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方法文章

活体中卵泡干细胞谱系细胞内pH成像方法 果蝇 卵巢组织

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DOI：

10.3791/56316

⸱

2017年9月26日

 ,  , 
1Departments of Anatomy and OB/GYN-RS, University of California, San Francisco

本文内容

摘要

我们提供一种用于活体成像上皮干细胞谱系中细胞内pH的实验方案 果蝇 卵巢组织。我们描述了生成表达pH生物传感器mCherry::pHluorin的转基因果蝇的方法，利用定量荧光成像技术对生物传感器进行成像，建立标准曲线，并将荧光强度值转换为pH值。

摘要

细胞内 pH 值（pHi）的变化在调控多种细胞功能（包括代谢、增殖和分化）中发挥着重要作用。通常，pHi 动态变化是在培养细胞中测定的，这类细胞易于进行 pHi 的测量和实验操控。然而，近年来新工具和新方法的发展使得在完整、活体组织中研究 pHi 动态成为可能。对于果蝇（Drosophila）研究而言，一个重要进展是构建了一种携带 pHi 生物传感器 mCherry::pHluorin 的转基因品系。本文中，我们描述了一种常规用于活体果蝇（Drosophila）卵管成像的实验方案，以测定 mCherry::pHluorin 转基因野生型品系中上皮滤泡干细胞（FSC）谱系的 pHi 值；但本文所述方法也可轻松适用于其他组织，包括翅盘和眼上皮组织。我们详细介绍了在 FSC 谱系中表达 mCherry::pHluorin、在活体成像过程中维持卵巢组织活性，以及获取和分析图像以获得 pHi 值的技术方法。

引言

近期研究揭示了细胞内pH值变化在细胞分化和发育异常过程中的作用 体内1,2这些研究发现，相同类型且处于相同分化阶段的细胞内pH值（pHi）表现出显著的一致性，但当细胞从一个阶段过渡到另一个阶段时，pHi会发生变化。在某些情况下，阻断pHi的变化会部分干扰细胞分化，这表明pHi的改变不仅仅是细胞命运变化的伴随结果，反而可能有助于推动细胞命运的转变，或许通过影响pH敏感的调控蛋白或分化所需化学反应来实现。未来的研究有望进一步揭示pHi动态在多种生物学过程中所扮演的不同角色 体内然而，研究分化过程中pHi的一个挑战是 体内 准确测量细胞内pH值（pHi）至关重要。与其他分化特征（如细胞形态变化和基因表达改变）不同，pHi是细胞的一种不稳定的化学特性，在经过常规固定和透化处理的细胞中无法保持。此外，由于实验操作导致处于应激或死亡状态的细胞，其pHi也可能不稳定。因此，在测量pHi时，必须保持细胞存活并尽可能处于健康状态。目前已有多种活细胞染料可用于有效地测定培养细胞的pHi3，但在许多情况下，它们并不适用 体内 研究中，因为它们无法充分深入且均匀地穿透组织，从而难以提供准确的测量结果。

为解决染料渗透不良的问题，我们及其他研究者已采用一种基因编码的探针 mCherry::pHluorin4,5,6,7，该探针可在特定的目标细胞类型中表达，并用于活体组织成像。pHluorin 是 GFP 的一种变体，具有较高的 pKa 值（约 7.0，而 GFP 约为 4.0），在较高 pH 条件下更易正确折叠；因此，细胞内一群 pHluorin 分子所发射的总荧光强度随细胞内 pH（pHi）升高而增强8。重要的是，其荧光强度在正常的胞质 pH 范围内呈线性关系。相比之下，mCherry（pKa 约为 4.5）的荧光在胞质 pH 范围内对 pH 变化不敏感。这两种报告蛋白通过共价连接形成单一的嵌合蛋白，由一个开放阅读框编码，因此始终以等量存在。因此，pHluorin 与 mCherry 荧光强度的比值可提供一种归一化于每个细胞探针浓度的 pHi 测量方法。随后，可通过标准曲线将这些比值转换为 pHi 值的估计值，该标准曲线是通过获取已平衡至已知 pH 值的组织中的 pHluorin 与 mCherry 荧光比值得到的。

