单核细胞在周围动脉疾病背景下对动脉生成具有重要的介导作用。本方案利用基底膜样基质和活体显微技术，在股动脉结扎小鼠模型中研究单核细胞注射后的单核细胞归巢及肿瘤相关血管生成。
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本文内容
摘要
摘要
外周动脉疾病和缺血性心脏病的治疗目标是增加因血流动力学狭窄导致的缺血区域的血流量。在某些特定病例中，血管手术是一种可行的选择；但对于那些无手术指征的患者，例如进展至静息痛、严重肢体缺血或对日常生活与工作造成显著影响的患者，可采用的疾病缓解手段十分有限。通过单核细胞促进侧支循环形成以增强灌注的细胞治疗，是目前为数不多的非侵入性治疗选择之一。
本课题组采用小鼠后肢缺血模型，研究单核细胞移植后的动脉新生过程。此前，我们已证实通过移植经破伤风刺激的同基因型单核细胞可改善后肢灌注。除对侧支血管形成的影响外，该疗法也可能影响肿瘤生长。为探究这些效应，我们在小鼠股动脉闭塞后，通过向小鼠侧 flank 注射 Engelbreth-Holm-Swarm 肉瘤的细胞外基质，构建一种类似基底膜的基质小鼠模型。
在人工肿瘤研究之后，我们采用活体显微镜技术进行研究 体内 肿瘤血管生成及单核细胞向侧支动脉的归巢。既往研究已描述了动物模型的组织学检查，这需要后续进行分析以 死后 伪影。我们的方法能够实时可视化单核细胞向侧支循环区域的归巢过程，操作简便，并可用于研究动脉生成和肿瘤血管生成过程 体内.
引言
心血管疾病，包括冠心病和外周动脉疾病，是全球最主要的死亡原因1。细胞治疗是一种有前景的心血管疾病治疗方法，尤其适用于无法接受外科手术干预的患者。目前已有多种利用细胞或其分泌物质作为治疗手段的策略2,3，其总体目标是改善灌注并维持缺血和低灌注组织的功能。其中一种实现该目标的方法是促进动脉生成，从而增强侧支动脉的发育。单核细胞是与侧支形成密切相关的重要细胞类型。本研究团队长期致力于研究单核细胞在炎症区域的作用4,5，特别是采用后肢缺血模型来诱导缺血及随后的炎症反应6。单核细胞会趋向性迁移至炎症部位，并引发复杂的系统性反应，进而促进侧支血管的形成7。
利用活体显微镜技术，我们可以研究这些细胞的行为 体内 并观察注射的单核细胞向炎症区域的归巢。大多数先前的研究仅描述了 死后 分析方法存在诸多缺点，包括可能引入组织学伪影以及制备过程需要大量实验动物。通过我们的方法，可利用活体成像在多个时间点上对免疫学过程及侧支循环形成进行研究。
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方案
本研究经德国萨克森-安哈尔特州哈勒地区行政管理局批准，依据德国动物保护法第8条进行（2016年5月18日颁布的德国动物保护法第8条第1款——联邦法律公报 I S. 1206, 1313，以及2013年8月13日颁布的《动物保护饲养条例》第31条）。
注意：本实验使用8至12周龄的雄性BALB/c小鼠，以及来自献血者的单核细胞，通过活体显微镜观察单核细胞。
1. 细胞制备
注意：单核细胞的分离步骤，请参见我们此前在 JoVE 上发表的视频教程：“小鼠骨髓来源单核细胞的分离与静脉注射”（Wagner et al.4）
注意：处理细胞时，所有步骤必须保持无菌，以避免污染。
- 使用3,3'-二辛基氧杂羰花青高氯酸盐对细胞进行染色
- 将细胞重悬于无血清培养基中，细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL。
注意：必须使用无血清培养基才能实现有效染色，因为疏水性染料会与血清中的疏水成分结合，从而降低染色效率。 - 向 1 mL 细胞悬液中加入 5 µL 浓度为 1 mM 的二甲基甲酰胺溶解的3,3'-二辛基氧杂羰花青....
