用于组织工程应用的可调控形貌三维聚(ε-己内酯)支架的熔融电纺写入制备

摘要

本方案提供了通过熔体静电纺丝在直接书写模式下制备支架的全面指南。我们系统地概述了该过程，并定义了实现目标支架结构的适当参数设置。

摘要

本教程探讨了聚合物熔体静电纺丝书写的基本原理和指导原则，这是一种在生物医学应用中具有巨大潜力的增材制造技术。该技术通过在喷丝头与收集器之间施加电压，形成稳定的黏弹性聚合物射流，实现生物相容性聚合物纤维的直接沉积，从而制备出亚微米至微米尺度范围内结构有序的支架。典型的多孔支架具有较高的比表面积，可为细胞附着和生长提供更多有效的黏附位点。通过精确调控系统参数来控制打印过程，能够实现所打印支架质量的高度可重复性。同时，该技术也为用户提供了灵活的制造平台，可根据特定需求定制支架的形貌结构。为此，本文提供了一套利用熔体静电纺丝书写（MEW）技术、通过有指导性地调节参数（包括流速、电压和收集速度）来获得不同纤维直径的实验方案。此外，我们还展示了如何优化射流，讨论了常见的技术难题，解释了相应的故障排除方法，并展示了多种可打印支架结构。

引言

利用细胞制造三维（3D）生物相容性结构是增材生物制造技术对组织工程（TE）的关键贡献之一，其目标是通过应用定制的生物材料、细胞、生化因子或它们的组合来修复组织。因此，组织工程应用中支架的主要要求包括：可由生物相容性材料制造、具备可调控的形态学特性以促进靶向细胞侵入，以及优化的表面特性以增强细胞相互作用¹。

熔体静电纺丝（MEW）是一种无溶剂的制造技术，结合了增材制造（常称为3D打印）和静电纺丝的原理，用于制备具有高度有序超细纤维形貌的聚合物网状结构²。该技术属于直接书写法，能够根据预设的程序代码（称为G代码）精确沉积纤维³。目前，熔体静电纺丝结构通常采用平板^4,5或芯轴^6,7收集器，分别用于制备多孔平板状和管状支架。

由于能够直接打印医用级聚合物（如聚ε-己内酯（PCL）），该技术为组织工程（TE）和再生医学（RM）领域带来了显著优势，PCL具有优异的生物相容性⁸。其他优势还包括可通过高度有序地沉积纤维，定制孔隙的尺寸和分布，从而制造出具有高比表面积的支架。在进行熔体电纺丝（MEW）之前，需先对聚合物加热⁹。一旦聚合物处于熔融状态，施加的气压会迫使它从连接至高压电源的金属喷丝头中挤出。在接地收集器的作用下，液滴所带静电引力与表面张力之间的力平衡，导致形成泰勒锥，随后射流被喷射而出¹⁰。

本方案所用自制熔体电纺（MEW）装置的图像及示意图见图1。图中还展示了使用绝缘胶带避免加热元件与包围喷丝头的带电黄铜部件之间发生电击穿的原理。绝缘不足会导致所用硬件内部损坏。

根据三个系统参数（温度、收集速度和气压）的调节情况，熔体电纺丝（MEW）能够制备出不同直径的纤维，具体解释见讨论部分。然而在大多数情况下，在获得稳定的射流喷射之前，需要对射流进行精细调节和优化。对带电射流运动过程的可视化观察是验证该工艺一致性和均匀性的有效方法。在理想情况下，射流的飞行路径呈现出由系统参数控制的力平衡所决定的悬链线形状¹¹。此外，支架的微观和宏观结构取决于聚合物射流的飞行路径¹²。不同偏转行为及其优化措施的详细对照表见讨论部分。

在本研究中，我们介绍了一种利用熔体电写技术（MEW）制备高度可控纤维支架的实验方案。本工作中采用了医用级PCL（分子量95-140 kg/mol），因为医用级PCL相较于工业级具有更高的纯度，且其机械性能和加工性能非常适合MEW技术。PCL具有宽广的熔融加工范围，这源于其较低的熔点（60 °C）和高热稳定性。此外，PCL是一种降解速率较慢的生物可降解聚合物，使其成为多种组织工程应用的理想材料¹³。

