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一种无线双向接口 体内 在自由活动大鼠中记录与刺激神经活动

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DOI：

10.3791/56299

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2017年11月7日

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1Behavioral Neuroscience, Experimental and Biological Psychology, Philipps-Universität Marburg, 2Behavioral Neurosciences Institute (INeC), 3Thomas RECORDING GmbH, 4Department of Neurophysics, Philipps-Universität Marburg

本文内容

摘要

介绍了一种用于自由活动大鼠的多通道神经记录与刺激的无线双向系统。该系统轻便紧凑，对动物的行为模式影响极小。此外，这种双向系统为评估脑激活模式与行为之间的因果关系提供了先进的工具。

摘要

体内电生理学是一种强大的技术，可在毫秒和微米尺度上研究脑活动与行为之间的关系。然而，目前的方法大多依赖于有线电缆记录，或仅使用单向系统，只能实现神经活动的记录或刺激，而无法同时在同一目标上进行。本文介绍了一种新型无线双向装置，可在自由活动的大鼠中同时进行多通道神经活动记录与刺激。该系统通过一个便携式头戴装置运行，该装置既能传输记录到的神经信号，又可通过基于遥测技术的多通道软件实现实时靶向脑刺激。头戴装置配备有前置放大器和可充电电池，可实现长达1小时的稳定长期记录或刺激。重要的是，该头戴装置结构紧凑，重量仅为12克（含电池），对动物行为谱的影响极小，使该方法适用于多种行为学任务。此外，该方法具有显著优势，即能够同时测量脑刺激对神经活动和行为的影响，从而提供一种评估特定脑激活模式与行为之间因果关系的工具。这一特性使该方法在深部脑刺激领域尤为有价值，可在长期行为实验过程中精确评估、监测和调整刺激参数。该系统的适用性已通过下丘作为模型结构得到验证。

引言

神经科学中的一个基本问题是，特定神经回路中的电活动如何产生特定形式的行为。 在体 电生理学是一种解决该问题的强大技术，可在动物执行特定行为任务时记录或刺激其脑部电活动。然而，现有系统通常依赖于有线缆连接的记录方式1,2，可能限制了动物的活动能力，并阻碍其行为谱的充分表达。此外，目前使用的系统大多为单向系统，仅允许记录3,4,5 或刺激6,7 神经活动的模式，但无法在同一时间或同一目标上进行，这使得特定脑激活模式与行为之间的因果关系难以厘清。目前仅有少数无线双向系统可用于 体内 目前已有相关制备产品，但通常较为笨重（40-50 g），且由两个独立的便携式单元组成， 即 一个前置放大器和一个用于电池供电的连接式背包8,9,10，使其灵活性降低，并增加电缆断开的风险，例如在自主理毛行为期间。上述无线系统均未提供可植入式微电极单元，因而无法在实验条件高度可重复的前提下，实现对动物在完全符合行为学有效性状态下的神经活动进行完整的集成式记录。

本文介绍了一种新型的无线双向装置，可用于自由活动大鼠神经活动的in vivo记录与刺激。托马斯无线系统（TWS）通过一个可拆卸的头部级联装置运行，能够利用最多四个独立记录通道传输多通道信号，并可实现实时靶向脑部电刺激。此外，还开发了一种与TWS兼容的可长期植入式微电极单元，能够同时实现神经刺激与记录。本文还展示了用于记录和刺激的TWS软件图形用户界面。本研究详细描述了该整套装置的验证过程及其in vivo应用。

为了验证TWS系统，选择下丘作为目标神经结构，因为其电刺激可引发明显的行为反应。众所周知，对下丘的电刺激会在大鼠中诱发无条件的“类恐惧”行为反应，例如警觉、侧身姿势、背部弓起、僵直以及逃避（逃跑）行为。这种反应模式模拟了由环境挑战（如感知到的有害事件、攻击或生存威胁）所引发的恐惧反应11,12,13。研究假设，能够诱发如此清晰且明确的行为反应，将对TWS系统构成真正的挑战。

方案

所有实验方案和实验均遵循现行的欧洲指南（2010/63/EU），并经地区主管部门批准（Regierungspräsidium Gießen，MR 20/35 Nr.25/2015）。

1. 动物

  1. 手术前至少一周，在标准实验室条件下以每组3-4只的方式饲养雄性成年Wistar大鼠（200-250 g），以适应环境。
  2. 手术后两天，将大鼠以每对为一组进行饲养。单个笼子应覆盖高丙烯酸材质的盖子。避免使用金属网格制成的传统盖子，因为植入物可能被卡住，从而增加其随时间推移而损坏和/或不稳定的風險。