此处，我们描述了利用 mCherry::pHluorin 测量上皮性滤泡干细胞谱系细胞内 pH 值（pHi）的方法 果蝇 卵巢。这一特征明确的组织已被用于模拟上皮生物学的多个不同方面，例如干细胞的自我更新与分化。9,10,11集体细胞迁移12以及细胞极性的建立与维持13,14滤泡上皮由两个位于组织前缘、称为生殖囊的结构中的滤泡干细胞（FSCs）产生。15,16这些细胞在成体阶段会定期分裂，以实现自我更新并产生子代细胞，即前体滤泡细胞（pFCs）。这些前体细胞可重新进入干细胞微环境成为滤泡干细胞（FSC），或分化为三种不同的滤泡细胞类型：极性细胞、柄细胞或主体滤泡细胞。我们先前的研究表明，在野生型组织中，细胞内pH值（pHi）在分化的早期阶段持续上升，从FSC中的约6.8，上升至pFC中的7.0，再进一步升至滤泡细胞中的7.3。2通过RNAi敲低一种普遍表达的钠/质子交换体来阻断这种增加， DNhe2，严重损害pFC分化，而通过过表达提高pHi则 DNhe2 导致轻微的过度分化表型。这些结果表明，早期FSC谱系中的pHi能够稳定维持，并且可以通过实验手段进行升高或降低 体内此处所述方法可用于测量野生型组织或多种突变型组织中的细胞内pH值（pHi），包括利用特定Gal4进行RNAi敲低或过表达的组织，以及有丝分裂克隆组织。

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方案

注意：为了测量 FSC 谱系中的胞内 pH（pHi），我们计算在生理条件下 FSC、pFC 以及滤泡细胞中 pHluorin 与 mCherry 荧光强度的比值，并利用每种细胞类型的标准化校准曲线将这些比值转换为 pHi 值7。首先，进行活体成像实验，测量在含有 NaHCO3 的缓冲液中解剖所得的卵原体组织内 pHluorin 和 mCherry 的荧光强度，该缓冲液可模拟生理条件1,7。接着，通过在无 Na+、含 K+ 的缓冲液中测定 pHluorin 与 mCherry 的荧光强度来生成标准曲线，该缓冲液中加入离子载体尼日里菌素（nigericin），并调节至两个不同的 pH 值：6.5 和 7.5。在尼日里菌素存在的情况下，胞内 pH 通过质膜与缓冲液的 pH 达到平衡，从而使胞内 pH 与细胞外 pH 一致。最后，利用该标准曲线将 pHluorin 与 mCherry 的荧光强度比值转换为估计的 pHi 值。

1. 测定pHi前的准备：试验前步骤 体内

注意：用于测量细胞内pH值（pHi） 体内mCherry::pHluorin 转基因必须在目标细胞类型中表达。以下是一些在 FSC 谱系中生成 pHluorin 转基因果蝇的常用方法。生成 mCherry::pHluorin 克隆对于鉴定位于 FSC 克隆前缘的 FSC 尤为有用。组织特异性表达 mCherry::pHluorin 可用于测量整个组织中的细胞内 pH 值，且在与 RNAi 或转基因表达联用时更为便捷。

