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方法文章

体外 与 体内 检测人细胞、C. elegans 及小鼠中的线粒体自噬

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DOI：

10.3791/56301

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2017年11月22日

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1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

本文内容

摘要

线粒体自噬是清除受损线粒体的过程，对于维持线粒体稳态和健康至关重要。本文介绍了一些在人类细胞、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和小鼠中检测线粒体自噬的最新方法。

摘要

线粒体是细胞的能量工厂，以三磷酸腺苷（ATP）的形式产生细胞能量。线粒体功能障碍与生物衰老以及多种疾病相关，包括代谢性疾病、早衰综合征和神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。线粒体健康的维持依赖于线粒体生物发生以及通过线粒体自噬（mitophagy）高效清除受损线粒体。准确检测自噬/线粒体自噬的实验方法，尤其是在动物模型中，一直难以建立。近年来在线粒体自噬分子机制方面的研究进展，推动了新型线粒体自噬检测技术的开发。本文将介绍几种用于监测人源细胞中线粒体自噬的多功能技术， 秀丽隐杆线虫 (例如、Rosella 和 DCT-1/LGG-1 菌株）以及小鼠（mt-Keima）。结合使用这些线粒体自噬检测技术，包括跨物种评估，将提高线粒体自噬测量的准确性，并有助于更深入理解线粒体自噬在健康与疾病中的作用。

引言

线粒体自噬对线粒体的维持至关重要。线粒体参与多种细胞信号通路，是普遍存在的亚细胞器，负责细胞能量生成、细胞代谢以及钙稳态。1,2,3,4线粒体持续面临内源性和外源性因素的挑战，例如活性氧（ROS）和线粒体毒性物质，这些因素可导致线粒体损伤并引发一系列功能障碍 "老年" 以及功能失调的线粒体。受损线粒体的累积会降低ATP生成效率，同时增加有害活性氧（ROS）的产生，并与多种衰老相关疾病（如代谢性疾病、阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD））相关联。1,5,6为防止线粒体引发的细胞功能障碍，细胞必须能够特异性识别受损线粒体，并通过一种称为线粒体自噬（mitophagy）的细胞过程高效清除它们。mitophagy在健康与疾病中的重要作用凸显了建立准确且高效的方法以检测mitophagy的必要性 体外 和 体内.

线粒体自噬是一个多步骤过程，涉及多种蛋白质和蛋白质复合物5,7,8。简而言之，首先识别受损的线粒体，并由双层膜结构的吞噬泡（phagophore）将其包裹，该吞噬泡可起源于质膜、内质网、高尔基体、细胞核或线粒体自身9,10。球形的吞噬泡逐渐延伸并最终将线粒体完全封闭，形成线粒体自噬体（mitophagosome）。随后，线粒体自噬体与溶酶体融合，进行降解，形成自噬溶酶体（autolysosome），在其中受损的线粒体被降解并回收利用7,8。参与线粒体自噬的主要自噬相关蛋白包括：自噬相关蛋白7（ATG7）和Beclin1（起始阶段）、微管相关蛋白1A/1B轻链3（LC3-II）（在线虫C. elegans中为LGG-1）以及p62（吞噬泡组分），以及溶酶体相关膜糖蛋白2（LAMP2）6,7。此外，还有一些线粒体自噬特有的关键蛋白，包括PTEN诱导的假定激酶1（PINK-1）、Parkin1、核点蛋白52 kDa（NDP52）、optineurin、BCL2相互作用蛋白3样蛋白（NIX/BNIP3L）（在线虫C. elegans中为DCT-1）等5,6,11。

检测自噬水平变化的常用方法是通过LC3-II/LC3-I或LC3-II/actin的比值。然而，该方法缺乏特异性，因为该比值的升高可能反映自噬起始增加，也可能反映线粒体自噬小体与溶酶体融合受阻12。另一种方法是评估自噬标志物（例如，LC3）与线粒体蛋白（例如，线粒体外膜转运酶20（TOMM20，可被蛋白酶体降解））之间的共定位。然而，该方法仅能指示总体线粒体自噬水平的变化，无法判断阻滞发生的具体步骤。这一问题可通过平行使用溶酶体抑制剂（例如，E64d+Pepstatin A，简称EP）促使线粒体自噬小体累积而得以明确。基础状态下与EP处理后线粒体自噬小体数量的差异可反映线粒体自噬活性。这些局限性促使了新型线粒体自噬检测技术的发展。鉴于线粒体自噬在多种人类疾病中日益凸显的重要性，本文介绍几种可靠的线粒体自噬检测方法，供研究人员参考。我们涵盖了体外（in vitro）和体内（in vivo）检测技术，并建议联合使用多种方法以验证线粒体自噬的变化。