2. 立体定向手术

  1. 手术开始前，整理并准备好以下设备和材料：
    1. 获取无菌手术器械，包括无菌剪刀、钝头镊子、刮勺、手术剪、牙科钻和棉签。 
    2. 获取药物和化学品，包括异氟烷、利多卡因、盐酸曲马多、泛醇眼膏、3%过氧化氢、聚维酮碘和70%乙醇。
    3. 获取固定材料，包括不锈钢螺钉、丙烯酸树脂、紫外线胶和帽状保护器。
    4. 获取一个微电极装置，该装置包括：（i）记录单电极（石英玻璃绝缘的铂钨微电极，锥形尖端，外径：80 µm，锥形尖端，1 kHz 频率下的阻抗：500 kOhm）或四极电极（石英玻璃绝缘的铂/钨四芯微电极，外径：100 µm，锥形尖端，1 kHz 频率下的阻抗：500–800 kOhm）；（ii）刺激电极（铂/铱合金丝（90% 铂，10% 铱），芯径 125 µm，外径 150 µm，阻抗） <10 kΩ）连接至接触板，以及（iii）铂丝参比电极（杆径，100 µm； 图1A).
    5. 提前至少2小时获取用电解质可溶性胶水固定在微电极单元上的电极夹持器，并测试其功能是否正常（图1B).
    6. 获取一套常规的有线系统，该系统包括用于记录的差分前置放大器、主放大器和带通滤波放大器。
    7. 获取额外材料，如手套、加热垫、注射器和生理盐水。
    8. 获取饲养笼（长 × 宽 × 高：42 cm × 26 cm × 38 cm）。
  2. 步骤
    注意：电极植入是在异氟烷麻醉下通过常规立体定向手术进行的。
    1. 确保实验人员佩戴手套、外科口罩和实验服。
    2. 将动物置于诱导室中开始麻醉（异氟烷 4-5%，氧气流速 1 L/min，持续时间约 5 分钟）。
    3. 使用镊子检测尾部和足趾反射的消失，以确认深度麻醉状态。
    4. 将动物头部置于固定在立体定位仪门齿杆上的麻醉面罩中，并调节麻醉气体（异氟烷 2-3%，氧气流速 0.7-0.8 L/min）。
    5. 使用耳杆和上门齿杆在立体定位仪中固定并水平对齐动物头部。
    6. 使用手术剪或剪刀剃除手术区域的毛发，并用聚维酮碘进行消毒。
    7. 将动物置于加热垫上以防止低体温，并使用右泛醇眼膏处理眼睛，防止其干燥。
    8. 在手术区域中心皮下注射利多卡因（0.3–0.4 mL，s.c.）。
    9. 再次测试反射消失情况。
    10. 在手术区域中央用手术刀做一个小切口（1.5 cm），暴露颅骨。用镊子、剪刀和刮匙轻轻分离皮肤并清除残留组织。
    11. 使用蘸有双氧水的棉签仔细清洁颅骨。
    12. 在颅骨上钻4-5个用于固定不锈钢螺丝的小孔（4.7 mm）。
    13. 将微电极装置/电极夹持器连接至前置放大器，并固定到立体定位微量操作器上（图1B 和 1C).
    14. 使用脑图谱中针对所用动物的坐标，在目标区域上方的颅骨上钻一个孔（直径约7 mm）。在本研究中，将电极尖端定位至下丘，坐标如下，以前囟作为参考：前后向，−8.8 mm；内外向，1.5 mm；背腹向，3.5 mm14.
    15. 用棉签吸去血液。
    16. 将微电极装置垂直插入，直至电极尖端到达目标区域。
    17. 将接地电缆沿不锈钢螺钉放置，并置于皮肤下方。
    18. 监测锋电位活动，并使用显微操作器仔细调整电极位置，直至到达目标结构中具有活跃神经元的区域，并检测到适合锋电位分类的信噪比的神经活动。
    19. 用紫外胶将微电极装置固定在颅骨上，并用丙烯酸树脂覆盖触点板和螺钉。
    20. 注射生理盐水（1 mL，腹腔注射）以防止脱水，并皮下注射曲马多（25 mg/kg）以确保术后镇痛。
    21. 使用蘸水的刷子将微电极装置从电极夹持器上拆下。
    22. 停止麻醉，小心地将大鼠从立体定位仪中取出。断开前置放大器与微电极装置的连接。
    23. 将微电极单元的帽状保护装置连接好，仅在实验操作过程中断开。
    24. 术后第二天起，将动物成对饲养在原笼中。
    25. 每天监测动物术后可能的伤口感染、体重、健康状况和一般行为，持续7天。此恢复期结束后，进行 体内 电生理学与行为学实验
      注意：手术过程持续 60-90 分钟。术中须持续监测尾部甩动反射，并根据需要调整麻醉深度。