  1. 转基因pHluorin果蝇的制备
    1. mCherry::pHluorin标记的FSC克隆
      1. 为制备mCherry::pHluorin FSC克隆，将UAS-mCherry::pHluorin1与Act-Gal4翻转品系或其他具有Flp/FRT可诱导Gal4系统的品系杂交。
      2. 为制备热休克可诱导克隆，在成虫F1羽化后2天内，每隔约12小时，在37 °C水浴中于空瓶内进行1小时热休克，共进行四次。
      3. 为确保在此期间果蝇正常生长及卵子发生速率达到最大，自克隆诱导后至少6天内每日提供新鲜湿酵母（干面包酵母与水按等比例混合），以维持果蝇生长。
    2. 组织特异性mCherry::pHluorin表达
    3. 将UAS-mCherry::pHluorin1与滤泡细胞特异性驱动子y1w*;P{GawB}10930/CyO（Bloomington编号：7023）杂交。
    4. 果蝇开始羽化后3天，收集并将其置于含有湿酵母的培养瓶中，在解剖前至少维持24小时。
  2. 溶液配制
    注意：以下缓冲液需在实验当天配制，因为缓冲液的pH值和溶质浓度可能随时间发生变化。
    1. 配制碳酸氢盐缓冲液、尼日霉素溶液和解剖缓冲液。按表中所列顺序依次加入各组分，以避免沉淀形成（参见表1、表2和表3）。

2. 实验：测量FSC谱系中的细胞内pH值

注意：针对碳酸氢盐缓冲液以及两种尼日里菌素缓冲液条件的解剖、装片和活体成像步骤可能需要执行两次：第一次用于确定显微镜设置，第二次用于收集实验数据。更多信息请参见下文第 2.2 节。