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方案

动物（雄性和雌性小鼠）在经认证的动物实验设施中出生并繁殖，相关操作均符合美国国立卫生研究院（NIH）动物护理与使用委员会的规定并获得其批准。实施安乐死的方法必须符合所有国家和机构的法规要求。

1. 人类细胞中线粒体自噬的检测

  1. 使用 mt-Keima 质粒检测线粒体自噬
    注意：Keima 蛋白与线粒体靶向信号融合后简称为 mt-Keima，已被证明可用于 在体内 线粒体自噬检测。mt-Keima 是一种比率型pH敏感性荧光蛋白，在碱性或中性条件下呈现绿色荧光（激发波长458 nm），在酸性条件下呈现红色荧光（激发波长561 nm）。健康的线粒体存在于碱性或中性环境（pH 7-8），当转染mt-Keima后表现为绿色荧光。当线粒体发生线粒体自噬并与酸性溶酶体融合时，pH值降至4.5，含有mt-Keima的线粒体会发出红色荧光6,13,14重要的是，mt-Keima 对溶酶体蛋白酶具有抗性，从而能够对有丝分裂自噬进行较长时间的评估。以下方案适用于6孔板。
    1. 第1天：使用原代人类细胞（例如，成纤维细胞）或永生化的人类细胞（例如，HeLa 细胞或 U2OS 细胞）。接种约 0.3–1 × 106 细胞/孔（根据细胞生长速率调整，以确保次日细胞汇合度达到70%）接种于6孔板中。将细胞培养于完全培养基（含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM））中，并在37℃细胞培养箱中孵育。 °C（20% O₂）2，5% CO2在6孔板中每孔加入1 mL完全细胞培养基。
      注意：可在该阶段进行基因过表达/敲低或药物处理6.
    2. 第2天：混合mt-Keima质粒DNA6 以及DNA转染试剂（适用于6孔板一个孔的混合物）。
      1. 稀释15 µL 的 DNA 转染试剂与 150 µ根据制造商方案，加入无血清培养基 L。
      2. 稀释2-5 µ微克 mt-Keima 质粒 DNA 与 150 µ无血清培养基 L
      3. 将稀释的 mt-Keima 质粒加入稀释的 DNA 转染试剂中，涡旋振荡 10 秒，室温孵育 10 分钟。
        注意：根据培养板尺寸的不同，可能需要优化DNA转染条件（详见试剂盒生产商的说明书）。
      4. 将DNA/转染试剂混合物逐滴加入细胞中，然后轻轻摇动培养板5-10秒，直至溶液完全混匀。
    3. 第3天：更换培养基，弃去含DNA转染试剂的培养基，每孔加入1 mL新鲜的完全细胞培养基。
    4. 第4天：使用共聚焦显微镜对细胞进行成像6使用两个成像通道：绿色通道（激发波长458 nm，发射波长570–695 nm）用于观察正常线粒体，红色通道（激发波长561 nm，发射波长570–695 nm）用于观察正在进行线粒体自噬的线粒体。在40倍放大下随机选取20个区域进行成像，每个孔覆盖总计100–200个细胞。
    5. 进行数据分析。计算 "线粒体自噬指数" （发生线粒体自噬的线粒体所占百分比），使用图像分析软件定量红、绿两个荧光通道的荧光强度：计算红色荧光与红色加绿色荧光的比值，再乘以1006.
      注意：转染的替代方法包括使用稳定表达 mt-Keima 的 HeLa 细胞系14由于HeLa细胞不表达Parkin，因此必须在该细胞系中稳定表达Parkin，以研究依赖Parkin的线粒体自噬。
  2. 使用细胞色素C氧化酶亚基II（COXII）与LAMP2共定位检测线粒体自噬
    注意：COXII 是线粒体基因组编码的线粒体内膜蛋白。“线粒体自噬指数”等于与 LAMP2 共定位的 COXII 占 COXII 总量的百分比。
    1. 将HeLa细胞（或步骤1.1.1中提及的其他感兴趣细胞）接种于4孔细胞培养板中（1-5） × 104 37℃细胞培养箱中，每孔1 mL完全细胞培养基培养细胞 °C（20% O₂）2，5% CO2）过夜。
    2. 加入 3.0 µ10 mM 碳酰氰-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP）的 L 体积，在细胞培养箱中孵育 3 小时（步骤 1.2.1）。
      注意：也可使用其他影响线粒体自噬的药物。