3. 体内 电生理学

  1. 仪器与实验步骤
    注意：电生理记录和刺激使用 TWS 进行。
    1. 获取一个集成了前置放大器并连接电池的头戴式记录装置（四个记录通道；模拟信号记录输入范围：0–12 mV 峰峰值；刺激输出：±625 µA；长 × 宽 × 高：24 mm × 22 mm × 12 mm；重量：不含电池为 6 g，含电池为 12 g；电池续航时间最长可达 1 小时）。该头戴式装置可通过微型多极连接器直接与植入式微电极单元相连图2).
    2. 获取一块安装在头端（head stage）顶部的电池（锂离子蓄电池，3.7–4.2 V DC，230 mAh，27 mm × 20 mm × 6 mm，工作时间1小时）图2C如有需要，可使用容量为450 mA的可充电替换电池，工作时间约为2.5小时。确保电池连接至头戴装置时，其上的绿色指示灯亮起。
    3. 通过标准 USB 接口连接至个人计算机的收发器（接收-发射装置），可实现最远 5 m 的无线操作图 2E).
    4. 获取一台装有 TWS 软件的个人计算机，用于电刺激及神经活动记录（图3 和 图4).
    5. 获取用于手术期间记录的固定式前置放大器和数据采集系统（见第2.1.5项）以及刺激发生器，以便在术后一周比较清醒大鼠中经颅电刺激（TWS）的有效性。
      注意：使用两种系统通过同一植入式微电极单元提供电刺激并记录单个神经元的细胞外活动。应根据靶向的脑区针对每只动物调整刺激参数（电流强度、脉冲和频率）。在本研究中，采用150–250 µA、2500 Hz的电流刺激下丘。
  2. 行为学实验
    注意：一旦在收发器与动物头部支架之间不引入金属屏障，该无线系统即可适用于多种行为学任务。作为典型的行为学测试示例，该系统已用于旷场实验以测量动物的一般行为活动，以及用于高架十字迷宫实验——这是评估啮齿类动物焦虑样行为的标准测试。15在开阔场地和高架十字迷宫正上方中央位置放置摄像机，用于行为记录。
    1. 在行为学测试之前，连续三天对每只动物进行抓握操作（每天5分钟）。每次抓握前，将带有电池的前置放大器连接到先前植入的微电极装置上。抓握期间不进行任何记录或刺激操作。
    2. 开放场
      1. 将大鼠置于开放旷场（40 cm × 40 cm × 40 cm；红光约30 Lux）中央，使其在神经信号记录条件下自由探索装置至少5分钟。
      2. 确定逃避阈值——引发大鼠奔跑或跳跃的最小电流强度。在本研究中，以1分钟间隔向下丘施加高频2500 Hz刺激（脉宽：100 µs；脉冲间隔：100 µs），每次增加电流强度20–50 µA，直至大鼠出现逃避行为。
      3. 将大鼠放回其饲养笼中，用0.1%乙酸溶液清洁旷场并擦干。
        注意：为了比较TWS与传统有线系统在刺激效果上的差异，采用上述两种系统分别进行了所述实验操作。
    3. 高架十字迷宫
      注意：本实验所用的加号迷宫由灰色丙烯酸材料制成，包含两个开放臂（长50 cm，宽10 cm）和两个封闭臂（长50 cm，宽10 cm，侧壁高40 cm），所有臂均从中央平台延伸而出，平台距离地面50 cm16.
      1. 将大鼠置于十字迷宫中心，使其朝向一个开放臂，允许其在持续记录下自由探索装置，持续5分钟。
      2. 记录在5分钟内进入开放臂和闭合臂的次数，以及在开放臂和闭合臂中停留的时间。
      3. 将大鼠放回其居住笼具，在每次测试前用0.1%乙酸溶液清洁并擦干迷宫。
    4. 灌注与组织学
      1. 用赛拉嗪/氯胺酮（150 mg/kg 和 100 mg/kg，分别；腹腔注射）麻醉大鼠。
      2. 将植入的电极单元连接至刺激电缆，并施加电刺激（电流强度 50 µA，脉冲宽度：100 µs；脉冲间隔：100 µs），持续 90 秒，以在电极尖端周围产生微小损伤。
      3. 断开刺激电缆，通过左心室灌注生理盐水，随后灌注 200 mL 含 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.3）的 4% 多聚甲醛溶液（具体操作详见参考文献）17).
      4. 取出脑组织，置于新鲜固定液中，4 °C 下固定 4 小时。
      5. 确保主冷冻切片机舱室的温度为 -20 °C。
      6. 将脑组织置于干冰上冷冻，使用冷冻切片机切成50 µm连续冠状切片。
      7. 使用焦油紫对切片进行染色，以根据Paxinos和Watson图谱确定电极尖端的位置14.

