 细胞接种后48小时，更换含10 µM Y-27632的RSM，并此后每3–4天更换一次培养基（例如，每周一和周四）。4–7天后不再添加含10 µM Y-27632的培养基。
  13. 将细胞在37 °C、5% CO2 条件下培养28至35天使其成熟。继续每3–4天更换一次RSM（例如，每周一和周四）。

5. 成熟阶段：RPE 的第1代和第2代传代

注意：体积量针对6孔板的1个孔或T75培养瓶，具体如括号内所示。

  1. 在第0代培养的第28至35天之间，按照制造商的建议，用ECMH包被6孔板（T75培养瓶）。
  2. 分装所需体积的DPBS和RSM，并在37 °C水浴中预热。将TDE恢复至室温。
  3. 吸除孔中废液，每孔用2 mL（10 mL）预热的DPBS洗涤两次。
    注意：不要使用10 µM Y-27632。
  4. 吸除DPBS，每孔加入1 mL（5 mL）TDE。置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育5分钟。孵育后，在倒置显微镜下观察细胞，确认细胞正在收缩并脱离。
  5. 使用合适尺寸的细胞刮棒，轻柔地将细胞从孔底或培养瓶底部刮下。
  6. 使用P1000枪头（10 mL血清移液管）将细胞/TDE悬液轻柔吹打3–4次，以形成均匀的单细胞悬液。
  7. 用RSM以1:10比例稀释细胞悬液。预留2 mL（5 mL）RSM用于冲洗孔/培养瓶，并将冲洗液加入稀释后的细胞悬液中。
    注意：酶消化时间不得超过25分钟。
  8. 在室温下以173 × g离心5分钟。
  9. 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL（5 mL）RSM中。
  10. 使用孔径为40 µm的尼龙网细胞滤器过滤细胞。用血细胞计数板对一定体积的细胞进行计数，并计算滤过液中的细胞浓度。
  11. 在ECMH包被的培养板上，以1 × 105 个细胞/cm2的密度接种细胞，每孔加入4 mL（15 mL）RSM。
  12. 让细胞成熟培养30天。每隔3–4天更换一次RSM。
  13. 在第30天重复上述操作（步骤5.2–5.11），将细胞从第1代传代至第2代。

6. 建立中间细胞库：第2代第3至5天RPE细胞的冷冻保存

注意：在细胞处于亚融合状态（约 50%）且尚未恢复色素时进行冷冻保存。

  1. 根据细胞数量，计算所需含10% DMSO的冻存液的体积，以将细胞重悬至3×10⁶个细胞/mL的浓度6 cells/mL
  2. 按照步骤 5.2 至 5.8 操作。用含 10% DMSO 的冻存液重悬细胞沉淀，使细胞密度为 3 x 106 细胞/mL，并将1 mL细胞悬液转移至1.2 mL冻存管中。
  3. 将冻存管置于可按-1 °C/min速率降温的程序降温盒中，于-80 °C过夜。随后转移至液氮中进行长期保存。
    注意：这些细胞在解冻后为第3代。在表征前将细胞继续培养30天。以1.5 × 10⁵个细胞/平方厘米的密度接种第3代RPE细胞5 每厘米2 解冻后2,4,6,7

结果

该方法可获得均一、有色素且呈立方形的单层视网膜色素上皮（RPE）细胞。 图1 中的时间线对应于 图2 所示的图像。如 图2A 所示，干细胞集落紧密排列，边界清晰，集落之间无成纤维细胞，集落内部无浑浊细胞。 图2B 展示了未完全融合的未成熟RPE细胞的形态。若在此阶段细胞已完全融合，则无法伸出对分化过程至关重要的突起；而严重未融合的细胞则无法形成单层结构及上皮细胞特征性的紧密连接。有关如何优化融合度的详细说明见讨论部分。 图2C 显示了在此分化过程中可能出现的两种最常见非RPE细胞类型的形态：神经样或成纤维样细胞团块。需特别注意的是，这些神经样团块在解剖显微镜下显得尤为浑浊，而成纤维样团块在解剖显微镜下则近乎透明。使用耐乙醇的实验标记笔在组织培养皿上标记这些区域，有助于在复式光学显微镜和解剖显微镜下更易识别它们。 图2D-F 展示了健康、成熟中的RPE培养物所具有的典型亮边、鹅卵石样形态及色素沉着。 图3 为高倍放大图像，显示了全成熟RPE在相差显微镜和明场显微镜下的不同形态。在第3代第30天时，细胞已准备好进行既往文献中描述的各项表征，包括RNA表达、蛋白表达、生长因子分泌以及吞噬功能2,4,6,7。这些表征结果表明，图中所示细胞不仅具有色素沉着和立方形形态，还具备吞噬能力、有丝分裂后状态以及极性结构。

