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通过无菌性松动中暴露于CoCrMo颗粒构建和评估小鼠颅骨骨溶解模型

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DOI：

10.3791/56276

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2018年2月17日

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1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本论文描述了一种通过暴露于钴铬钼（CoCrMo）颗粒建立的小鼠颅骨骨溶解模型，该模型是评估磨损颗粒与无菌性松动中各类细胞相互作用的理想动物模型。

摘要

磨损颗粒诱导的骨溶解是关节成形术失败中无菌性松动的主要原因，但其潜在机制尚不明确。由于临床病例中检测该病需要长期随访且发生较为零星，因此评估颗粒诱导骨溶解的发病机制具有挑战性。因此，需要建立理想的动物模型以开展进一步研究。通过暴露于CoCrMo颗粒建立的小鼠颅骨骨溶解模型，是评估颗粒与多种细胞在无菌性松动中相互作用的有效且可靠的工具。在该模型中，首先采用高真空三电极直流法获取CoCrMo颗粒，并将其重悬于磷酸盐缓冲液中，浓度为50 mg/mL。随后，在通过锐性分离颅骨骨膜后，将50 µL上述悬浮液施加于小鼠颅骨中央区域。两周后处死小鼠并采集颅骨标本，通过苏木精-伊红染色和微型计算机断层扫描进行定性和定量评估。该模型的优点包括操作简便、可对骨量丢失进行定量评估、骨溶解发展迅速、适用于转基因或基因敲除模型，以及相对成本较低。然而，该模型无法用于评估颗粒在无菌性松动中所受的机械力及其慢性效应。暴露于CoCrMo颗粒所诱导的小鼠颅骨骨溶解模型，是研究磨损颗粒与多种细胞相互作用的理想工具。 例如巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞在无菌性松动中的作用。

引言

无菌性松动是导致全髋关节置换术（THA）和全膝关节置换术（TKA）失败的最常见原因，常需进行翻修手术1。然而，其潜在机制尚不明确2。由于颗粒诱导的骨溶解发生率较低，因此需要长期随访才能发现；这使得在临床病例中探索其发病机制具有挑战性。因此，针对复杂细胞和组织机制的进一步研究，需要结合磨损颗粒诱导骨溶解的体内实验模型以及与骨稳态相关细胞的体外检测方法3。有效的动物模型对于揭示磨损颗粒对骨量丢失的影响至关重要，可为后续的细胞实验提供依据。

通过暴露于钴铬钼（CoCrMo）颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型，是评估颗粒与无菌性松动中各种细胞相互作用的有效且可靠的方法。在该模型中，CoCrMo颗粒通过诱导巨噬细胞释放炎性细胞因子、激活破骨细胞、抑制成骨细胞增殖以及促进成骨细胞凋亡，导致颅骨骨溶解。

建立此模型仅需两周时间。骨溶解可通过苏木精和伊红（H&E）染色以及显微计算机断层扫描（micro-CT）进行可视化和定量分析2。此外，该模型成本相对较低，且可利用转基因和基因敲除小鼠模型在不同剂量下筛选大量化合物3。

建立和评估该模型的操作步骤十分简便。首先，通过高真空三电极直流法获取CoCrMo颗粒，并将其重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为50 mg/mL。随后，在通过锐性分离剥离颅骨骨膜后，将50 µL上述悬浮液滴加至小鼠颅盖骨中央。两周后处死小鼠，取下颅盖骨样本，并通过苏木精-伊红（H&E）染色和显微CT进行定性和定量分析。

通过暴露于钴铬钼（CoCrMo）颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型，是评估钴铬钼颗粒与巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞及破骨细胞等各类细胞在无菌性松动过程中相互作用的理想工具。

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方案

本文所述所有方法均已获得南京大学实验动物管理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. CoCrMo 颗粒的制备

