将CRISPR/Cas9蛋白显微注射入斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）胚胎中进行基因编辑

摘要

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在斑点叉尾鮰胚胎中进行基因编辑的简单高效的显微注射方案。在该方案中，将引导RNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞胚胎的卵黄中。本方案已通过敲除两个与斑点叉尾鮰免疫相关的基因得到验证。

摘要

通道猫鱼的完整基因组 Ictalurus punctatus，已进行测序，为研究斑点叉尾鮰基因功能提供了更多机会。基因敲除技术已被用于研究这些基因的功能 体内成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统是一种用于编辑基因组DNA序列以改变基因功能的强大工具。传统方法通常通过显微注射将CRISPR/Cas9 mRNA导入单细胞胚胎，但在鲶鱼中，该方法可能效率较低且耗时较长。本文详细描述了一种将CRISPR/Cas9蛋白显微注射至斑点叉尾鮰胚胎的操作方案。简言之，收集卵子与精子后进行人工授精，将受精卵转移至含有霍尔特弗雷特溶液的培养皿中。校准注射体积后，将靶向toll/白细胞介素1受体结构域含接头分子（TICAM 1）基因和鼠李糖结合凝集素（RBL）基因的向导RNA/Cas9复合物显微注射至单细胞胚胎的卵黄中。通过DNA测序确认了插入或缺失突变（indels），表明基因敲除成功。这些突变导致的预测蛋白质序列改变包括由提前出现的终止密码子引起的移码突变和蛋白质截短。 关键词：CRISPR/Cas9，显微注射，斑点叉尾鮰，基因编辑，TICAM 1，RBL，基因敲除，indel，卵黄注射，单细胞胚胎

引言

显微注射是一种常用的实验室技术，通过玻璃毛细管将少量物质（如DNA、RNA、蛋白质及其他大分子）注入细胞或胚胎中¹。该技术需使用特殊的设备组合，包括显微注射仪、显微操作器和显微镜²。研究人员已利用该技术通过构建转基因生物、基因敲除和基因治疗等方式对多种生物体进行遗传修饰，旨在研究细胞内组分的动态变化^3,4,5。

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）是美国水产养殖和休闲垂钓活动中最受欢迎的鲶鱼种类。目前对斑点叉尾鮰开展功能基因组学研究的需求日益增加，而斑点叉尾鮰全基因组的测序工作进一步提升了最新基因组编辑工具的应用价值^6,7。了解基因功能不仅能够丰富当前针对鲶鱼的研究，还可能推动更高效的遗传改良项目，从而促进鲶鱼产业的发展。一旦确定了特定目标性状的关键基因，便可利用这些基因通过基因组编辑产生有利等位基因、筛选有利等位基因、抑制有害等位基因、通过转基因技术转移有利等位基因，或结合上述多种策略来实现鲶鱼生产的遗传改良。将不同物种中多个具有商业价值性状的最....

方案

本实验在阿拉巴马州奥本大学E. W. Shell渔业研究中心鱼类遗传学研究组进行。实验所采用的所有实验方案均在实验开始前获得奥本大学机构动物照护与使用委员会（AU-IACUC）的批准。本实验所用仪器与试剂的清单见材料表。以下为斑点叉尾鮰单细胞胚胎的制备及显微注射步骤与操作流程，如图1所示。

1. 亲本选择与产卵

1. 从目标品系或遗传谱系中选择健康的斑点叉尾鮰亲鱼。斑点叉尾鮰的雄鱼和雌鱼应表现出良好的第二性征。
2. 选择头部宽大、肌肉发达且宽于身体其余部分、生殖乳突发育良好的雄鱼。体色深、因领地争斗造成的伤疤和伤口也是性成熟的表现。选择头部窄于身体其余部分、腹部柔软、可触诊且圆润饱满的雌鱼。为确保准确性并避免在初次操作时对鱼类造成应激，应在检查其产卵准备情况前2–3天停止喂食雌鱼。
3. 操作鱼类时应迅速但小心。为减少操作应激，所有需要接触雌鱼的操作均应在产卵袋（32 mm网眼）中进行。
4. 在注射激素诱导排卵前，测量雌鱼的体重。
5. 将装有雌鱼的产卵袋悬挂在流水式水族箱中，保持持续水流和充足的曝气。
6. 无菌操作下，使用14 G针头的植入器装载85 µg/kg的促黄体生成素释放激素类似物（LHRHa）植入剂。注射前用0.9%无菌生理盐水冲洗注射部位（背部肌肉）。以45°角插入植入器并释放植入物。拔出针头后，用浸有70%乙....