  1. 解剖与封片
    注意：有关执行此步骤所需的材料，请参见 图1 和 材料表用于3D打印的固定腔室，3D打印机文件作为 补充文件 1 和 补充文件 2.
    1. 解剖：
      1. 通过在3D打印的载样腔较平整的一侧涂抹一层薄薄的真空脂来制备载样腔。将该侧放置在22 × 40 mm盖玻片上，以密封盖玻片与载样腔。
    2. 从雌性成年果蝇中解剖卵巢，置于 500 µL 解剖缓冲液（碳酸氢盐或尼日里菌素缓冲液）中 表3)
      1. 用 CO2 麻醉 3 - 4 只果蝇2 气体麻醉并将果蝇转移至通有 CO 的果蝇操作垫上2 气体
      2. 用镊子夹取一只麻醉后的果蝇，放入解剖液中。
      3. 用一把镊子夹住果蝇的胸部，同时用另一把镊子轻轻拉扯其腹部末端，直至卵巢暴露出来。
      4. 将卵巢从其他器官上分离后，使用22号针头分离卵管。1/2 注射器针头。小心地将肌鞘与卵巢分离，并将单个卵小管从卵小管簇中分离出来。一种有效的分离肌鞘技术是：用一根注射器针头固定卵小管簇的前端，然后沿单个卵小管的长度方向向下轻划。
      5. 将解剖后的卵巢在解剖液中孵育恰好10分钟，再进行后续封片步骤，以确保细胞内pH有足够时间与尼日霉素解剖液的pH完全平衡。
        注意：务必去除卵管的肌鞘。肌鞘可能减弱荧光信号，导致难以通过刀豆素A识别单个细胞，并可能在活体成像过程中引起卵管自发移动。
    3. 安装
      1. 在安装腔室内的玻璃盖玻片上滴加少量解剖液。
      2. 使用镊子转移分离的卵管。
      3. 将较晚期的卵室与带有早期卵室的卵原区分离，并尽量确保解剖得到的卵原区位于解剖液滴的中央。
      4. 在直径12毫米的圆形盖玻片相对两侧各加两小滴指甲油，静置晾干约10秒。
      5. 将圆形盖玻片放置在含有分离卵原体的解剖液滴上，使带有指甲油的一侧朝下并接触解剖液。按压带有指甲油的盖玻片边缘部分，以压平并固定卵原体的位置。建议使用较旧的指甲油，因为在固定过程中其在盖玻片表面的扩散较少。
      6. 用额外的解剖液填充封片腔室。可使用不含刀豆蛋白A染料的特定缓冲液来填充腔室。
        注意：解剖和封片的总时间不应超过15分钟。这是为了尽量减少组织损伤和细胞死亡的影响。
  2. 活体成像：
    注意：在此步骤中，首先采集碳酸氢盐条件及两种尼日霉素条件下的图像，以确定合适的显微镜设置；根据需要调整显微镜参数，然后采集实验数据所需的图像。使用能够进行三通道成像的共聚焦显微镜：GFP（475 激发/509 发射）、mCherry（575 激发/610 发射）和远红光（633 激发/647 发射）。
    注意：设置显微镜参数：所采集图像的像素强度将用于定量分析以估算细胞内pH值（pHi），因此必须确保每组图像中信号的强度值既不过低也不饱和。图像可捕获的强度范围由图像位深度决定。许多情况下系统默认生成8位图像，但我们建议以16位图像进行数据采集，因其具有更宽的动态范围。必须尽量减少荧光通道间的串扰，因此应调整设置，使每种荧光染料的发射光谱采集范围不发生重叠。为测试该设置，可使用GFP的激发光谱进行激发，并在mCherry的发射光谱范围内采集样本图像 反之亦然如果设置已正确调整，则两种情况下均应无信号。设置显微镜参数（即，激光共聚焦显微镜的电压设置、激光功率和针孔大小）以确保所有三组图像中信号的像素强度均处于图像文件的动态范围内。在所有实验中，我们使用配备40倍物镜的白光激光共聚焦显微镜采集1024 × 1024格式的16位图像，并根据需要优化每次实验的电压增益。例如，在某次实验中，我们将GFP、mCherry和远红荧光的电压增益分别设置为37.8%、72.9%和260%。
    1. 在 pH 6.5 的尼日霉素解剖缓冲液中对卵管进行成像，并调整设置，使 pHluorin 和 mCherry 图像的像素强度较低，但不低于相机的检测限。
    2. 在pH 7.5的尼日霉素解剖缓冲液中对另一组卵管进行成像，并调整设置，使pHluorin和mCherry图像的像素强度较高但未达到饱和。
    3. 在碳酸氢盐解剖缓冲液中成像卵巢，并确保所选设置下pHluorin和mCherry图像的像素强度未饱和。若像素饱和，需相应调整设置。
      注意：显微镜的设置参数可能因所使用的具体显微镜配置而异，必须针对每个实验进行优化。显微镜设置确定后，在实验的其余过程中不得更改。对照组与实验组的设置应保持一致。在我们最初的细胞内pH（pHi）实验中，我们分别生成了两点和三点尼日霉素校准曲线，发现使用两种方法计算出的pHi值无显著差异。然而，通常情况下，增加校准曲线中的数据点数量有望提高测量准确性。因此，我们建议生成包含不同数量数据点的校准曲线，以确定特定实验条件下所需的数据点数目。
  3. 数据采集：
    1. 在碳酸氢盐和尼日里菌素缓冲条件下进行样品的解剖、封片和成像。解剖和封片后，单组样品的成像时间最长不得超过45分钟，以确保荧光强度测量在活体、健康的组织中进行。
    2. 每种条件下，至少采集5个卵原囊的图像。

