单核细胞在周围动脉疾病背景下对动脉生成具有重要的介导作用。本方案利用基底膜样基质和活体显微技术，在股动脉结扎小鼠模型中研究单核细胞注射后的单核细胞归巢及肿瘤相关血管生成。
本文内容
摘要
摘要
外周动脉疾病和缺血性心脏病的治疗目标是增加因血流动力学狭窄导致的缺血区域的血流量。在某些特定病例中，血管手术是一种可行的选择；但对于那些无手术指征的患者，例如进展至静息痛、严重肢体缺血或对日常生活与工作造成显著影响的患者，可采用的疾病缓解手段十分有限。通过单核细胞促进侧支循环形成以增强灌注的细胞治疗，是目前为数不多的非侵入性治疗选择之一。
本课题组采用小鼠后肢缺血模型，研究单核细胞移植后的动脉新生过程。此前，我们已证实通过移植经破伤风刺激的同基因型单核细胞可改善后肢灌注。除对侧支血管形成的影响外，该疗法也可能影响肿瘤生长。为探究这些效应，我们在小鼠股动脉闭塞后，通过向小鼠侧 flank 注射 Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤的细胞外基质，构建一种类似基底膜的基质小鼠模型。
在人工肿瘤研究之后，我们采用活体显微镜技术进行研究 体内 肿瘤血管生成及单核细胞向侧支动脉的归巢。既往研究已描述了动物模型的组织学检查，这需要后续进行分析以 死后 伪影。我们的方法能够实时可视化单核细胞向侧支循环区域的归巢过程，操作简便，并可用于研究动脉生成和肿瘤血管生成过程 体内.
引言
心血管疾病，包括冠心病和外周动脉疾病，是全球最主要的死亡原因1。细胞治疗是一种有前景的心血管疾病治疗方法，尤其适用于无法接受外科手术干预的患者。目前已有多种利用细胞或其分泌物质作为治疗手段的策略2,3，其总体目标是改善灌注并维持缺血和低灌注组织的功能。其中一种实现该目标的方法是促进动脉生成，从而增强侧支动脉的发育。单核细胞是与侧支形成密切相关的重要细胞类型。本研究团队长期致力于研究单核细胞在炎症区域的作用4,5，特别是采用后肢缺血模型来诱导缺血及随后的炎症反应6。单核细胞会趋向性迁移至炎症部位，并引发复杂的系统性反应，进而促进侧支血管的形成7。
利用活体显微镜技术，我们可以研究这些细胞的行为 体内 并观察注射的单核细胞向炎症区域的归巢。大多数先前的研究仅描述了 死后 分析方法存在诸多缺点，包括可能引入组织学伪影以及制备过程需要大量实验动物。通过我们的方法，可利用活体成像在多个时间点上对免疫学过程及侧支循环形成进行研究。
除了在缺血区域促进侧支动脉的形成外，单核细胞还影响肿瘤的生长。为了研究这些过程，我们注射一种从富含细胞外基质蛋白的Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中提取的类似基底膜的基质8，并利用活体显微镜进行分析。该基质可用于筛选促进内皮细胞网络形成的分子或通过抑制血管生成来评估抗癌疗法；在此情况下，我们将评估单核细胞在细胞治疗中的肿瘤血管生成潜能9,10,11。
本实验方案旨在展示一种简便高效的方法，用于研究由缺血引起的免疫学过程 体内 模型。与组织学处理相比，我们能够生成更为真实的测试环境 死后 肌肉组织
方案
本研究经德国萨克森-安哈尔特州哈勒地区行政管理局批准，依据德国动物保护法第8条进行（2016年5月18日颁布的德国动物保护法第8条第1款——联邦法律公报 I S. 1206, 1313，以及2013年8月13日颁布的《动物保护饲养条例》第31条）。
注意：本实验使用8至12周龄的雄性BALB/c小鼠，以及来自献血者的单核细胞，通过活体显微镜观察单核细胞。
1. 细胞制备
注意：单核细胞的分离步骤，请参见我们此前在 JoVE 上发表的视频教程：“小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射”（Wagner et al.4）
注意：处理细胞时，所有步骤必须保持无菌，以避免污染。
- 使用3,3'-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐对细胞进行染色
- 将细胞重悬于无血清培养基中，细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL。