结果

TWS 技术数据

该无线系统提供4个独立的记录通道和1个刺激通道。细胞外电活动由记录用单芯电极拾取后，传送到无线系统的高阻抗信号输入端。所记录的信号由交流耦合、差分输入的前置放大器进行预放大（×200），并通过带通滤波（固定信号带宽为500 Hz … 5 kHz）以仅记录多单位放电活动，因为在本研究中主要关注的是单位放电活动，而非局部场电位。集成的可编程增益主放大器为四个记录通道提供软件可调增益（×1、×2、×4、×8、×16、×32、×64）。无线系统的完整信号链路可实现的总增益值为×200、×400、×800、×1600、×3200、×6400和×12800。经过放大和滤波后，模拟信号由模数转换器进行数字化，调制到高频载波上，并通过工作在2.4 – 2.5 GHz ISM频段的无线收发器进行传输。在传输路径的另一端也使用了相同类型的收发器，该收发器通过USB端口连接至个人计算机。该传输路径用于双向数据传输，即将动物体内的细胞外记录信号发送至计算机，同时将计算机发出的信号放大与刺激控制参数传回动物端。

使用TWS，能够在大鼠于开放场中自由活动时，成功记录其多单位脑电活动，并通过刺激下丘来调节动物行为。发射接收装置放置在距离动物最远5 m的位置，并通过USB端口连接至计算机（见图2）。绑线式记录系统与无线系统所获得的信号质量对比如图5所示。TWS记录的多单位活动信号质量与有线记录系统相当。该微型刺激器是一种真正的无线刺激装置，可实时更新刺激参数，即当按下刺激按钮后，由TWS软件定义参数的刺激信号可在数毫秒内传递至连接于头戴装置的刺激电极。因此，无需将动物移出笼外即可更改刺激参数。这一特性有助于最大限度地缩短刺激实验所需时间。

专门设计了一款TWS软件，可通过一个图形用户界面控制无线系统的全部功能（例如记录和刺激）（图3 和 图4）。进行微刺激时，使用通过TWS软件图形用户界面生成的刺激信号。TWS的刺激器采用电荷平衡的恒流刺激模式。刺激模式通过无线方式发送至集成在头戴式无线单元中的恒流刺激器。刺激电流施加于植入目标区域（例如本研究中的下丘）的微电极与一个较大的远端对电极之间，后者作为TWS的接地或参考电极。根据刺激电极的阻抗和恒流刺激器的电压容差，最大刺激电流范围可达±625 µA，但在本实验中仅需远低于此限值的电流阈值。本研究采用双相电荷平衡的恒流刺激，峰值电流最高为300 µA。在双相刺激中，第一相脉冲用于引发生理效应，第二相脉冲通常用于逆转刺激脉冲期间发生的电化学过程18。TWS头戴单元可实时提供通过TWS软件图形用户界面设定的刺激模式（见 图4）。

TWS 软件分为三个主要部分：(i) 主窗口，用于控制记录和刺激；(ii) 刺激发生器窗口，包含刺激信号参数的所有设置选项；以及 (iii) 回放窗口，用于重放记录的数据文件。主窗口允许用户显示最多 4 个记录通道的信号，设置所有通道的增益，并启动/停止所显示信号的记录。信号数据存储在计算机硬盘上的文件中，文件路径在配置菜单中设定。除了记录参数外，主窗口还可用于启动和停止刺激过程。通过动物脑部刺激电极的恒定刺激电流会实时显示在主窗口界面上。刺激信号的参数在刺激参数设置窗口中预先调整。用户可定义单相或双相刺激脉冲序列，并设置所有常用的刺激脉冲参数，例如脉冲宽度、脉冲幅度、脉冲间时间等（详见图 4）。由预设参数值生成的刺激脉冲函数将在刺激发生器窗口的图形界面中显示。

TWS 软件的设计遵循了可用性原则。软件的可用性是确保无线刺激/记录实验顺利进行以及保障工作环境安全舒适的关键因素，同时有助于提高实验的可重复性。

单细胞记录数据与电刺激

使用TWS系统和传统的有线记录系统，通过同一植入电极连续记录下丘脑外侧区的细胞外多通道单位放电活动。图5展示了动物在开放场域中自由活动时，两种系统记录到的代表性原始数据。对信号的直接比较表明，两者的动作电位波形和噪声水平相似（图5A 和 5B）。A' 和 B' 图展示了动作电位形态的示例。