  1. 通过自制的高真空三电极直流系统获取 CoCrMo 颗粒4。将 CoCrMo 合金置于真空度为 10-3 Pa、氩气与氢气比例为 3:2（v/v）、压力为 0.04 MPa 的环境中，施加 650 A 阴极电流。
  2. 测定 CoCrMo 颗粒的直径。
    1. 将 1 mg CoCrMo 颗粒加入 1.5 mL 无水乙醇中。
    2. 在 28 kHz 频率和 600 W 功率下超声振荡 5 分钟，使 CoCrMo 颗粒在无水乙醇中重新悬浮。
    3. 取一滴（约 20 µL）上述悬浮液滴加于透射电子显微镜（TEM）的载物台上。在 200 kV 加速电压和 0.24 nm 分辨率下拍摄一系列 TEM 图像。
    4. 使用配套软件分析 TEM 显微照片，计算颗粒的平均直径及粒径分布。
  3. 去除内毒素污染
    1. 将 50 g 颗粒在 121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 15 分钟。
    2. 采用定量鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）检测内毒素（<0.25 EU/mL 视为无内毒素）5。
  4. 将颗粒重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 50 mg/mL 的储备溶液6。

2. 颅骨骨溶解模型的构建

  1. 使用戊巴比妥钠（50 mg/kg）对6周龄C57BL/6J小鼠（每组六只）进行麻醉。通过夹捏试验评估麻醉深度，并用生理盐水防止角膜干燥。
  2. 将小鼠置于俯卧位，使用剃毛器去除颅骨部位的毛发，并用含75%乙醇的医用棉球对皮肤进行消毒。
  3. 进行定位时，确定两个点，分别为两眼之间和两耳之间的中点。然后连接上述两点形成一条线，并沿此线用剪刀切开皮肤（图1A）。
  4. 使用手术刀从颅骨上剥离颅骨骨膜（图1B）6。
  5. 使用单纯间断缝合方法在切口两端缝合皮肤。
  6. 在切口中央处穿过缝线但不打结，将缝线两端留出并握住。
  7. 在颅骨顶部中央植入50 µL CoCrMo颗粒悬浮液（50 mg/mL，溶于PBS中）（图1C）2。
  8. 在单纯间断缝合的末端打结固定（图1D）。
  9. 继续饲养小鼠2周。

3. 通过显微CT扫描评估颅骨溶骨性模型

  1. 用二氧化碳处死小鼠。在水平面切断小鼠头部。去除内部的脑组织以及外部的皮肤和毛发。采集颅盖骨用于后续实验。
  2. 用镊子轻轻清除颅盖骨上的所有软组织。将清理后的颅盖骨置于4%多聚甲醛中，4 °C固定24小时。在进行显微CT扫描前，将颅盖骨浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中24小时。
  3. 采用高分辨率显微CT对小鼠颅盖骨进行分析，体素各向同性分辨率为18 µm，X射线能量设置为45 kV和550 mA。
  4. 使用软件对显微CT数据进行三维重建。
  5. 定性与定量分析。
    1. 首先，选择中线缝合线周围的方形区域作为感兴趣区域。
    2. 其次，使用显微CT配套软件测量骨矿物密度（BMD）、骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度/间距（Tb.Sp）以及总孔隙率百分比。
    3. 第三，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较三组之间的各项测量指标。对于事后方差分析，采用Bonferroni方法2。

4. 通过H&E染色评估颅骨骨溶解模型

  1. 在4 °C条件下，使用15%乙二胺四乙酸（EDTA）-PBS对颅骨样本进行脱钙处理。每更换一次脱钙液，持续3周。
  2. 将脱钙后的样本包埋于石蜡中，制成2 cm × 1 cm × 1 cm的组织块，并在颗粒沉积区域切取2 µm厚的切片。
  3. 按照先前描述的方法7对切片进行苏木精-伊红染色。
  4. 利用光学显微镜拍摄整体病理形态的显微图像。

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结果

通过透射电子显微镜（TEM）定量分析，实验室自制的纳米级CoCrMo颗粒直径约为50 nm（标准误差为3.56）（图2）。将小鼠颅盖骨暴露于CoCrMo颗粒后，动物（每组n=6）继续饲养两周。在此两周内，颅盖骨切口完全愈合，缝线可能脱落。任何局部感染或骨不连均可能影响骨量丢失的评估。小鼠安乐死后，采集颅盖骨样本，随后轻柔清除所有软组织，并采用显微CT定量分析骨量丢失情况。从三维重建图像及横断面代表性冠状面图像均可观察到，接受CoCrMo颗粒处理的小鼠出现显著的骨量丢失（图3）。与对照组和假手术组相比，CoCrMo组的骨矿物密度（BMD）、骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均显著降低，而总孔隙率及骨小梁分离度/间距（Tb.Sp）则显著升高（图4）。组间差异采用Student t检验进行评估，以p<0.05为差异具有统计学意义。此外，颅盖骨切片的H...