- 将细胞重悬于无血清培养基中，细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL。
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结果
利用活体显微技术观察单核细胞诱导的肿瘤生长及侧支血管形成，有助于揭示肿瘤血管生成和动脉生成分子机制的新层面。细胞的制备与注射必须严格按照本方案的步骤进行，操作差异可能导致各次实验之间出现变异。单核细胞必须注射至静脉系统（图1），以维持全身性效应，并避免在动脉系统注射时可能发生的栓塞。
如果使用基底膜样基质，缓慢注射以避免分散将有助于后续组织学检查时取出基质塞（图2， 图3）。处死小鼠后，从其体侧取出基底膜样基质塞。在基底膜样基质塞内，可通过在不同实验条件下计数毛细血管来评估血管化程度（图4，图5）。
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讨论
本文所述方法揭示了侧支动脉的发育过程、单核细胞在这些血管中的行为以及动脉生成的过程。该方案的操作步骤易于掌握，也可应用于其他科学领域。尽管具有这些优势，但仍存在一些缺点。例如，执行所述技术需要显微设备。为单次实验购置设备是不可持续的，因此与其它机构合作共享设备至关重要。
该方案还存在其他一些困难，但通过练习可以避免。初学者在显微镜下固定小鼠时可能会遇到问题，这种情况会影响成像质量。另一个关键环节是尾静脉注射。单核细胞只有在正确注射的情况下才能在静脉中被观察到。因此，建议在固定小鼠前先练习注射操作。
单核细胞的分离同样至关重要。可采用多种方案从不同物种中分离单核细胞，这些方案往往导致不同的实验结果和细胞得率12,13,14。操作过程中必须在无菌条件下进行，以避免污染。应通过小心移液和保持恒定温度来防止细胞损伤。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由 ELSE-Kröner-Stiftung 和 德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）SFB 854（Sonderforschungsbereich，协同研究中心）。特别感谢德国马格德堡奥托·冯·格里克大学马格德堡分校视听媒体中心（Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg）的 Hans-Holger Gärtner 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 胎牛血清（FCS） | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 1% 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 1 mL Omnifix-F 胰岛素注射器 | B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根 | ||
| 50 ml 注射器 | 德国巴特洪堡，费森尤斯卡比股份公司 | Injectomat-注射器 50 ml 带套管 | |
| 6孔超低吸附培养板 | 康宁公司，纽约州，美国 | ||
| 8至12周龄雄性C57BL/6、BalbC小鼠 | 查尔斯河实验室，苏尔茨费尔德，德国 | ||
| 胶带 | TESA SE，德国汉堡 | ||
| 采集软件 | Leica，德国韦茨拉尔 | Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF)；版本：2.7.3.9723 | |
| 导管 | B. Braun，美尔松根股份公司，德国美尔松根 | 29G，30G | |
| 细胞培养皿 | 德国弗里肯豪森，Greiner Bio-One GmbH | ||
| 细胞培养基 | 由本团队使用单一组分制备 | Medium199，10% 胎牛血清，1% 抗生素（青霉素/链霉素） | |
| 离心 | Beckman Coulter GmbH，克雷菲尔德，德国 | Allegra X-15R 离心机 | |
| 脱毛膏 | Veet，曼海姆，德国 | ||
| DiO | 美国俄勒冈州尤金市英吉特公司 | ||
| 消毒剂 | Schülke&Mayr GmbH，德国诺德施泰特 | ||
| 一次性手术刀10号 | 日本大阪羽剃须刀有限公司 | ||
| EDTA | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 锥形瓶 | GVB，德国黑尔佐根拉特 | ||
| 70% 乙醇 | Otto Fischar GmbH und Co KG，萨尔布吕肯ü肯恩，德国 | ||
| 胎牛血清 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 精细镊子 | 鲁比斯，斯塔比奥，瑞士 | ||
| 荧光染料/Rhodamine衍生物 | Thermo Fischer Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 目录编号：D-1819 | |
| 手套 | Rösner-Matby Meditrade GmbH，德国基弗斯费尔登 | ||
| 加热垫 | Labotect GmbH, Gö德国哥廷根 | 加热板 062 | |