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图 1：添加生长因子及视网膜色素上皮（RPE）成熟的时间线。 从第 0 天到第 14 天，将生长因子添加至 12 孔板中。从细胞富集日起至冻存后 30 天（传代 3 第 30 天），将成熟的 RPE 细胞培养于 6 孔板或 T75 培养瓶中。箭头表示酶法细胞传代。时间线下方的 (A–E) 对应 图 2 中的图像。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：成熟视网膜色素上皮（RPE）的代表性形态与汇合状态。 用于分化的诱导性多能干细胞在传代前的状态（A）。分化第2天未达到汇合的未成熟RPE细胞（B），以及第14天挑取去除非RPE细胞前的状态；非RPE区域（白色箭头所示）呈现为斑块状或不透明的“带状”结构（C）。第30天时第0代、第1代和第3代RPE细胞（D、E 和 F）。比例尺 = 200 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3：第3代、第30天的成熟视网膜色素上皮细胞 相差显微镜下显示立方体形态（A），明场显微镜下显示色素沉着（B）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了如何从多能干细胞分化产生视网膜色素上皮细胞。该方法采用无饲养层、无血清的培养体系，已使用人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞进行了优化。自1998年首次分离人胚胎干细胞以及2007年建立诱导性多能干细胞（iPSC）以来，已开发出多种干细胞培养方法14,15,16,17。这些方法足以获得适用于本分化方案的干细胞克隆。对于正确建立并维持的多能干细胞，本方法目前未发现任何应用上的限制。

最关键的步骤是将干细胞传代至分化第0天（步骤2.5），以及在第14天可能需要进行手动解剖（步骤4.5）。在挑取并去除干细胞集落中的分化细胞时，请参考Kent18中的图像。如图所示，集落之间的成纤维样细胞以及集落内部的不透明细胞均为已分化细胞，应在开始本方案前将其清除18。只有未分化的、紧密聚集且边界清晰的集落才可用于传代并进行分化。

每孔接种的干细胞数量（步骤 2.6.7）较为复杂，原因是干细胞在传代时无法通过吹打形成单细胞悬液，也无法使用血细胞计数板进行准确计数。将 6 孔板中的 1 个孔传代至 12 孔板的 4 个孔时，建议干细胞汇合度约为 80%。不同干细胞系之间（如生长速率差异）可能影响未成熟视网膜色素上皮（RPE）细胞在第 0 至第 4 天达到汇合的速度。无论初始汇合度如何，干细胞最终都会分化为 RPE 细胞，但如果此阶段细胞过于稀疏，则会影响细胞产量。未成熟 RPE 细胞在第 1 天应达到约 40–50% 汇合，在第 4 天应接近 100% 汇合。如果在第 4 天或第 6 天仍未形成汇合的单层细胞，则应在第 0 天提高接种密度重新进行实验。例如，若在第 0 天将 6 孔板的 1 个孔传代至 12 孔板的 4 个孔，而在第 4 天未成熟 RPE 细胞仍未达到 100% 汇合，则可在第 0 天改为 1:3 或 1:2 的传代比例，或在传代前让干细胞生长至更高的汇合度。在比较多个细胞系时，建立一致的接种密度至关重要。

在第14天进行手动解剖步骤仅在培养物中存在非RPE细胞时才有必要（图2C）。自从在方案中加入CHIR99021以来，许多多能干细胞系几乎不需要或完全不需要手动解剖。某些制备样品中神经样斑块出现频率较高，必须清除这些细胞。如果在传代0至传代3期间RPE细胞活力不佳，可重复分化方案，并留出足够时间彻底清除所有非RPE细胞。这种情况并不常见，但在此说明是为了指出，第14天的解剖步骤可根据需要进行优化。