由于大鼠在手术后及随后的几天内未尝试移除TWS头戴装置，因此认为该装置并未显著影响其活动，也不会引起不适。因此，使用TWS避免了在有线记录大鼠神经信号时常见的问题，例如动物啃咬或拔除连接器和电缆。事实上，佩戴TWS头戴装置的大鼠能够自由探索开放旷场和十字迷宫（见视频1），表现出正常的穿越、直立和理毛行为。

此外，使用TWS或传统的有线系统所采用的刺激参数均引发了相同的动物行为反应，即逃避行为。从100 µA开始，逐步增加刺激电流强度，直至达到逃避阈值——即引发奔跑或跳跃的最小电流强度——并诱发逃避行为。在使用两种系统时，4只大鼠各自的逃避阈值均相似（图5C）。

静态平衡示意图；微尺度力学测试设备设置；标注部件；实验。
图1： TWS微电极单元。 （1）记录单电极/四电极，（2）刺激电极，（3）电极光纤连接板，（4）柔性连接电缆，（5）接地线，（6）连接器板，（7）TWS系统的公头或母头连接器（A）；TWS微电极单元连接至前置放大器（8）和持针器（9）；（B）准备安装至立体定位仪框架（C）。 请点击此处查看此图的放大版本。

遥测系统组件及设置；大鼠的无线记录；笔记本电脑上的数据分析。
图 2： 安装在动物头骨上的TWS头端模块（A）顶部视图，未连接蓄电池电源。整体尺寸：高度12.5 mm，深度24 mm（19.3 mm + 4.7 mm），宽度22.1 mm，重量5.96 g。底部视图（B）显示电极单元连接器；蓄电池电源尺寸为高度9 mm，深度26 mm，宽度20 mm，重量6 g（C）；本实验所用TWS组件概览：（1）安装在动物颅骨上的带蓄电池的头端单元，（2）连接至计算机USB端口的收发单元，（3）TWS软件（D）；一只自由活动的大鼠照片，显示TWS头端与先前植入的微电极单元相连接（E），以及TWS软件显示的典型记录信号（F）。TWS头端通过TWS软件的图形用户界面设定，实现实时刺激模式的输出。请点击此处查看该图的放大版本。

神经记录数据、脑电图显示、使用Thomas无线系统进行信号分析、峰电位检测
图3：TWS软件图形用户界面，记录界面。 屏幕显示了TWS系统在下丘脑植入单个双极记录电极后的记录表现。请点击此处查看此图的放大版本。

电生理波形设计、脉冲参数和时序配置；软件界面。
图4：经颅波刺激（TWS）软件图形用户界面。 刺激界面（A）和刺激参数设置（B）。通过TWS软件图形用户界面可调节刺激信号参数（C），如脉宽（PxW）、脉冲幅度（PxA）、脉间延迟（IPD）、脉冲间时间（TBP）、每串脉冲数（PPT）和串间时间（TBT）。请点击此处查看此图的放大版本。

使用波形数据进行神经信号分析，脉冲调制实验结果的参数表。
图 5： 使用无线系统（TWS）进行细胞外记录的多单位信号（A）与有线记录系统（B）之间的定性比较。两次记录均来自植入下丘的同一TWS微电极单元（阻抗0.5 MΩ）。两个记录电极触点之间的轴向距离约为400 µm。有线系统与TWS的记录带宽相同（500 Hz … 5 kHz），信号采样频率分别为40 kHz（有线系统）和32 kHz（TWS）。两个系统均记录到相似信号质量的多单位活动。TWS与有线记录之间的放电率无明显差异。A' 和 B' 分别展示了两个记录中单个神经元的动作电位波形。在4只大鼠中，使用有系缚系统（TS）或TWS达到逃避阈值所需的刺激参数相似（C）。请点击此处查看该图的放大版本。

用于焦虑行为测试的高架十字迷宫及小鼠；行为学研究中的实验装置。
视频 1： 一只大鼠在十字迷宫实验中表现出典型探索行为的示例。 无线系统（TWS）使动物能够在不缠绕导线的情况下进入开放臂和封闭臂，同时其体积小、重量轻，对实验任务本身的干扰极小。请点击此处观看视频。（右键可下载。）