结果

为了验证显微注射方案的效率，设计了靶向斑点叉尾鮰toll/白细胞介素1受体结构域适配分子（TICAM1）基因和岩藻糖结合凝集素（RBL）基因的gRNA，并进行了显微注射。

TICAM 1
对克隆PCR产物混合物中单个菌落载体进行的DNA测序揭示了TICAM1基因中诱导产生的插入缺失突变。在分析的24个个体中，突变率为79%。突变示例见于 图4 和 图5. TICAM1基因编码序列中插入缺失突变对斑点叉尾鮰的影响 与野生型序列相比，预测的蛋白质长度和序列差异如图所示 表1。缺失突变导致从预测的蛋白质中移除了几个至多个氨基酸，从而改变下游的阅读框并提前终止翻译（表1).

讨论

本文介绍了一种用于实现斑点叉尾鮰基因敲除的胚胎显微注射详细实验方案。与常见的将试剂注射至单细胞胚胎胚盘（blastodisc）的方法相比，将CRISPR/Cas9蛋白注射到卵黄中的操作更为简便、节省时间，且无需经过 extensive 培训，而前者是目前大多数鱼类基因转移和基因编辑所采用的常规技术^30,42。本实验方案已成功在斑点叉尾鮰的TICAM 1和RBL基因中诱导产生插入缺失突变（indels）。这些可靠且高效的操作步骤为今后开展斑点叉尾鮰的基因敲除研究奠定了基础。该方案可通过CRISPR/Cas9系统进行调整，以靶向斑点叉尾鮰基因组中的其他基因，也可用于将其他基因技术应用于鮰类，例如tol2介导的转基因技术。此外，该方法也值得在其他具有重要经济价值的鮰科鱼类中进行评估，例如蓝鲶（I. furcatus），其卵子对操作的敏感性似乎高于斑点叉尾鮰。然而，若需注射其他gRNA或具有生物活性的物质（如DNA或mRNA），则可能需要对该方案进行优化，以确定最佳实验条件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Reproboost 植入剂	海洋生物技术中心		促黄体生成素释放激素类似物（LHRHa），用于诱导斑点叉尾鮰雌鱼排卵
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		用于亲本鱼类在激素注射和采卵过程中的镇静
酚红	Sigma-Aldrich	P0290	0.5%，无菌过滤
体视显微镜	Olympus	213709	用于显微注射过程中观察卵子
显微注射仪	ASI-Applied Scientific Instrumentation	型号 MPPI-3	用于将注射物质注入胚胎
显微操作器	ASI-Applied Scientific Instrumentation	型号 MM33	用于固定和控制注射针的移动
Eppendorf 微量加样器	Eppendorf	5242956.003	用于将注射溶液装入显微注射针中
垂直拉针仪	David Kopf Instruments	型号 720	用于制备显微注射针
Cas9 蛋白	PNA Bio Inc.	CP01	来自化脓性链球菌（Streptococcus pyrogenes）的重组 Cas9 蛋白
Expand 高保真 PLUS PCR 系统	Roche Diagnostics, USA		用于 PCR 扩增 gRNA 制备所需的 DNA 模板
硼硅酸盐玻璃毛细管	Fisher Scientific		外径（OD）1 mm，用于制作显微注射针
培养皿	VWR	25384-302	用于显微注射过程中盛放胚胎
Crisco	The J.M. Smucker Company		植物起酥油，用于涂抹产卵盘和培养皿
Holtfreter 溶液	自制		59 mM NaCl、0.67 mM KCl、2.4 mM NaHCO3、0.76 mM CaCl2、1.67 mM MgSO4，用于孵化前培养显微注射后的胚胎
盐酸多西环素 USP（一水合物）	Letco Medical	690904	抗生素，加入 Holtfreter 溶液至终浓度 10 ppm，以预防细菌感染