目前存在多种视网膜色素上皮（RPE）分化方案，这些方案在成本、培养方法、效率、定量分析以及功能评估方面各不相同，其中功能评估已有详尽综述2。我们更倾向于采用此处详述的14天分化方法，因其具有高效性、可调节性，并适用于多种细胞系4,7,8。本方案中的冷冻保存步骤具有显著优势，可建立中间细胞库以供后续使用，从而避免实验中批次间的差异。从12孔板中的4个孔开始，可在第0代扩增至6孔板，并在第1代和第2代扩增至T75培养瓶。在第2代第3至5天，细胞仍处于亚融合状态且尚未恢复色素时，可对数千万个细胞进行冷冻保存，随后复苏成熟RPE细胞（定义为第3代第30天），用于检测RNA表达、蛋白表达、生长因子分泌、吞噬功能等。我们还建立了可将RPE细胞扩增至多达13代的实验方案19。

展望未来，该方法将有助于诱导多能干细胞（iPSC）在眼病建模中的应用，以及用于细胞治疗的视网膜色素上皮（RPE）的生成。在iPSC疾病建模方面，本实验室目前正在使用该方案，从同一患者来源的经CRISPR校正和未经校正的细胞系中产生RPE。此外，该方案可适应于合成基质和无异源成分的培养条件，适用于满足细胞治疗所需的良好生产规范要求。

披露

Clegg 博士是再生补片技术有限责任公司（Regenerative Patch Technologies LLC）的联合创始人。

致谢

本工作由加兰视觉倡议基金、加州再生医学研究所（CIRM；资助号 DR1-01444、CL1-00521、TB1-01177、FA1-00616 和 TG2-01151）、佛蒙特社区基金会、布罗基金会以及对抗失明基金会温-冈德转化研究加速计划资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SterilGARD III 层流生物安全柜Baker型号：SG603A-HE，类型：A2，等级：26 英尺 Baker 层流生物安全柜
解剖罩Labconco型号 3970405层流通风式台面装置
体视显微镜NikonSMZ 1500加热载物台
气套式 CO2 培养箱SanyoMCO-17AIC37 °C 和 5% CO2
倒置相差显微镜OlympusIX53
名称公司目录编号备注
培养基组分
DMEM/F12Gibco10565042
N2 添加剂Gibco17502048
B27 添加剂Gibco17504044
NEAAGibco11140050
名称公司目录编号备注
生长因子与试剂
烟酰胺SigmaN0636
重组小鼠 nogginR&D systems1967-NG-025
重组人 DKK-1R&D systems5439-DK-010
重组 IGF-1R&D systems291-G1-200
碱性 FGFPeprotech100-18B
重组人/小鼠/大鼠 Activin APeprotech120-14E
SU5402 FGF 抑制剂Santa Cruz Biotechnologysc-204308
名称公司目录编号备注
基质
Matrigel 基底膜基质，无酚红，无 LDEVCorning356237基于细胞外基质的水凝胶（ECMH）
Matrigel hESC 认证基质，无 LDEVCorning354277生长因子减少型 ECMH
名称公司目录编号备注
其他试剂
1× Versene（EDTA）Gibco15040066
DPBSGibco14190250
1× PBS（无钙，无镁）Gibco10010023
TrypLE（类胰蛋白酶解离酶，TDE）Gibco12563011
X-VIVO 10（RPE 支持培养基）LonzaBW04-743Q
Y-27632Tocris12-541-0（1254）
CryoStor CS10BioLife Solutions210102冷冻保存培养基
1.2 mL 冻存管Corning430487
Mr. Frosty（冷冻容器）Nalgene5100-0001冷冻容器
NormocinInvivogenant-nr-2抗菌试剂
名称公司目录编号备注
其他设备
Pipet-aidDrummond4-000-101
12 孔培养板CorningCLS3516分化过程中使用。
T75 培养瓶Corning430641RPE 成熟过程中使用。
6 孔培养板CorningCLS3513RPE 成熟过程中使用。
细胞刮刀Corning08-771-1A传代过程中使用。
细胞筛Falcon352340传代前细胞计数时使用。

参考文献

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