讨论

本文介绍了一种广泛可用的无线记录与刺激系统，可用于自由活动动物的电生理学和行为学研究。该TWS系统已利用下丘作为模型结构，在行为学实验中得到验证。相较于现有方法，TWS系统具有多项优势。首先，该系统采用单一便携式TWS头戴装置，配备前置放大器和可充电电池，使用同一块电池可实现长达1小时的稳定长期记录，并支持最远5米的无线操作距离。其次，TWS头戴装置轻巧紧凑，含电池重量仅为12克，设计上可防止大鼠自行拆除装置或啃咬导线。动物对该装置耐受性良好，未观察到佩戴或不佩戴TWS头戴装置对动物行为谱产生影响，因此该系统适用于多种行为学任务。第三，系统支持实时传输。第四，系统能够同步进行神经活动的双向记录与刺激，为研究特定脑区激活模式与行为之间的因果关系提供了先进工具，从而克服了单向系统的局限性。这一特性使该方法在深部脑刺激领域尤为有价值，因为该领域通常需要在长期行为实验过程中精确评估、监测和调整刺激参数。最后，本研究还开发了一种可长期植入的微电极单元，集成了记录电极、刺激电极和参考电极，可在常规立体定位手术中方便地植入。从这一角度来看，TWS是一种集成化的无线系统，可提高刺激与记录实验的可重复性。TWS系统的记录质量与商用有线记录系统相当（见图5）。

众所周知，对大鼠下丘进行电刺激会引发明显的逃避行为，表现为奔跑或跳跃，类似于环境挑战所诱发的恐惧反应11,12,13。本研究通过使用无线刺激系统（TWS）或传统的有线系统刺激下丘，诱导了此类行为。为了测试TWS的刺激有效性，比较了两种系统诱发逃避行为的阈值——即引发奔跑或跳跃所需的最小电流强度。安装TWS头件的大鼠能够快速奔跑、跳跃并爬出敞箱，表现出典型的逃避行为，且运动自由度更高。重要的是，TWS所测得的逃避阈值与传统有线系统相似。综上，本研究采用了一种较为严苛的实验范式来检验TWS的稳定性，而该系统轻松地通过了测试。

TWS 还适用于慢性电刺激实验，因为植入的微电极单元支持长期使用。TWS 可以非常精确地调节刺激电流参数，从而准确确定能够引发行为反应的有效刺激频率和电流强度。此外，同一只动物在3天后以相同的电流阈值进行刺激，仍可引发相同的目标行为反应。这表明，刺激电极尖端周围的组织并未受到刺激电流的损伤，通常情况下，若组织受损，则需要随着重复刺激而逐步增加刺激电流强度，才能引发相同的行为反应。

此外，由于TWS微型刺激器能够在实验者更改图形用户界面中的参数时实时更新刺激参数，因此可以显著缩短实验时间。用于临床前研究的其他电刺激器19在更新刺激参数时需要重新编程。在这些情况下，必须通过电缆将动物与编程单元连接以对设备进行编程。而使用TWS时则无需此步骤。

最后，将电池固定在TWS头端装置的顶部，并通过一个双针磁性连接器与头端装置进行电气连接，以便于电池的更换。其优点是在实验过程中可以更换电池，而无需将TWS头端装置从植入的电极单元上断开，从而显著提高动物的舒适度。在本研究中，我们使用的电池工作时间仅为1小时。如果实验时间超过1小时，建议准备一块额外的已充电电池。TWS可连接两种可更换的可充电电池：（i）容量为230 mA的电池，工作时间为1小时；或（ii）容量为450 mA的电池，工作时间约为2.5小时。这两种电池均可在15分钟内完成充电。

综上所述，本研究介绍了用于自由活动小型动物神经刺激与记录的无线系统（TWS）的操作方法。同时提供了一套完全集成的可植入微电极单元、前置放大器、接收器及配套软件。该无线记录与刺激系统的质量与传统的有线记录系统相当，且具有对动物更舒适、更轻便、更安全的优势。因此，TWS 可替代有线系统，因其不限制动物的活动能力，并可在其他方法难以或无法实施的情况下，灵活地控制刺激和神经信号记录。因此，TWS 可成为研究特定神经环路中的电活动如何产生特定行为的重要工具，而这一问题正是神经科学领域的基本问题之一。

披露

共同作者 Uwe Thomas 和 Sascha Thomas 是 "Thomas RECORDING GmbH" 的所有者，该公司正在开发本研究中使用的产品，并涉及本文所述的一般研究主题。此外，共同作者 Dirk Hoehl 从 "Thomas RECORDING GmbH" 获得收入。如果该公司在营销与本研究相关的产品方面取得成功，他们可能因此获得经济利益。本研究中使用的 "Thomas RECORDING" 设备已无偿提供给马尔堡菲利普斯大学行为神经科学、实验与生物心理学系。