3. 试验后：图像分析

  1. 测量 FSCs、pFCs 和滤泡细胞中的荧光强度
    1. 背景扣除：
      1. 在 FIJI 中打开未处理的图像，每个通道分别显示在独立窗口中（图 4C）。
      2. 使用矩形工具在 pHluorin 通道窗口中无信号区域绘制感兴趣区域（ROI）。
      3. 可选步骤：设置阈值的下限，以排除强度值低于背景的像素，并将阈值上限设为最大值。以这种方式设置阈值后，图像中无信号的区域主要呈蓝色，而信号则清晰可见（图 4A）。
      4. 测量 ROI 中的平均荧光强度。如果在第 3 步中设置了阈值，请确保在“设置测量”对话框中勾选 "限制为阈值" 选项。
      5. 使用“处理 → 数学”菜单中的“减去”功能，从图像的每个通道和切片中减去测得的背景强度。
      6. 对 mCherry 通道窗口重复步骤 3.1.1.2–6，但在第 3.1.1.2 步中，不要使用矩形工具重新绘制新矩形，而是使用“编辑→ 选择”菜单中的“恢复选区”功能，在图像上添加一个尺寸和位置相同的矩形。
    2. 识别 FSCs、pFCs 和滤泡细胞：
      1. 根据形态和位置，利用刀豆蛋白 A 染色确定细胞边界，从而识别 FSCs、pFCs 和滤泡细胞（图 2）。
      2. FSCs 是位于卵原区边缘、2a/2b 区域交界处的细长三角形细胞。如果在 FSC 克隆中表达 mCherry::pHluorin，则 FSC 也可被识别为克隆中最靠前的细胞。
      3. pFCs 是位于 2b 区域、紧邻并位于 FSC 下游的不规则形状细胞。
      4. 滤泡细胞是位于 3 区域、包围生殖细胞囊的方形或柱状细胞。
    3. 获取荧光强度比值
      1. 选择一个或多个切片，其中目标细胞在 mCherry 通道中的荧光强度最高，并确保在远红通道中观察到的刀豆蛋白 A 染色在所选切片中处于焦点清晰状态。
      2. 围绕每个 FSC 绘制 ROI，并测量所选所有切片中 pHluorin 和 mCherry 的平均荧光强度。
      3. 将 pHluorin 通道的平均荧光强度除以 mCherry 通道的平均荧光强度，计算 pHluorin 与 mCherry 荧光的比值。
  2. 推导 pHi 值并生成伪彩图像
    1. 推导 pHi 值
      1. 在所有情况下，线性回归曲线应使用相同基因型果蝇的卵巢组织数据生成，包括实验组和对照组条件。使用尼日里菌素缓冲液条件下的数据为每种细胞类型生成一条线性回归曲线（图 3）。在 Excel 中，可通过将数据绘制成图表并添加线性趋势线来实现。或者，参见：
      2. 利用尼日里菌素条件计算出的线性回归曲线的斜率和 y 轴截距，结合直线方程（y = mx + b），将碳酸氢盐条件下样本计算出的 pHluorin 与 mCherry 比值转换为 pH 值。在此方程中，将斜率代入 m，y 轴截距代入 b，将比值代入 x，求解 y。
    2. 在 FIJI 中生成反映比值的伪彩图像。
      1. 按照上述背景扣除步骤（步骤 3.1.1 和 图 4）进行操作。
      2. 使用“处理”菜单中的“图像计算器”功能，将 pHluorin 通道除以 mCherry 通道。确保勾选 "创建新窗口" 和 "32 位（浮点）结果" 两个选项。在“图像”菜单下更改查找表（LUT），选择 Thermal 或其他合适的 LUT。其他合适选项参见 图 4。
      3. 在“调整亮度和对比度”对话框（图像 → 调整 → 亮度/对比度）中，点击 "设置" 按钮。将显示的最小值设为 0，最大值设为最能反映数据的比值，通常为 1.0–2.0（图 5）。

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结果

本文描述了测量卵泡上皮细胞内pH值（pHi）的过程，该过程包括多个步骤。首先，使用解剖和封片工具从具有适当基因型的果蝇中解剖出卵巢（图1）。随后，利用定量荧光显微镜对卵泡管进行成像，并对图像进行分析以获得pHi的测量值。对于每幅图像，根据第3.1节所述方法识别出目标细胞类型（图2）。然后，根据标准曲线（图3A）将GFP和mCherry通道的荧光强度比值转换为pHi值，具体方法见第3.2节。通过该方法，我们发现pHi在早期滤泡干细胞（FSC）谱系的分化过程中逐渐升高，从FSCs中的6.8上升到前滤泡细胞中的7.0，再进一步升高至滤泡细胞中的7.3（图3B）。每种细胞类型的pHi值可以以图形方式表示（如图3B所示），也可以用伪彩色显微图像展示pHluorin与mCherry比值的差...