    3. 使用1 mL移液器吸除培养基，用1 mL/孔的冷（0–4 °C）磷酸盐缓冲液洗涤细胞两次。 °C) 加入 1× PBS，静置 10–30 秒后进行下一次洗涤。随后每孔加入 0.5 mL 溶于 1× PBS 的 3.7% 多聚甲醛（PFA），冰上孵育 10 分钟以固定细胞。
      注意：PFA 为有毒物质。使用 PFA 时应在通风橱中操作。
    4. 使用1 mL移液器弃去PFA溶液，用冰冷的1×PBS洗涤细胞两次（每次1 mL/孔；每次洗涤前让溶液静置10秒），然后在冰上用每孔1 mL的0.25%去垢剂（溶于1×PBS中）对细胞进行透化处理，持续10分钟。
    5. 弃去透化缓冲液，用预冷的1×PBS轻柔洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去溶液（每次洗涤间隔静置10秒）。于4℃条件下，用含5% FBS的1×PBS溶液每孔1 mL封闭细胞，过夜。 °C. 覆盖培养室以防止水分流失。
    6. 在含5% FBS的1×PBS中配制COXII抗体（小鼠，1:250稀释）和LAMP2抗体（兔，1:20–1:50稀释）的混合抗体溶液，每孔0.5 mL，冰上保存0.5–1小时。
    7. 从冷室中取出4孔板，用1 mL移液器弃去封闭液。用1 mL/孔的冰冷1×PBS轻柔洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去溶液（每次洗涤间静置10秒），然后每孔加入0.5 mL混合抗体溶液。于37℃孵育 °在低速摇床上于 C 下孵育 1 小时。
    8. 使用1 mL移液器弃去一抗溶液，用1 mL/孔的冷1×PBS轻柔洗涤细胞三次，每次洗涤后弃去溶液。每次加入PBS后静置10秒再进行下一次洗涤。每孔加入1 mL荧光标记的二抗例如，用含5% FBS的1×PBS以1:250稀释的红色荧光蛋白（RFP，激发波长568 nm）标记的山羊抗兔抗体用于LAMP2；以及用含5% FBS的1×PBS以1:250稀释的绿色荧光蛋白（GFP，激发波长488 nm）标记的山羊抗小鼠抗体用于COXII。用铝箔包裹4孔腔室载玻片，在37℃孵育 °在低速摇床上于 C 下孵育 1 小时。
    9. 用1 mL移液器弃去二抗溶液。用1 mL/孔的冷1×PBS轻柔洗涤细胞6次，每次洗涤前让溶液静置1分钟。
    10. 用50 μL封片液封片 µ每孔加入含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，并加盖盖玻片。
    11. 使用66倍油镜在共聚焦显微镜下对细胞成像（可采用拼接扫描/马赛克图像以增加软件成像的细胞数量）。保持相同的设置，例如通道曝光时间、数字增益、数字偏移 等等。 在整个成像过程中（详见软件操作说明）15.
    12. 使用共定位分析软件对至少20个随机选取的100个细胞图像进行定量分析15. 使用 "闭合贝塞尔曲线" 使用该功能选择完整的单个细胞。比较GFP与RFP的皮尔逊共定位系数（加权或未加权），以确定所分析细胞中的线粒体自噬水平。在整个分析过程中保持共定位分析软件中水平和垂直十字线的数值一致。为准确设置这些十字线，需额外准备两组细胞，分别标记COXII和LAMP2，然后将十字线直接置于各通道像素分布的上方15 （详见软件使用说明）。
  3. 一种用于有丝分裂吞噬筛选的高通量成像检测方法
    注意：从大型化合物库中对诱导或抑制线粒体自噬的化合物进行高通量筛选在技术上具有较高难度。基于线粒体与自噬体共定位的成像技术是一种更为简便但高度敏感的线粒体自噬筛选替代方法。16.
    1. 第1天：接种细胞（例如，人原代成纤维细胞以每孔5,000个细胞/100 μL培养基接种于96孔板（见步骤1.1.1）。
    2. 第2天：将第二天的细胞用FCCP或其他感兴趣的化合物处理，孵育指定时间（见步骤1.2.2）。
    3. 按照步骤1.2.2-1.2.9操作，使用COXII（小鼠来源，1:250稀释，溶于含5% FBS的1x PBS）和LC3B（兔来源，1:100-1:200稀释，溶于含5% FBS的1x PBS）的一抗。或者，也可使用COXII和LAMP2的一抗。
    4. 使用荧光读板仪对细胞进行成像16在随机选择的视野中采集图像，每个孔至少采集500个细胞。
    5. 使用定制化细胞分析仪方案分析数据16.