本研究中，温度和收集距离将保持恒定（注射器和喷丝头温度分别为 65 °C 和 82 °C，收集距离为 12 mm）；而施加电压、收集速度和气压将进行调整，以制备具有目标直径的纤维。结果部分提供了使用 MEW 支架的已发表研究的详细列表，展示了其在组织工程（TE）和再生医学（RM）领域的不同应用（表 1）。

方案

1. 材料准备

1. 使用漏斗将2 g PCL填充至一个3 mL塑料注射器中，并将活塞插入开口端。
2. 将注射器置于预热至65 °C的烘箱中加热8 h。针头朝上放置，以便气泡聚集在开口附近。
3. 用细物推动活塞，排出熔融材料中截留的空气。
4. 使其冷却至室温，当聚合物在10分钟后不再透明时即完成冷却。
5. 将预装PCL的注射器在干燥、避光的环境中室温保存，直至使用。

2. 硬件与软件设置

1. 将一个23G平头针（喷丝头）连接到注射器上，并在另一端安装筒管适配器，以将注射器连接至气压系统。
2. 将注射器放入打印头中，并向下按压，直至喷丝头尖端从打印头底侧的黄铜部分突出1 mm。
3. 在载物台上安装收集器，并使用70%（体积/体积）乙醇清洁收集器表面以及打印头，以去除灰尘或残留的聚合物。
4. 通过在喷丝头与收集器之间放置一个12 mm高的物体来设定工作距离，并降低打印头，直到喷丝头尖端刚好接触该物体。
5. 调节电控箱上的温度调节器，分别将喷丝头区域和注射器的温度设为82 °C和65 °C，并开启电源以熔化PCL。
6. 至少等待10分钟，直至聚合物完全熔融，然后通过将压力调节器设为1.8 bar来启动气压。
7. 准备G代码，以定义支架的尺寸和形状、丝线间距、层数以及收集过程的收集速度。
   注意：在讨论章节中提供了用于制备平面和管状支架的详细模板（表2）。
8. 手动仔细检查所有接地线是否已牢固连接至外壳和墙壁插座。
9. 在计算机上启动软件（例如，MACH 3），并上传已准备好的G代码。

3. 支架制备

1. 关闭外壳的前门，该操作将接通安全联锁并触发向喷丝头施加高压。
   注意：一旦打开前门（例如打印完成或发生紧急情况时），高压将自动切断，从而可安全取出支架。
2. 以 0.2 kV 为步长逐步增加电压，直至形成泰勒锥，并有纤维射流向收集板方向喷出（参见 图1D 中的泰勒锥示例）。
3. 让聚合物熔体在静止的收集板上挤出，保持喷射流静止状态 5 分钟以使其稳定。在开始新的打印前，清除堆积的材料。
4. 使用键盘上的光标键将打印头移动至 G 代码起始位置的上方。
5. 在计算机软件中启动 G 代码程序。

4. 纤维直径调节

1. 保持工作距离（12 mm）以及温度调节器（喷丝头区域为82 °C，注射器为65 °C）处于恒定水平，具体操作如步骤2.4和2.5所述。
   注意：不同直径调整的总结如下所示 表3.
2. 打印直径较小的纤维（3–10 µm）。将气压降低至0.8 bar，调节施加电压至8 kV，并将收集器速度设置为1700 mm/min。
3. 打印中等直径的纤维 （10-20 µm）。将气压调节至1.5 bar，电压设为11 kV，收集速度降低至1200 mm/min。
4. 打印直径较大的纤维（20–30 µm）。将气压提高至2.6 bar，调节施加电压至12 kV，并将收集速度降低至700 mm/min。

5. 喷流优化

1. 从培养箱外部用强光LED灯照射液流，以提高可见度。
2. 观察纤维行为1分钟，并逐步微调系统参数以优化工艺， 即 施加电压为0.1 kV，收集速度为100 mm/min，气压为0.1 bar。
   注意：此处提供了一个摘要 表4.
3. 通过降低气压、提高速度并最小化电压，使纤维的飞行轨迹呈现稳定的悬链线形状并持续超过3分钟，从而稳定其周期性偏转行为。
4. 通过增加电压、降低气压以及减缓收集器速度，校正滞后射流的飞行路径。持续采取上述措施，直至纤维的飞行路径恢复成悬链线形状。
5. 通过降低施加电压、提高收集器速度以及增大气压，避免纤维垂直向收集器方向运动，直至射流轨迹再次呈现悬链线形状。