致谢

本研究得到了德国工业研究协会联合会（AiF）的资助（项目编号：KF2780403JL3）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
托马斯无线系统（TWS）2.0 版本托马斯记录有限公司AN001165Thomas无线系统（TWS）2.0版是一种便携式多通道遥测系统，包含笔记本电脑、预装的Microsoft Windows操作系统以及TWS控制软件。该系统包括：低噪声4通道前置放大器– 以及具有固定带宽、单通道恒流的可编程主放大器–用于施加双相电流脉冲的恒流刺激器、软件可编程微型刺激器、植入式连接系统，以及用于动物固定的初级头戴单元。该系统配备一个带有USB接口的收发器，可连接笔记本或台式个人计算机，并在Microsoft Windows操作系统下运行控制软件。TWS系统可用于自由活动的小型动物（如大鼠、豚鼠）的细胞外神经刺激与记录，也可根据需要适配用于较大型动物（如灵长类）。
托马斯无线系统（TWS）软件Thomas RECORDING GmbH包含在 AN001165 中Thomas无线系统的软件在Microsoft Windows操作系统下运行，为Thomas无线系统（TWS）提供图形用户界面（GUI）。TWS GUI可全面控制TWS功能，包括4通道记录和1通道刺激。
可植入式四极电极，用于记录（4通道）和刺激（单通道）Thomas RECORDING GmbHAN001132用于Thomas无线系统（TWS）的可植入式四极电极，适用于记录（4通道）和刺激（单通道）。
记录电极四极丝规格：四极丝材质：石英玻璃绝缘铂钨丝，四极丝外径：100µm，尖端形状D，阻抗0.5–0.8 MΩ；参考电极：尖端形状D，阻抗300–500 kΩ；材料：石英玻璃绝缘铂/钨；刺激电极规格：纤维材料铂/铱，直径125µ米，漆包绝缘，尖端形状：D，阻抗： &< 10 kOhm，电极的尺寸可由最终用户指定
可植入式微电极（用于记录单通道和刺激单通道）Thomas RECORDING GmbHAN001118用于托马斯无线系统（TWS）的可植入微电极，适用于记录（单通道）和刺激（单通道）。
记录电极规格：电极纤维材料：石英玻璃绝缘铂钨纤维，电极纤维外径：80µm/250µm（请具体说明），尖端形状 D，阻抗 0.5–0.8 MΩ；参考电极：尖端形状 D；阻抗 300–500 kΩ；材料：石英玻璃绝缘铂/钨；刺激电极规格：纤维材料 铂/铱，直径 125µ米，漆包绝缘，尖端形状：D，阻抗： &< 10 kΩ
电极植入支架托马斯记录有限公司AN000838用于标准电极夹持器的微电极植入专用弯形金属杆。该金属杆用于固定可植入电极，并使用Thomas RECORDING专用水溶性胶（AN001080）将可植入电极固定于金属杆上。（电极夹持器不包含在内）
Thomas无线系统替换蓄电池电源（3.7 V/230 mAh）托马斯记录有限公司AN001208Thomas无线系统用可更换充电电池（蓄电池），容量230mA，可支持约1小时运行时间。（尺寸：27mm x 20mm x 6mm，重量约6g）
Thomas无线系统替换蓄电池电源（3.7 V/450 mAh）托马斯记录有限公司AN001209Thomas无线系统用可更换充电电池（蓄电池），容量450mA，可支持超过1小时的运行时间。（尺寸：48mm x 30mm x 4mm，重量约11g）
Thomas无线系统（TWS）可充电电池的充电器Thomas RECORDING GmbHAN001207Thomas无线系统（TWS）可充电电池（AN001209和AN001209）的市电供电充电器
水溶性胶水托马斯记录有限公司AN001080Thomas RECORDING 水溶性电极胶是一种专为神经科学研究中可植入微电极应用而精心筛选的产品。其独特性能可确保电极与固定装置之间形成牢固连接，同时能用温水轻松去除。Thomas RECORDING 水溶性电极胶开盒即用，无需任何耗时的预处理步骤。该产品对人类、动物及环境均无害。规格：1 盒，10 克
微型差分前置放大器Thomas RECORDING GmbHAN000329微型差分前置放大器，型号MDPA-2，是一款双通道差分输入前置放大器，专为可兴奋组织的低噪声记录而设计。该设备用于与可植入微电极结合进行细胞外记录，适用于配合托马斯无线系统（TWS）在自由活动动物中的应用。双通道微型差分前置放大器（MDPA-2）连接至可植入微电极，提供初始十倍放大级。理想情况下，使用托马斯RECORDING品牌的石英玻璃绝缘铂/钨电极，可获得高信号幅度和低噪声水平的最佳记录效果。MDPA-2还设有额外的公共接地和参考电极输入端。