注意：必须使用无血清培养基才能实现有效染色，因为疏水性染料会与血清中的疏水成分结合，从而降低染色效率。 - 向 1 mL 细胞悬液中加入 5 µL 浓度为 1 mM 的二甲基甲酰胺溶解的3,3'-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐，并轻轻重悬细胞。
- 将细胞悬液在 37 °C 下孵育 20 分钟。
- 在 37 °C、500 × g 条件下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，并用 37 °C 预热的含胎牛血清的培养基重悬细胞。
- 重复步骤 1.1.4 和 1.1.5 两次。
- 使用以下公式计算细胞浓度：
- 用 150 µL 无菌 0.9% NaCl 溶液重悬细胞。
- 将细胞注入尾静脉。
- 将细胞重悬于无血清培养基中，细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL。
2. 麻醉
- 吸入麻醉
- 在化学安全通风橱内的密闭容器中，使用挥发器将异氟烷以5%的浓度汽化。
- 小心操作小鼠，并将其放入容器中。
- 待小鼠停止活动后，抓住其后颈部皮肤进行操作。
- 腹腔麻醉
注意：使用第2.1步所述的异氟烷麻醉方法进行腹腔注射。由于异氟烷麻醉起效快、作用时间短，因此更便于操作小鼠并完成腹腔麻醉注射。- 使用2.4 mL氯胺酮（10%）、0.8 mL赛拉嗪（2%）和6.8 mL氯化钠溶液（0.9%）配制用于腹腔注射的麻醉液。
- 给药前需称量动物体重。
注意：麻醉剂剂量计算公式为：
- 使用带有30 G针头的1 mL胰岛素注射器，将药液注入小鼠左下腹部。
- 将小鼠放回笼中，等待麻醉作用生效。
注意：若注射成功，通常在5分钟内出现麻醉效应。合适的麻醉深度表现为眼睑反射消失、脚趾夹捏无反应，且呼吸节律规律、平稳。
3. 基底膜样基质的植入
注意：本实验组采用该方法研究单核细胞注射后肿瘤的血管生成。根据具体实验需求，可将生长因子添加至基底膜样基质中。在小鼠 flank 部位注射肿瘤前，我们先进行股动脉结扎。注射时基质温度必须保持在 4 °C，在此温度下基质呈液态；当温度升至体温（37 °C）时，基质会凝固成凝胶。为了更清晰地观察皮下基质栓，建议在注射部位剃除小鼠皮肤上的毛发。
注意：可选：在无菌条件下，向基底膜样基质中加入100 ng碱性成纤维细胞生长因子、300 ng血管内皮生长因子和26 I.U.肝素。
- 将1 mL基质装入30 G胰岛素注射器中，置于冰上保存备用。
- 将动物平放在桌面上，捏住小鼠侧腹部注射部位附近的皮肤。
- 皮下注射500 µL类基底膜基质。
注意：出于操作上的考虑，需将类基底膜基质集中注射于一个位置，以避免在皮下扩散。在实验结束处死小鼠后，将人工肿瘤从组织中分离时会更加容易。
4. 尾静脉注射
注意：在正式实验前，应先在测试动物身上使用氯化钠溶液练习尾静脉注射。如果单核细胞无法充分注入尾静脉，则不会对侧支形成产生全身性作用。在本方案中，我们注射了250万个单核细胞。注射体积应尽量不超过每克体重5 µL。
- 使用步骤 1.1.8 中制备的含有 250 万个单核细胞的单核细胞悬液。
- 使用 30 G 针头和 1 mL 胰岛素注射器进行注射。
- 小心操作小鼠，将其固定在固定器中，确保小鼠未受伤害且有充足的呼吸空间。
- 将固定器放置在加热垫上，使小鼠尾巴能够接触加热板表面。
- 辨认位于尾巴侧面的尾静脉。
- 将尾巴旋转 90°，使尾静脉位于尾巴上方。
- 在注射单核细胞前，对注射部位进行消毒。
- 尝试以较小的角度进针，并使针头斜面朝上注射单核细胞悬液。
注意：若出现水疱，应立即停止注射，因为这是注射失败的迹象。需在更靠近近端的位置重新尝试操作。 - 在注射部位轻压约 60 秒，以止住出血。
- 观察动物 30 分钟，监测是否存在全身性不良反应，并在小鼠完全恢复后将其放回笼中。
5. 活体显微成像
- 准备
- 将麻醉后的小鼠置于加热垫（37 °C）上以维持恒定体温，并用胶带固定四肢。
- 对用于显微成像的腿部或侧腹部位皮肤进行消毒。
- 剃除目标区域的毛发，以便于操作并避免毛发干扰。
- 使用无菌手术刀和精细镊子切除0.5 x 0.5 cm的方形皮肤组织。