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讨论

在小鼠中，磨损颗粒诱导骨溶解主要有两种方法：气囊模型和颅骨骨溶解模型。在气囊模型中，首先在皮下建立一个气囊，随后引入磨损颗粒并将其植入骨组织8。该气囊壁可模拟无菌性松动中的骨膜。然而，骨植入物无血管且缺乏生物活性，因此难以评估颗粒与骨组织之间的直接相互作用。相较于气囊模型，颅骨骨溶解模型具有多项优势。首先，磨损颗粒可直接作用于颅骨，从而能够评估磨损颗粒与骨稳态之间的相互作用，包括骨吸收以及成骨细胞、破骨细胞和巨噬细胞的活性9,10。其次，可对骨量丢失进行定量测量，有助于评估多种潜在的遗传学方法和生物制剂在预防骨丢失中的作用11。第三，可在不同遗传背景（包括转基因小鼠和基因敲除小鼠）中评估磨损颗粒与骨丢失之间的关系12,13。第四，该模型可用于在不同剂量下筛选大量化合物。然而，传统颅骨骨溶解模型的成功率相对较低，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（81572111）、江苏省临床医学科技项目基金（BL2012002）、南京市科研项目（201402007）、江苏省自然科学基金（BK20161385）以及中国医师协会专项基金（2015COS0810）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
来自假体的钴铬钼合金Waldemar Link GmbH & 公司GEMINI MK II获取钴铬钼纳米颗粒的原材料
高真空三电极直流装置材料科学学院 &与工程，南京工业大学自行设计的机器
6周龄雄性C57BL/6J小鼠南京大学模式动物研究中心N000013
100% 乙醇南京试剂C0691514023CoCrMo 纳米颗粒透射电子显微镜扫描用溶剂
1.5 ml 微量离心管台州维尔康医疗器械有限公司W603
微量分析天平深圳群龙仪器设备有限公司EX125DZH
超声波振荡器上海玉豪科学仪器有限公司YH-200DH悬浮 CoCrMo 纳米颗粒
透射电子显微镜FEITecnai G20
SimplePCI 软件Compix 公司6.6 版本计算平均直径和粒径分布。
高压灭菌锅邱龙一仪器KYQL-100DS去除内毒素
鲎试剂（LAL）检测法查尔斯河实验室（Charles River）R13025检测内毒素 
15 ml 微型离心管台州苏医医疗B122
磷酸盐缓冲液Boster Biological TechnologyAR0030CoCrMo 纳米颗粒储备液溶剂
戊巴比妥钠SigmaP3761麻醉小鼠
生理盐水萨克勒SR8572EP-15为防止小鼠眼睛干燥
75% 乙醇南京试剂C0691560275消毒
医用棉球Shuitao1278298933消毒
沙弗KemeiKM-3018剃除毛发
剪刀RWD LIFE SCIENCES12005-10切开皮肤
缝合RWD LIFE SCIENCEF34001-01缝合皮肤
持针器RWD LIFE SCIENCEF33001-01缝合皮肤
针RWD LIFE SCIENCER14003-12缝合皮肤
血管钳RWD LIFE SCIENCEF22003-09缝合皮肤
手术刀RWD LIFE SCIENCES31010-01获取颅骨骨片
镊子RWD LIFE SCIENCEF12006-10获取颅骨骨片
100 µL移液管Eppendorf3120000240将颗粒悬浮液包埋于小脑蚓部
100 µL型移液器吸头AXYGENT-200-Y将颗粒悬浮液包埋于钟形罩中
5 ml 微量离心管台州维尔康医疗用品有限公司W621
4% 多聚甲醛ServicebioG1101固定
微型计算机断层扫描 SkyScanSkyScan1176
乙二胺四乙酸ServicebioG1105脱钙
石蜡Servicebio#0001
石蜡切片机LeicaRM2125RTS
载玻片ServicebioG6004
盖玻片Servicebio200
HE染色试剂盒Servicebio#1-5HE染色
光学显微镜尼康E200

参考文献

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

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