2. 在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中检测线粒体自噬

注意：线虫 C. elegans 可作为在生物体水平上检测线粒体自噬的实验平台。有两种品系可用于监测线粒体自噬：（1）靶向线粒体的 Rosella（mtRosella），或（2）将线粒体自噬受体 DCT-1 与 GFP 融合，并同时表达自噬体标志物 LGG-1 与 Discosoma sp. 红色荧光蛋白（DsRed）的融合蛋白5,17。

  1. 使用 Rosella 生物传感器监测线粒体自噬
    注意：Rosella 是一种分子生物传感器，由对 pH 不敏感的 DsRed 与对 pH 敏感的 GFP 变体融合而成。该生物传感器利用溶酶体（pH ~4.5）与其他细胞区室之间的 pH 差异，已成功用于监测线粒体自噬 酿酒酵母 以及若干哺乳动物细胞系，例如 HeLa、HEK293 和 HCT11618,19我们改进了这一多功能双荧光报告系统，并构建了转基因模型 秀丽隐杆线虫 在体壁肌细胞中表达线粒体靶向 Rosella（mtRosella）的线虫。线粒体自噬的诱导表现为 mtRosella 荧光的 GFP/DsRed 比值降低。
    1. 第1天：挑选在体壁肌细胞中表达线粒体靶向Rosella（mtRosella）的L4期幼虫，转移到铺有大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上 E. coli （OP50）使用解剖显微镜5. 每个3.5 cm培养皿中放置10–20条线虫，至少设置三个重复培养皿。将线虫置于20℃的标准温度下培养。 °C5.
      注意：有关线虫解剖学（包括L4幼虫的鉴定）请参见参考文献20，以及制作用于将线虫从一个位置转移到另一个位置的挑虫针的方法21.
    2. 第5天：通过挑选15–20条L4期转基因幼虫，将其转移至新鲜涂布OP50的NGM平板上，以实现线虫的同步化。每种实验条件至少使用五个平板。
    3. 第7天：准备用于线粒体自噬相关药物或阳性对照的溶剂对照平板。
      1. 杀死 E. coli 在NGM平板上接种OP50细菌，暴露15分钟，使用222 µW/cm2 （强度）的紫外光，以确保诱导线粒体自噬的化合物不会被细菌代谢。平板必须暴露于2,000 J/m²的紫外光下2.
        注：所需曝光时间（秒）= 2,000/（强度（以 µW/cm2)*100).
      2. 将待测化合物加入已铺有菌的NGM平板表面。作为阴性对照，向对照组平板中加入等量的化合物溶剂（如用于溶解化合物的二甲基亚砜（DMSO））。为诱导线粒体自噬的阳性对照，使用线粒体毒性剂百草枯（终浓度8 mM）。加入含有10 µ8 M 百草枯储备液 10 μL 与 190 μL 水混合 µL of ddH₂O2O 点于琼脂平板顶部用于处理组。对于对照组，加入含有 10 的溶液 µDMSO 190 L µL of ddH2琼脂平板顶部的 O
        注意：百草枯工作液可在 4 ℃ 保存 1 个月 °C.
      3. 轻轻摇晃培养板，直至药物或溶剂覆盖整个表面。将培养板盖上盖子，在室温下静置干燥至少1小时，然后再转移线虫。
        注意：药物平板也可通过在液态NGM凝固前加入药物来制备。
    4. 第7天：将步骤2.1.2中准备的10–20只出生2天的转基因成年线虫转移至含有百草枯、待测化合物或溶剂（DMSO）的培养板中。将转基因线虫在20 °C下培养 °37°C 培养 2 天。