注意：保持目标区域湿润至关重要；否则，图像质量和组织状态将受到影响。可使用NaCl溶液润湿该区域。 - 将腿部置于两个可调节的支架之间，并在支架上方放置盖玻片。
- 确保组织保持湿润并与玻璃接触良好。
- 向静脉系统注射50 µL罗丹明葡聚糖（经眼后静脉窦注射），以增强血管的可见性。
- 开始显微成像，并根据需要调整腿部位置。
- 活体显微成像设置
- 打开显微镜、计算机、电子接口和激光器。
- 开启培养室和/或加热载物台（板/垫）的加热装置，并将温度设定为37 °C。
- 启动图像采集软件。若显微镜配备共振扫描器，请选择此快速扫描模式。
- 等待温度达到稳定水平（35 - 37 °C）。
注意：稳定的温度至关重要，原因如下：(a) 麻醉状态下的小鼠无法自主调节体温；(b) 避免或至少最小化焦平面漂移。达到稳定状态可能需要1小时至数小时，具体时间取决于周围环境条件（例如，空调系统以及房间内热源数量，包括人员）。若使用浸没式物镜，镜头与盖玻片（或组织）之间的接触区域通常是不稳定性的来源。使用物镜加热器对镜头加热可能有所帮助；或者，强烈推荐使用配备自动对焦系统的显微镜。 - 选择满足实验分辨率要求的高数值孔径放大物镜（参见本节末尾的说明）。
- 在将实验动物放置于载物台上之前，优化显微镜的增益、通道设置、扫描速度、像素分辨率、深度体积、步进大小和平均次数等参数。
- 采用双向扫描以缩短采集时间。
- 在显微镜达到稳定条件且通过假体测试完成参数设置后，将麻醉后的小鼠放置于预热的显微镜载物台上。
- 使用明场照明将目标区域（位于类似基底膜的基质内）调至焦点，并使用适当的荧光滤光片设置，通过紫外光短暂检查毛细血管。
- 切换至扫描模式；以低分辨率（256 x 256）开始扫描，并逐步提高增益和激光功率，直至显示器上观察到信号。
- 对目标结构进行聚焦，逐步放大直至所有细节清晰可见。
- 在轴向方向上定义“起始”和“终止”位置。
- 停止扫描。
- 设定步进大小（例如，0.5 µm）和焦平面数量（例如，10 - 20）。
- 切换至最终像素分辨率（512 x 512 或 1,024 x 1,024），根据亚细胞结构或细胞的运动速度选择最合适的扫描速度（扫描频率）。推荐使用双向扫描以加快图像堆栈的采集速度。
注意：选择能够提供足够图像质量的最高速度扫描模式。典型的点扫描器速度范围为400 Hz至1.4 kHz，共振扫描器可额外提供8 kHz或12 kHz的扫描速度。通过减少y方向的扫描线数，可进一步提高扫描速率（典型分辨率为512 x 512、512 x 256或512 x 200）。根据信噪比情况，可尝试使用2至4次线平均以改善图像质量。通常情况下，使用8 kHz共振扫描器，在双向模式下以512 x 200分辨率且无平均时，每帧采集时间为18 ms；而采用512 x 200分辨率并进行4次平均时，每帧采集时间则延长至56 ms。
结果
利用活体显微技术观察单核细胞诱导的肿瘤生长及侧支血管形成，有助于揭示肿瘤血管生成和动脉生成分子机制的新层面。细胞的制备与注射必须严格按照本方案的步骤进行，操作差异可能导致各次实验之间出现变异。单核细胞必须注射至静脉系统（图1），以维持全身性效应，并避免在动脉系统注射时可能发生的栓塞。
如果使用基底膜样基质，缓慢注射以避免分散将有助于后续组织学检查时取出基质塞（图2， 图3）。处死小鼠后，从其体侧取出基底膜样基质塞。在基底膜样基质塞内，可通过在不同实验条件下计数毛细血管来评估血管化程度（图4，图5）。
成功实验的另一个条件是显微镜的设置，这取决于软件、硬件以及动物样本的制备（图6）。如果需要识别亚细胞结构（<2 µm），建议使用配备双光子激发装置和水浸物镜（20X 或 25X，数值孔径 1.0）的直立显微镜，且物镜应具有较长的工作距离（>2 mm）。由于高数值孔径的水浸物镜对折射率变化极为敏感，必须通过调节物镜上的校正环来获得最佳的图像分辨率和亮度。然而，由于操作空间有限，手动调节非常困难。因此，显微镜制造商提供了配备电动校正环的昂贵物镜以解决此问题。
如果需要达到细胞分辨率（5 - 10 µm) 即可，建议使用数值孔径为0.4或更高、工作距离较长的10倍干镜（>建议使用2 mm。在此情况下，可选择正置或倒置显微镜平台。使用10X干镜（数值孔径0.4）在较高放大倍数下进行活细胞成像>3）要容易得多且成本更低，因为传统的共聚焦激光扫描显微镜（即，单光子激发）可用于获取具有足够分辨率的图像序列。如果图像采集所需时间较长，血管内罗丹明葡聚糖的量会减少。为了更清晰地显示血管，必须重复注射荧光染料（图7).