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讨论

本文描述了一种在野生型组织中测量 FSC 谱系细胞内 pH 值（pHi）的方法。该实验方案自我们首次开始研究 Drosophila 卵巢组织中的 pHi 以来，已在过去五年中不断开发和完善。在此期间，本方案已在我们实验室由多名研究人员成功应用，并在至少四种不同的转盘式共聚焦显微镜和激光扫描共聚焦显微镜上实现了可靠操作。在多次实验中，我们均重复验证了原始发现：FSC 谱系中的细胞从干细胞向 pFC 再向滤泡细胞分化的过程中，pHi 逐渐升高。这一结果表明，该生物学现象具有高度稳健性，且实验方法可靠。然而，根据我们的经验，该操作技术较难掌握，要求在每一步骤中都严格注意细节，并快速、熟练地完成解剖、制片和成像操作。如方案所述，解剖与制片过程包含 10 分钟的孵育时间，但整个过程总时长不应超过 15 分钟，成像过程则必须在 45 分钟内完成。在理想条件下，Drosophila 卵管可在体外培养中存活长达 14 小时17，但我们发现，在用于生成标准曲线的尼日霉素（nigericin）缓冲液中，组织死亡速度显著加快。因此，我们的操作指南确保所有数据均在组织仍处于外观...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Bryne Ulmschneider 对本实验方案的贡献，以及 Diane Barber 对稿件提出的建议。本研究由美国国立卫生研究院资助，资助编号为 GM116384，授予 T.G. Nystul 和 D.L. Barber。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
果蝇品系
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyOBloomington Stock Center7023
Act-Gal4 flipout stockBloomington Stock Center4409
名称公司目录编号备注
缓冲液制备用化学品
NaClSigma AldrichS5886
KClSigma AldrichP-3911
葡萄糖Mallinckrodt4912
HEPESThermo Fisher ScientificBP310
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63
CaCl2Sigma AldrichC-5080
HCO3Sigma AldrichS-5761
MgCl2Sigma AldrichM-9272
NMDG+Sigma AldrichM-2004
K2HPO4Mallinckrodt7088用于配制 pH 7.4 的 KHPO4
KH2PO4Thermo Fisher ScientificBP362用于配制 pH 7.4 的 KHPO4
刀豆球蛋白 A，Alexa Fluor 647 标记物Thermo Fisher ScientificC21421稀释至 0.25 mg/ml
尼日利亚菌素Thermo Fisher ScientificN1495
名称公司目录编号备注
解剖与封片工具
2 把 Dumont Inox 镊子（5 号）Thermo Fisher ScientificNC9473431
2 根 23 号针头注射器Sigma AldrichZ192457
9 孔玻璃解剖皿Thermo Fisher Scientific13-748B
真空润滑脂Dow Corning1018817
22 × 40 mm 玻璃盖玻片Thermo Fisher Scientific12545C
圆形玻璃盖玻片，直径 12 mm，厚度 0.13–0.16 mmTed Pella, Inc.26023
三维封片装置定制制造3D 打印用 .stl 和 .ipt 文件作为补充材料提供
名称公司目录编号备注
其他设备
pH 计Thermo Fisher Scientific13-620-183A型号：Accumet AB15
解剖显微镜Olympus Corporation0H11436型号：SZ2-ST
共聚焦显微镜Leica BiosystemsSP5 或 SP8 激光扫描共聚焦显微镜，配备数值孔径为 1.3 的 40× 物镜

参考文献

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活体中卵泡干细胞谱系细胞内pH成像方法 果蝇 卵巢组织
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