    5. 第9天：制备2%琼脂糖垫（参见 补充材料）。然后加入一滴（10 µ每片载玻片上加入含20 mM左旋咪唑的M9溶液20 μL。将转基因动物置于M9-左旋咪唑液滴中以固定，用于成像。轻轻盖上盖玻片。
    6. 使用连接在落射荧光显微镜上的相机捕获单个转基因线虫。以10倍放大倍数获取在体壁肌细胞中表达mtRosella的完整转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的荧光图像5保存采集的图像。
    7. 使用 ImageJ 软件处理所获得的图像。为避免肠道组织的自发荧光干扰，分析位于线虫头部的体壁肌细胞。仅针对每只动物头部区域的荧光图像，测量其平均像素强度值和总面积。如需分析特定兴趣区域：
      1. 在“图像”和“颜色”下拉菜单中选择“分通道”以转换图像。
      2. 使用“自由选择”工具来捕获感兴趣的荧光区域。
      3. 在“分析”下拉菜单中选择“测量”命令，并进行像素强度分析。
      4. 应通过将荧光强度除以分析的总面积来对像素强度进行归一化。归一化后，计算 GFP 与 DsRed 的比值。22.
    8. 使用统计分析软件进行学生t检验 t-检验（两组间比较）或ANOVA（多组间比较）用于统计分析 p < 0.05 作为显著性水平5,17.
  2. 利用DCT-1与LGG-1共定位评估线粒体自噬
    注意：DCT-1 是一种定位于线粒体外膜的蛋白，在应激条件下作为线粒体自噬受体发挥作用，其功能类似于哺乳动物中的同源蛋白 BNIP3 和 NIX/BNIP3L5因此，通过检测线粒体自噬受体DCT-1与自噬小体膜蛋白LGG-1（哺乳动物LC3的同源物）之间的共定位来评估线粒体自噬的启动。
    1. 第1天：挑选在体壁肌细胞中同时表达DCT-1::GFP和DsRed::LGG-1的转基因动物的L4期幼虫5 接种到涂有OP50的NGM平板上。每3.5 cm平板放置5-10条线虫，至少使用三个平板。将线虫在20℃培养 °C.
      注意：转基因位于不同的质粒上，且未整合到基因组中。挑选同时携带两者的线虫 rol-6(su1006) 和 pmyo-2 GFP 共转化标记。仅含有两种共转化标记的转基因线虫才会在体壁肌细胞中同时表达 DCT-1::GFP 和 DsRed::LGG-1。
    2. 按照 2.1.2–2.1.5 步骤进行操作。
    3. 使用连接到共聚焦显微镜的相机对单个体壁肌细胞进行成像5,23使用63倍放大倍数检测整个体壁肌细胞的边界，并采集z轴层扫图像。也可使用更高放大倍数。
    4. 使用共聚焦软件打开并处理所获取的图像。线粒体自噬的启动表现为线粒体自噬受体（DCT-1::GFP）与自噬小体标志物（DsRed::LGG-1）的共定位。在每组体壁肌细胞图像序列中，手动测量共定位事件。5必须保持所有显微镜和相机设置（物镜和放大倍数、滤光片、曝光时间、分辨率、激光强度、增益）不变， 等等。) 在整个实验过程中保持一致。所有设置均应记录。
    5. 使用统计分析软件进行学生t检验 t-检验（两组间比较）或ANOVA（多组间比较）用于统计分析 p < 0.05 作为显著性水平5,17对于双向比较，使用 Student's t-测试（p < 0.05 被认为具有显著性）。对于多重比较，采用单因素方差分析（ANOVA），并进行校正 事后 Bonferroni 检验。我们建议每种实验条件下分析至少 50–70 只动物或 30–50 个体壁肌细胞。实验至少重复三次。

3. 小鼠中线粒体自噬的检测

注意：以往检测小鼠线粒体自噬的方法繁琐、灵敏度低且难以定量。现在可利用表达线粒体靶向荧光报告蛋白 Keima（mt-Keima）的转基因小鼠模型，在多种生理和病理生理条件下评估线粒体自噬水平。