| 人巨噬细胞集落刺激因子 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | SRP3110 | |
| 人源白细胞过滤器 | 血液保存 | ||
| 培养箱 | Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特嫩多夫 | ||
| 异氟烷 | Baxter Deutschland GmbH，Unterschleißheim，德国ß德国海姆 | ||
| 氯胺酮（10%） | Ketavet，Pfizer Deutschland GmbH，柏林，德国 | ||
| 白细胞分离管（带滤芯的管子） | 德国弗里肯豪森，Bio one有限公司 | ||
| 光学显微镜 | 卡尔·蔡司半导体制造技术有限公司，奥伯科亨，德国 | Axiovert 40 C | |
| 淋巴细胞分离液 LSM1077 | 通用电气医疗集团，奥地利帕兴 | ||
| Matrigel | 美国新泽西州富兰克林莱克，贝克顿-迪金森公司 | ||
| M199 培养基 | PAA Laboratories GmbH，奥地利帕兴 | ||
| 微生物操作台 | Thermo Electron，LED GmbH，德国兰根塞尔博德 | Hera 安全 | |
| 显微镜载玻片 | 卡尔罗特有限公司，卡尔斯鲁厄 | 产品编号 1879 | |
| 配备培养箱和加热装置的显微镜支架 | Leica DMI 6000，Pecon，德国 | ||
| 单核细胞洗涤缓冲液 | 由本课题组利用单一组分制备而成 | PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA | |
| 小鼠固定器 | 各种 | ||
| 多光子显微镜 | 徕卡，德国韦茨拉尔 | Leica SP5 共聚焦显微镜，Cameleon，Coherent | |
| 氯化钠 (0.9%) | 德国柏林柏林化学股份公司 | ||
| 血细胞计数板 | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö德国尼格斯霍芬 | ||
| 目标 | 徕卡，德国韦茨拉尔 | Leica HC PL APO 10x/0.4 CS | |
| PBS | 德国达姆施塔特 Life technologies GmbH | pH 7.4，无菌 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| Percoll | 由本课题组利用单一组分制备而成 | 90% Percoll，10% 1.5 M NaCl ρ= 1,064 g cm-3 | |
| Percoll 溶液 | GE Healthcare，生物科学部，乌普萨拉，瑞典 | ||
| 移液器 | Eppendorf AG，德国汉堡 | 10µ升/100公里µL/200µ升/1000µL | |
| 移液器，血清学 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | Cellstar 2 ml、5 ml、10 ml | |
| 移液头 | Eppendorf AG，德国汉堡 | ||
| Pipetus | Eppendorf AG，德国汉堡 | ||
| 聚苯乙烯管 | Cellstar，Greiner Bio-One GmbH，德国弗里克豪森 | ||
| 剪刀 | Word Precision Instruments, Inc.，美国萨拉索塔 | ||
| 量程 | Mettler PM4800 Delta Range，Mettler-Toledo GmbH，Gieß德国 | ||
| 负压吸引装置 | Integra bioscience，德国费恩瓦尔德 | Vacusafe comfort | |
| 手术剪 | Word Precision Instruments, Inc.，美国萨拉索塔 | ||
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Sigma Aldrich，德国汉堡 | ||
| 带盖试管 | Greiner Bio-One GmbH，德国弗里肯豪森 | 15 ml，50 ml Cellstar | |
| 赛拉嗪（2%） | Ceva Tiergesundheit GmbH, Dü德国杜塞尔多夫 |
参考文献
- World Health Organization. WHO | The top 10 causes of death. World Health Organization. , http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/. (2017).
- Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. Development of pluripotent stem cells for vascular therapy. Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).
- Henry, T. D., et al.
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