线粒体自噬是清除受损线粒体的过程，对于维持线粒体稳态和健康至关重要。本文介绍了一些在人类细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和小鼠中检测线粒体自噬的最新方法。
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本文内容
摘要
摘要
线粒体是细胞的能量工厂，以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生细胞能量。线粒体功能障碍与生物衰老以及多种疾病相关，包括代谢性疾病、早衰综合征和神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。线粒体健康的维持依赖于线粒体生物发生以及通过线粒体自噬（mitophagy）高效清除受损线粒体。准确检测自噬/线粒体自噬的实验方法，尤其是在动物模型中，一直难以建立。近年来在线粒体自噬分子机制方面的研究进展，推动了新型线粒体自噬检测技术的开发。本文将介绍几种用于监测人源细胞中线粒体自噬的多功能技术， 秀丽隐杆线虫 (例如、Rosella 和 DCT-1/LGG-1 菌株）以及小鼠（mt-Keima）。结合使用这些线粒体自噬检测技术，包括跨物种评估，将提高线粒体自噬测量的准确性，并有助于更深入理解线粒体自噬在健康与疾病中的作用。
引言
线粒体自噬对线粒体的维持至关重要。线粒体参与多种细胞信号通路，是普遍存在的亚细胞器，负责细胞能量生成、细胞代谢以及钙稳态。1,2,3,4线粒体持续面临内源性和外源性因素的挑战，例如活性氧（ROS）和线粒体毒性物质，这些因素可导致线粒体损伤并引发一系列功能障碍 "老年" 以及功能失调的线粒体。受损线粒体的累积会降低ATP生成效率，同时增加有害活性氧（ROS）的产生，并与多种衰老相关疾病（如代谢性疾病、阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD））相关联。1,5,6为防止线粒体引发的细胞功能障碍，细胞必须能够特异性识别受损线粒体，并通过一种称为线粒体自噬（mitophagy）的细胞过程高效清除它们。mitophagy在健康与疾病中的重要作用凸显了建立准确且高效的方法以检测mitophagy的必要性 体外 和 体内.
线粒体自噬是一个多步骤过程，涉及多种蛋白质和蛋白质复合物
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方案
动物（雄性和雌性小鼠）在经认证的动物实验设施中出生并繁殖，相关操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用委员会的规定并获得其批准。实施安乐死的方法必须符合所有国家和机构的法规要求。
1. 人类细胞中线粒体自噬的检测
- 使用 mt-Keima 质粒检测线粒体自噬
注意：Keima 蛋白与线粒体靶向信号融合后简称为 mt-Keima，已被证明可用于 在体内 线粒体自噬检测。mt-Keima 是一种比率型pH敏感性荧光蛋白，在碱性或中性条件下呈现绿色荧光（激发波长458 nm），在酸性条件下呈现红色荧光（激发波长561 nm）。健康的线粒体存在于碱性或中性环境（pH 7-8），当转染mt-Keima后表现为绿色荧光。当线粒体发生线粒体自噬并与酸性溶酶体融合时，pH值降至4.5，含有mt-Keima的线粒体会发出红色荧光6,13,14重要的是，mt-Keima 对溶酶体蛋白酶具有抗性，从而能够对有丝分裂自噬进行较长时间的评估。以下方案适用于6孔板。- 第1天：使用原代人类细胞（例如，成纤维细胞）或永生化的人类细胞（例如，HeLa 细胞或 U2OS....
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结果
人类细胞中线粒体自噬的检测：
采用本实验方案，将人HeLa细胞转染mt-Keima质粒。健康细胞显示出结构良好的线粒体网络（GFP，488 nm），线粒体自噬现象较少（RFP，561 nm）。然而，经线粒体解偶联剂FCCP（30 µM，处理3小时）预处理的细胞，其线粒体自噬发生率显著增加（图1A）。此外，通过LAMP2与COXII的共定位来检测线粒体自噬（图1B）。
线粒体自噬的检测在 C. Elegans
我们在正常条件及氧化应激等线粒体自噬诱导条件下，检测了转基因线虫体壁肌细胞中表达D.......
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讨论
准确测量线粒体自噬在技术上具有挑战性。本文介绍了几种可靠的技术方法，可用于常见实验室实验模型中线粒体自噬的定性检测及自噬水平的定量分析。
为了获得可重复的数据，实验设计必须包含至少三次生物学重复。所有参与实验和分析的研究人员必须对实验分组信息保持盲态。此外，在图像采集过程中必须随机选择成像视野。对于细胞培养和C. elegans研究，应进行至少三次生物学重复。对于mt-Keima小鼠研究，建议使用足够数量的小鼠以达到统计学显著性。对于哺乳动物细胞，每次实验应分析30–100个细胞，并至少独立重复三次不同的实验。在这些步骤中实施质量控制可确保结果的可重复性。酵母中线粒体自噬的检测方法最近已在其他文献中进行了综述25。
体外线粒体自噬检测技术中有多个关键步骤。in vitro 转染 mt-Keima 蛋白时，转染效率至关重要，其取决于所用试剂和 DNA 的质量。因此，在不同条件下（e.g.，使用不同细胞系）优化转染效率是必要的。对.......