最有效的方法是尝试不同的调整参数，以确定可能达到的最佳图像质量。使用针对细胞或基底膜样基质的阳性探针（无需移植）有助于获得最佳设置。我们可以通过活体显微成像在血流和肌肉组织中检测到标记的单核细胞（图8，图9）。组织切片的组织学检查进一步验证了我们的发现（图10）。
图1：向尾静脉注射250万个单核细胞。 静脉位于尾部的侧面，动脉则位于背侧和腹侧。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：基底膜样基质的注射。 操作小鼠皮肤，并将基底膜样基质注射至其侧腹部。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：从小鼠 flank 部位取出的基质塞（参见步骤3.5）。通过尾静脉移植单核细胞后第五天，已形成整合的血管。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：基底膜样基质内血管化的比较（
± 标准差，每组 n = 3）。 在无生长因子添加的基底膜样基质栓（红色柱）与添加生长因子的基底膜样基质栓中的血管形成情况进行对比。在基底膜样基质中添加生长因子可促进血管生长。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 基底膜样基质栓中的血管。 血管内血流（红色）（箭头所示）以及单核细胞归巢（绿色）在基底膜样基质栓中的可视化图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：准备进行图像采集的小鼠。 小鼠的爪子用胶带固定，盖玻片置于两个可调节的支架上方。使用手术刀切除感兴趣区域。用 NaCl 溶液润湿该区域，以确保图像质量和组织状态不受影响。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 7： 血管可见度降低。 在血管（纵切面，*）旁的基底膜样基质中，可见被3,3'-二辛基氧羰花青高氯酸盐染色的单核细胞（箭头）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图8: 单核细胞冲入血管。 体内 高氯酸3,3'-二辛十八碳氧羰花青染色并移植的单核细胞（绿色，箭头）在侧支动脉（*）内的可视化 请点击此处以查看此图的放大版本。
图9： 活体显微成像。 用3,3'-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐染色的单核细胞（箭头）位于呈典型螺旋状结构（*）的侧支血管内，血管内皮用罗丹明葡聚糖染色。 请点击此处查看该图的放大版本。
图10： 大腿肌肉组织的免疫组织化学染色。 血管（红色：α-平滑肌肌动蛋白，*），巨噬细胞（绿色：3,3'-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐，箭头所示），细胞核（蓝色）。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文所述方法揭示了侧支动脉的发育过程、单核细胞在这些血管中的行为以及动脉生成的过程。该方案的操作步骤易于掌握，也可应用于其他科学领域。尽管具有这些优势，但仍存在一些缺点。例如，执行所述技术需要显微设备。为单次实验购置设备是不可持续的，因此与其它机构合作共享设备至关重要。
该方案还存在其他一些困难，但通过练习可以避免。初学者在显微镜下固定小鼠时可能会遇到问题，这种情况会影响成像质量。另一个关键环节是尾静脉注射。单核细胞只有在正确注射的情况下才能在静脉中被观察到。因此，建议在固定小鼠前先练习注射操作。
单核细胞的分离同样至关重要。可采用多种方案从不同物种中分离单核细胞，这些方案往往导致不同的实验结果和细胞得率12,13,14。操作过程中必须在无菌条件下进行，以避免污染。应通过小心移液和保持恒定温度来防止细胞损伤。