连接电缆Thomas RECORDING GmbHAN000330连接线，用于将Thomas微型差分前置放大器（MDPA-2）与主放大器及蓄电池电源相连。
微型前置放大器的可充电电源托马斯记录有限公司AN000328微型差分前置放大器（MDPA-2）用可充电电池电源
蓄电池充电器（美国）Thomas RECORDING GmbHAN000167AN000328 电源的蓄电池充电器（美标电源插座连接器）
蓄电池充电器（欧盟）Thomas RECORDING GmbHAN000168电源供应器 AN000328 的蓄电池充电器（欧盟电源插座接口）
差分前置放大器/主放大器/带通滤波器Thomas RECORDING GmbHAN000677TREC AC主放大器（LabAmp-03）是一种用于神经生理学应用（例如使用微电极进行细胞外记录）的单通道差分主放大器。该仪器设计用于与微型差分前置放大器MDPA-2型号配合使用。LabAmp-03的单个通道包含一个高增益、低噪声的差分放大级，后接低频和高频滤波器。该放大器配备两种不同的滤波放大器，即单个神经元活动（SUA）滤波器 –放大器和局部场电位（LFP）滤波放大器，二者在信号通路中并联连接。记录模式在第一级放大阶段提供两级信号增益（×10、×100），在末级放大阶段提供四级额外增益（×5、×10、×25 和 ×50）。每个放大器具有不同的带通特性，用于单个神经元活动（SUA）500 Hz…20 kHz 和局部场电位（LFP）0.1 Hz…140 Hz。该设备集成了音频监视器和窗口鉴别器。LabAmp-03 配备有内置扬声器的音频监视器，可对电生理信号进行音频重放。该单元将音频放大器集成于紧凑且坚固的外壳中，特别适用于监测神经放电和肌肉收缩。音频监视器输入端 internally 连接至 SUA-Filter 放大器输出端。LabAmp-03 配备外部电源适配器，支持交流 100–240 V / 50–60 Hz 的市电工作电压范围。
USB示波器Thomas RECORDING GmbHAN001096USB PC 示波器，2 通道。这款双通道 PC 示波器非常适用于笔记本电脑的移动使用，以及控制柜、工业设备和其他需要体积小、重量轻且性能强大示波器的多种应用场景。该示波器连接至主放大器的信号输出端，用于在植入 Thomas 无线系统（TWS）的可植入微电极过程中实时显示记录的细胞外电活动。用户可通过多种数据接口直接在配备的 PC 软件上采集测量数据。
刺激发生器多通道系统STG3008-FA用于电流（STG）和电压驱动刺激的刺激发生器具备三种功能：电流驱动刺激、电压驱动刺激、控制与定时。STG 提供 2、4 或 8 个独立输出通道。每个输出通道均配备集成隔离单元，能够输出任意波形。
电极保护帽Thomas RECORDING GmbHAN001193Thomas无线系统用可植入电极单元的保护帽
手术器械剪刀、钝头镊子、刮勺、手术剪、牙科钻和棉签
药物与化学品异氟烷、利多卡因、盐酸曲马多（Tramadol-CT，AbZ-Pharma GmbH，德国乌尔姆）、右泛醇眼膏（Bepanthen，Bayer AG，德国勒沃库森）、3%过氧化氢、聚维酮碘（Betaisodona，Mundipharma GmbH，德国林堡）和70%乙醇；
固定材料，包括不锈钢螺钉（BN650 M1.2×5；4.7 mm）、丙烯酸树脂（Paladur，Heraeus Holding GmbH，德国汉诺）、紫外胶（Cyberbond U3300，Cyberbond Europe GmbH，德国）、帽状保护器（Thomas Recording GmbH，德国吉森）；
附加材料手套、加热垫、注射器和生理盐水。
小型动物立体定位仪（SASI）Thomas RECORDING GmbHAN000287应根据研究中使用的动物（大鼠、豚鼠、猴子等）选择合适的模型
视频摄像机EverFocusEverFocus，型号：EQ150
开放场由透明或灰色丙烯酸材料制成，呈圆形，尺寸为40x40x40 cm
高架十字迷宫由灰色丙烯酸材料制成，包含两条开放臂（50 cm 长 × 10 cm 宽）和两条封闭臂（50 cm 长 × 10 cm 宽，带 40 cm 高的侧壁），均从中央平台延伸而出，平台距地面高度为 50 cm。

参考文献

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