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披露
Bohr 实验室与 ChromaDex 和 GlaxoSmithKline 有合作研发协议（CRADA）安排。
致谢
我们感谢Atsushi Miyawaki博士和Richard J. Youle博士分享mt-Keima质粒及整合了mt-Keima的Hela细胞。我们感谢Raghavendra A. Shamanna和Deborah L. Croteau博士对本文稿的审阅。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）衰老研究所的院内研究计划（VAB）资助，并获得了2014-2015年度及2016-2017年度NIA实验室内部资助（EFF, VAB）。EFF还得到了HELSE SOR-OST RHF（项目编号：2017056）以及挪威研究理事会（项目编号：262175）的支持。
作者贡献：
EFF 设计了论文框架并起草了初稿；KP、NS、EMF、RDS、JSK、SAC、YH 和 ED 撰写了论文的不同部分；NT、JP、HN 和 VAB 对稿件进行了修改并提供了专业意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| mt-Keima 小鼠 | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 DNA 转染试剂 | Thermofisher | #11668027 | |
| Opti-MEM 培养基 (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | 无血清培养基 |
| mtKemia 质粒：pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII 抗体（小鼠） | abcam | #ab110258 | |
| LAMP2 抗体（兔） | NOVUS | #CD107b | |
| 红色荧光蛋白（RFP）波长 568 nm 的山羊抗兔二抗 | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 染料 |
| 绿色荧光蛋白（GFP）波长 488 nm 的山羊抗小鼠二抗 | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 染料 |
| 含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | #P36931 | |
| 6 孔板 | SIGMA Corning Costar | #CLS3516 | |
| 4 孔细胞培养腔室载玻片 | Thermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F 96 孔板 | Thermofisher | #152038 | |
| LC3B 抗体（兔） | NOVUS | #NB100-2220 | |
| DNA 抗体 | Progen Biotechnik | #anti-DNA 小鼠单克隆抗体, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | 含 DAPI 的抗荧光淬灭封片介质 |
| IN Cell 分析仪（荧光读板仪） | GE Healthcare Life Sciences | #IN Cell analyzer 2200 | |
| Eclipse TE-2000e 共聚焦显微镜 | Nikon | #TE-2000e | |
| 共定位分析软件 | Volocity | #Volocity 6.3 | 可选 Zeiss ZEN 2012 软件 |
| IN Cell Investigator 软件 | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| 细胞培养基 | Thermofisher | #DMEM–Dulbecco 改良 Eagle 培养基 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermofisher | #15140122 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| 细胞培养孵育箱 | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 水套式孵育箱 | |
| 落射荧光显微镜 | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| 相机 | Olympus | Olympus DP71 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| 共聚焦显微镜软件 | Zeiss | ZEN 2012 | |
| 图像分析软件 | Image J | 用于共定位分析等 | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| 统计分析软件 | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism 软件包 | |
| 制作线虫挑取针的材料 | Surepure Chemetals | #4655 | 挑针由 30 号 90% 铂金和 10% 铱合金丝制成 |
| IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | 材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios | 在 20 °C 下维持转基因动物培养 | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | 材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | 材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | 材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed::LGG-1 | 材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios | ||
| 百草枯溶液 | 制备方法见补充数据 | ||
| M9 缓冲液 | 制备方法见补充数据 | ||
| M9-左旋咪唑缓冲液 | 制备方法见补充数据 | ||
| 玻璃显微镜载玻片和盖玻片 | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| 外科镊子 | STERIS Animal Health | 19 件犬类绝育手术包（经济型） | |
| 外科剪刀 | STERIS Animal Health | 19 件犬类绝育手术包（经济型） | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 需用 ddH2O 将 10x PBS 稀释为 1x PBS |
| 摇床 | Fisher Scientific | #11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP 台式轨道小型开放式平台摇床套装 A |
| 2% 琼脂糖垫 | 制备方法见补充数据 | ||
| 振动切片机刀片 | World precision instruments | #BLADES-2 | 单刃刀片 |
| 金属板 | MSC | #78803988 | 厚度 0.012 英寸 × 宽度 6 英寸 × 长度 12 英寸，430 不锈钢板 |
| Triton X-100 | 去垢剂 | ||
| 甲基紫精二氯化物水合物 | Sigma-Aldrich | #856177 | 百草枯 |
| 线虫培养孵育箱 | AQUALYTIC | 用于维持 20 °C 的孵育环境 | |
| 解剖体视显微镜 | Olympus | SMZ645 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | AxioObserver Z1 | 用于线虫实验（步骤 2） |
| 落射荧光显微镜 | Zeiss | AxioImager Z2 | 用于线虫实验（步骤 2） |
| 紫外交联仪 | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 | 紫外光源；356 nm |
参考文献
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
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重印与许可