尽管存在这些缺点，该方法仍具有实用性和操作简便性，能够帮助研究人员揭示肿瘤血管生成及外周动脉疾病背后的基本机制。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由 ELSE-Kröner-Stiftung 和 德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）SFB 854（Sonderforschungsbereich，协同研究中心）。特别感谢德国马格德堡奥托·冯·格里克大学马格德堡分校视听媒体中心（Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg）的 Hans-Holger Gärtner 提供的技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 胎牛血清（FCS） | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 1% 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 1 mL Omnifix-F 胰岛素注射器 | B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根 | ||
| 50 ml 注射器 | 德国巴特洪堡，费森尤斯卡比股份公司 | Injectomat-注射器 50 ml 带套管 | |
| 6孔超低吸附培养板 | 康宁公司，纽约州，美国 | ||
| 8至12周龄雄性C57BL/6、BalbC小鼠 | 查尔斯河实验室，苏尔茨费尔德，德国 | ||
| 胶带 | TESA SE，德国汉堡 | ||
| 采集软件 | Leica，德国韦茨拉尔 | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF)；版本：2.7.3.9723 | |
| 导管 | B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根 | 29G，30G | |
| 细胞培养皿 | 德国弗里肯豪森，Greiner Bio-One GmbH | ||
| 细胞培养基 | 由本团队使用单一组分制备 | Medium199，10% 胎牛血清，1% 抗生素（青霉素/链霉素） | |
| 离心 | Beckman Coulter GmbH，克雷菲尔德，德国 | Allegra X-15R 离心机 | |
| 脱毛膏 | Veet，曼海姆，德国 | ||
| DiO | 美国俄勒冈州尤金市英吉特公司 | ||
| 消毒剂 | Schülke&Mayr GmbH，德国诺德施泰特 | ||
| 一次性手术刀10号 | 日本大阪羽剃须刀有限公司 | ||
| EDTA | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 锥形瓶 | GVB，德国黑尔佐根拉特 | ||
| 70% 乙醇 | Otto Fischar GmbH und Co KG，萨尔布吕肯ü肯恩，德国 | ||
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 精细镊子 | 鲁比斯，斯塔比奥，瑞士 | ||
| 荧光染料/Rhodamine衍生物 | Thermo Fischer Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 目录编号：D-1819 | |
| 手套 | Rösner-Matby Meditrade GmbH，德国基弗斯费尔登 | ||
| 加热垫 | Labotect GmbH, Gö德国哥廷根 | 加热板 062 | |
| 人巨噬细胞集落刺激因子 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | SRP3110 | |
| 人源白细胞过滤器 | 血液保存 | ||
| 培养箱 | Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特嫩多夫 | ||