6. 支架收集

1. 打印完成后打开门，使用光标将收集板移向门口，以便更方便地操作。
2. 用70%（体积/体积）乙醇混合液喷洒支架，等待10秒，直至其明显从收集板上脱离。
3. 用镊子夹住支架的一边，将其从 enclosure 中提起，完成收集。

7. 故障排除

1. 如果观察到喷丝头之间出现火花或听到爆裂声，应立即降低施加的电压或打开设备门。
2. 从密闭腔室内清除所有危险材料和液体（如70%乙醇（vol/vol）），因为一旦发生火花，可能引发火灾。
3. 相应地编程G代码，使喷丝头在所有层打印完成后移离支架打印区域，以避免材料在喷丝头最终停止的位置上方堆积。
4. 在放大镜下检查喷丝头，确认其无任何损伤，因为损伤会显著影响泰勒锥的均匀性。

结果

在MEW中通常采用两种不同的收集方法，即平面收集和心轴收集。所得到的结构取决于由软件执行的G代码（表2）的编程。

平面收集
采用平面收集器是最常见的方法，可实现材料按照预设的G代码直接沉积。文献中广泛报道了不同尺寸的0/90和0/60结构。此外，当使用图案化的平面收集器而非光滑收集器时，直接将熔融纤维沉积到收集器上的能力也有助于生成随机但有序的结构¹⁴。

管状结构
在组织工程应用中，对具有管状结构的支架制造需求很大。通过使用圆柱形收丝装置，微挤出书写（MEW）是一种实现具有定制孔隙率的管状支架的有效方法。该装置围绕自身轴线旋转，同时沿芯模轴向平移。通过精细调节G代码，可...

讨论

将增材制造（AM）应用于医疗领域以寻找创新解决方案，为21世纪的医疗挑战提供了新的范式^st 世纪。所谓的领域 "生物制造" 呈上升趋势，制造技术的创新使得为组织工程（TE）应用生产高度复杂的结构成为可能。聚合物熔体在直接书写模式下的静电纺丝（此处为MEW）被视为最有望满足组织工程领域需求的制造技术之一，该领域需要微米至纳米尺度的生物相容性材料有序结构。²⁷.

本教程旨在通过解释微挤出书写（MEW）的物理原理并演示使用该技术制造可重复支架的具体操作步骤，来建立对MEW操作的基本认识。

由于微尺度电纺丝（MEW）的基本原理与传统的增材制造技术相似，即以逐层方式精确沉积挤出材料，因此控制喷头与收集器之间的相对运动至关重要。根据我们的经验，建议使用喷头固定不动、而由平台（X轴和Y轴）带动收集器运动的MEW设备。固定的喷头可保持稳定位置，不会产生作用于泰勒锥的运动学力，从而避免在泰勒锥形成过程中可能引起的扰动。此外，与高压电源和加热器相连的线路也不会因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
塑料注射器	Nordson 澳大利亚有限公司	7012072	EFD 桶形针筒 3 mL 透明 50 个装
医用级聚（εε-己内酯（mPCL）	荷兰科碧恩普拉克公司	PURASORB PC12
23 号针头	Nordson 澳大利亚有限公司	7018302	#23GP .013 X .25 橙色 50 件装
活塞杆	Nordson 澳大利亚有限公司	7012166	3 mL 带擦拭片白色活塞，50 个/包
压力适配器	Nordson Australia Pty Ltd	7012059	3 mL 蓝色适配器，O型，1.8 M
铝制集流体	Action Aluminium，澳大利亚	SHP2	5005号表 H34
丙烯酸玻璃	Mulford Plastics Pty Ltd	ACC6-13094
Mach 3 软件	艺术软体		网上购买
安全开关联锁	RS Components 有限公司	12621330
高压发生器	EMCO 高压公司	DX250R
温度控制器	WATLOW	PM9R1FJ
X和Y轴定位载玻片	VELMEX 公司	XN-10-0020-M011