  1. 使用经机构动物护理和使用委员会批准的方案对小鼠实施安乐死14.
  2. 将小鼠（腹侧朝上）用针固定在操作平台上，使用显微手术剪刀和镊子在下腹部做切口以暴露肝脏24. 剪取一块肝脏（例如右叶的一块组织，位于1处 × 1 × 使用显微手术剪和镊子剪取约1厘米的组织。
    注意：在小鼠中检测线粒体自噬较为复杂，需要具备小鼠解剖学知识以及熟练的小鼠操作和小鼠手术技能。本方案仅提供该方法的基本关键步骤，更详细的方法可参见相关文献24.
  3. 将肝脏样本置于冰上的金属板上，以快速冷却组织。保持组织在低温金属板上，并尽快进行处理。最佳情况下，应在解剖后1 h内使用。
  4. 用弯头镊子提起肝组织样本，并用5 mL预冷的1x PBS冲洗。
  5. 将肝脏转移至培养皿中（Ø 100 mm）置于冰上，使用刮勺的勺端进行操作。
  6. 使用单刃刀片将肝组织样本手工切成0.5–1 mm厚的切片。
  7. 使用显微手术镊子将组织切片小心转移至玻璃底培养皿中。
  8. 用镊子小心地将肝组织切片展平并置于底部。
  9. 用3-5滴冰冷的1×PBS覆盖切下的肝脏组织。
    注意：建议使用 DAPI 染色来识别某些组织中的目标区域例如, 脑24为验证红色 mt-Keima 信号与溶酶体的共定位，可使用溶酶体染料（如葡聚糖级联蓝和溶酶传感器）进行检测。24.
  10. 通过连续两次激发，在共聚焦显微镜下对组织切片进行成像24设置两个成像通道： "绿色" mt-Keima 通道（激发 458 nm，发射 570–695 nm 范围）和 "红色" mt-Keima（激发波长561 nm，发射波长范围570–695 nm）。不同实验条件下应保持成像参数一致。为提高成像效率，可同时分析两只动物。

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结果

人类细胞中线粒体自噬的检测：

采用本实验方案，将人HeLa细胞转染mt-Keima质粒。健康细胞显示出结构良好的线粒体网络（GFP，488 nm），线粒体自噬现象较少（RFP，561 nm）。然而，经线粒体解偶联剂FCCP（30 µM，处理3小时）预处理的细胞，其线粒体自噬发生率显著增加（图1A）。此外，通过LAMP2与COXII的共定位来检测线粒体自噬（图1B）。

线粒体自噬的检测在 C. Elegans

我们在正常条件及氧化应激等线粒体自噬诱导条件下，检测了转基因线虫体壁肌细胞中表达D...

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讨论

准确测量线粒体自噬在技术上具有挑战性。本文介绍了几种可靠的技术方法，可用于常见实验室实验模型中线粒体自噬的定性检测及自噬水平的定量分析。

为了获得可重复的数据，实验设计必须包含至少三次生物学重复。所有参与实验和分析的研究人员必须对实验分组信息保持盲态。此外，在图像采集过程中必须随机选择成像视野。对于细胞培养和C. elegans研究，应进行至少三次生物学重复。对于mt-Keima小鼠研究，建议使用足够数量的小鼠以达到统计学显著性。对于哺乳动物细胞，每次实验应分析30–100个细胞，并至少独立重复三次不同的实验。在这些步骤中实施质量控制可确保结果的可重复性。酵母中线粒体自噬的检测方法最近已在其他文献中进行了综述25。

体外线粒体自噬检测技术中有多个关键步骤。in vitro 转染 mt-Keima 蛋白时，转染效率至关重要，其取决于所用试剂和 DNA 的质量。因此，在不同条件下（e.g.，使用不同细胞系）优化转染效率是必要的。对...