| 异氟烷 | Baxter Deutschland GmbH，Unterschleißheim，德国ß德国海姆 | ||
| 氯胺酮（10%） | Ketavet，Pfizer Deutschland GmbH，柏林，德国 | ||
| 白细胞分离管（带滤芯的管子） | 德国弗里肯豪森，Bio one有限公司 | ||
| 光学显微镜 | 卡尔·蔡司半导体制造技术有限公司，奥伯科亨，德国 | Axiovert 40 C | |
| 淋巴细胞分离液 LSM1077 | 通用电气医疗集团，奥地利帕兴 | ||
| Matrigel | 美国新泽西州富兰克林莱克，贝克顿-迪金森公司 | ||
| M199 培养基 | PAA Laboratories GmbH，奥地利帕兴 | ||
| 微生物操作台 | Thermo Electron，LED GmbH，德国兰根塞尔博德 | Hera 安全 | |
| 显微镜载玻片 | 卡尔罗特有限公司，卡尔斯鲁厄 | 产品编号 1879 | |
| 配备培养箱和加热装置的显微镜支架 | Leica DMI 6000，Pecon，德国 | ||
| 单核细胞洗涤缓冲液 | 由本课题组利用单一组分制备而成 | PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA | |
| 小鼠固定器 | 各种 | ||
| 多光子显微镜 | 徕卡，德国韦茨拉尔 | Leica SP5 共聚焦显微镜，Cameleon，Coherent | |
| 氯化钠 (0.9%) | 德国柏林柏林化学股份公司 | ||
| 血细胞计数板 | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö德国尼格斯霍芬 | ||
| 目标 | 徕卡，德国韦茨拉尔 | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | 德国达姆施塔特 Life technologies GmbH | pH 7.4，无菌 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| Percoll | 由本课题组利用单一组分制备而成 | 90% Percoll，10% 1.5 M NaCl ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll 溶液 | GE Healthcare，生物科学部，乌普萨拉，瑞典 | ||
| 移液器 | Eppendorf AG，德国汉堡 | 10µ升/100公里µL/200µ升/1000µL | |
| 移液器，血清学 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | Cellstar 2 ml、5 ml、10 ml | |
| 移液头 | Eppendorf AG，德国汉堡 | ||
| Pipetus | Eppendorf AG，德国汉堡 | ||
| 聚苯乙烯管 | Cellstar，Greiner Bio-One GmbH，德国弗里克豪森 | ||
| 剪刀 | Word Precision Instruments, Inc.，美国萨拉索塔 | ||
| 量程 | Mettler PM4800 Delta Range，Mettler-Toledo GmbH，Gieß德国 | ||
| 负压吸引装置 | Integra bioscience，德国费恩瓦尔德 | Vacusafe comfort | |
| 手术剪 | Word Precision Instruments, Inc.，美国萨拉索塔 | ||
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 带盖试管 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | 15 ml，50 ml Cellstar | |
| 赛拉嗪（2%） | Ceva Tiergesundheit GmbH, Dü德国杜塞尔多夫 |
参考文献
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