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披露

Bohr 实验室与 ChromaDex 和 GlaxoSmithKline 有合作研发协议（CRADA）安排。

致谢

我们感谢Atsushi Miyawaki博士和Richard J. Youle博士分享mt-Keima质粒及整合了mt-Keima的Hela细胞。我们感谢Raghavendra A. Shamanna和Deborah L. Croteau博士对本文稿的审阅。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）衰老研究所的院内研究计划（VAB）资助，并获得了2014-2015年度及2016-2017年度NIA实验室内部资助（EFF, VAB）。EFF还得到了HELSE SOR-OST RHF（项目编号：2017056）以及挪威研究理事会（项目编号：262175）的支持。

作者贡献：

EFF 设计了论文框架并起草了初稿；KP、NS、EMF、RDS、JSK、SAC、YH 和 ED 撰写了论文的不同部分；NT、JP、HN 和 VAB 对稿件进行了修改并提供了专业意见。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
mt-Keima 小鼠Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA 转染试剂Thermofisher#11668027
Opti-MEM 培养基 (Gibco)Thermofisher#31985062无血清培养基
mtKemia 质粒：pCHAC-mt-mKeimaaddgene#72342
COXII 抗体（小鼠）abcam#ab110258
LAMP2 抗体（兔）NOVUS#CD107b
红色荧光蛋白（RFP）波长 568 nm 的山羊抗兔二抗Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568 染料
绿色荧光蛋白（GFP）波长 488 nm 的山羊抗小鼠二抗Thermofisher#Z25002Alexa Fluor 488 染料
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Invitrogen#P36931
6 孔板SIGMA
Corning Costar		#CLS3516
4 孔细胞培养腔室载玻片Thermofisher, Nunc Lab-Tek#171080
Nunc F 96 孔板Thermofisher#152038
LC3B 抗体（兔）NOVUS#NB100-2220
DNA 抗体Progen Biotechnik#anti-DNA 小鼠单克隆抗体, AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306含 DAPI 的抗荧光淬灭封片介质
IN Cell 分析仪（荧光读板仪）GE Healthcare Life Sciences#IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e 共聚焦显微镜Nikon#TE-2000e
共定位分析软件Volocity#Volocity 6.3可选 Zeiss ZEN 2012 软件
IN Cell Investigator 软件GE Healthcare Life Sciences#28408974
细胞培养基Thermofisher#DMEM–Dulbecco 改良 Eagle 培养基
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermofisher#15140122
胎牛血清Sigma-Aldrich#12003C-1000ML
细胞培养孵育箱Thermofisher#Thermo Forma 3110 CO2 水套式孵育箱
落射荧光显微镜ZeissZeiss Axio Imager Z2
相机OlympusOlympus DP71
共聚焦显微镜ZeissZeiss Axio Observer Z1
共聚焦显微镜软件ZeissZEN 2012
图像分析软件Image J用于共定位分析等https://imagej.nih.gov/ij/
统计分析软件GraphPad Software Inc., San Diego, USAGraphPad Prism 软件包
制作线虫挑取针的材料Surepure Chemetals#4655挑针由 30 号 90% 铂金和 10% 铱合金丝制成
IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella]材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios在 20 °C 下维持转基因动物培养
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1材料索取请联系 Tavernarakis Nektarios
百草枯溶液制备方法见补充数据
M9 缓冲液制备方法见补充数据
M9-左旋咪唑缓冲液制备方法见补充数据
玻璃显微镜载玻片和盖玻片Fisher Scientific#B9992000
外科镊子STERIS Animal Health19 件犬类绝育手术包（经济型）
外科剪刀STERIS Animal Health19 件犬类绝育手术包（经济型）
1x PBSThermofisher#AM9625需用 ddH2O 将 10x PBS 稀释为 1x PBS
摇床Fisher Scientific#11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP 台式轨道小型开放式平台摇床套装 A
2% 琼脂糖垫制备方法见补充数据
振动切片机刀片World precision instruments#BLADES-2单刃刀片
金属板MSC#78803988厚度 0.012 英寸 × 宽度 6 英寸 × 长度 12 英寸，430 不锈钢板
Triton X-100去垢剂
甲基紫精二氯化物水合物Sigma-Aldrich#856177百草枯
线虫培养孵育箱AQUALYTIC用于维持 20 °C 的孵育环境
解剖体视显微镜OlympusSMZ645
共聚焦显微镜ZeissAxioObserver Z1用于线虫实验（步骤 2）
落射荧光显微镜ZeissAxioImager Z2用于线虫实验（步骤 2）
紫外交联仪Vilber LourmatBIO-LINK – BLX-E365紫外光源；356 nm

参考文献

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Mito Keima C elegans HeLa FCCP LAMP2 COXII
体外 与 体内 检测人细胞、C. elegans 及小鼠中的线粒体自噬
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