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方法文章

检测线粒体膜电位以研究CLIC4敲低诱导的HN4细胞凋亡 体外

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DOI：

10.3791/56317

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2018年7月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2Department of Orthopedics, Anhui Provincial Hospital, Anhui Medical University

本文内容

摘要

本文介绍了一种详细方案，应用罗丹明123检测线粒体膜电位（MMP），并研究CLIC4基因敲低诱导的HN4细胞凋亡 体外在普通荧光显微镜和共聚焦激光扫描荧光显微镜下，记录线粒体膜电位（MMP）的实时变化。

摘要

线粒体膜电位（MMP，ΔΨm）的耗竭被认为是凋亡级联反应中最早发生的事件，甚至早于细胞核的凋亡特征，如染色质浓缩和DNA断裂。一旦MMP崩溃，细胞凋亡将不可逆地启动。一系列亲脂性阳离子染料可穿透细胞膜并在线粒体基质内聚集，作为荧光标记物用于评估MMP的变化。作为Cl- 细胞内氯离子通道（CLIC）家族成员CLIC4主要通过线粒体途径参与细胞凋亡过程。本文详细描述了一种通过监测罗丹明123（Rh123）荧光强度变化来检测线粒体膜电位（MMP）的实验方案，借此研究CLIC4基因敲低所诱导的细胞凋亡。我们详细讨论了共聚焦激光扫描显微镜与普通荧光显微镜在该方法应用中的优缺点，并与其他检测方法进行了比较。

引言

Rh123 是一种阳离子型荧光染料，可作为跨膜电位的指示剂。Rh123 能够穿透细胞膜，并根据膜内外的电位差进入线粒体基质1。细胞凋亡会导致线粒体膜完整性的破坏，线粒体通透性转换孔（MPTP）将打开，引起线粒体膜电位（MMP）的崩溃，进而导致 Rh123 从线粒体内释放到外部。最终，在荧光显微镜下可检测到更强的绿色荧光信号。已有充分文献证实，MMP 的降低和膜通透性的升高是细胞凋亡的早期标志2。因此，Rh123 可用于检测 MMP 的变化以及细胞凋亡的发生。

头颈部癌是全球第六大常见癌，严重损害人类健康3。尽管近年来已发展出多种治疗方法，但头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的临床治疗效果仍不理想4。探索新的治疗手段有助于改善HNSCC的治疗效果5。离子通道参与多种生物学过程，在多种癌症的发生发展中发挥重要作用6。氯离子（Cl-）通道的部分或完全参与与肿瘤转化的多种特性密切相关，包括活跃迁移、高增殖率和侵袭性。基于此，CLIC家族作为一种新型蛋白质家族，已被列为癌症治疗中具有前景的治疗靶点之一6,7。近期研究表明，CLIC家族成员（包括CLIC1、CLIC4和CLIC5）定位于心肌线粒体，且CLIC5可上调活性氧（ROS）水平，提示线粒体定位的Cl-通道在细胞凋亡反应中具有功能作用8。CLIC4是CLIC家族成员之一（亦称为mtCLIC、P64H1和RS43），在癌细胞中的凋亡调控功能及其在人角质形成细胞中的亚细胞定位（如高尔基体、内质网和线粒体）方面研究最为广泛7,9,10。CLIC4的表达谱受肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、P53及外界刺激的调控。CLIC4的过表达或下调主要通过线粒体途径引发细胞凋亡反应，伴随Bcl-2家族成员失衡、caspase级联反应的激活以及细胞色素C的释放11,12,13。因此，线粒体膜电位（MMP）的检测对于研究CLIC4相关的凋亡过程至关重要，而Rh123是一种理想的荧光指示剂。

本研究描述了一种检测线粒体膜电位（MMP）的详细方案，用于研究CLIC4基因敲低诱导的HN4细胞凋亡。采用Rh123作为荧光探针观察MMP的变化。通过普通荧光显微镜和共聚焦激光扫描荧光显微镜，可解析MMP的实时波动。本文详细讨论了共聚焦激光扫描荧光显微镜在应用中的优势与局限性，并将其与其他方法进行了比较。该方案也可应用于其他与细胞凋亡相关的研究。

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方案

1. 细胞培养与转染

  1. 细胞培养
    注意：HN4 是一种头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系，来源于 HNSCC 患者14。
    1. 将 HN4 细胞培养于添加 10% 胎牛血清及抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖）中。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞。
  2. 细胞转染
    1. 转染前一天，将 5 × 105 个细胞接种于 6 孔板中，每孔加入 2 mL 不含抗生素的培养基。
    2. 将 100 pmol CLIC4 siRNA 或乱序 siRNA 轻柔地溶于 250 µL 低血清培养基中。将 5 µL 脂质体试剂溶于 250 µL 低血清培养基中，室温孵育 5 分钟。将稀释后的 siRNA 与稀释后的脂质体试剂混合，轻柔混匀，并在室温下孵育 20 分钟。
    3. 将混合物加入含细胞和培养基的各孔中，通过前后轻轻摇动培养板混匀。在 CO2 培养箱中 37 °C 孵育 24 小时后，进行后续 Rh123 标记操作。转染 4 小时后更换为正常生长培养基。

2. Rh123 标记

注意：Rh123 用于检测 HN4 细胞中的线粒体膜电位（MMP）1。

  1. CLIC4 siRNA 处理后（第 1 节），使用 6 孔板中的 HN4 细胞进行以下处理。每孔 HN4 细胞的数量足以在盖玻片上重复实验 10 次。
  2. 使用镊子将圆形盖玻片放置于新的 12 孔板底部。板的数量根据实验设计确定（图 1A）。
  3. 在 12 孔板内每张盖玻片中央加入 150 µL 浓度为 100 µg/mL 的多聚赖氨酸，静置 2 分钟。注意避免将多聚赖氨酸滴加至盖玻片外。随后用移液器彻底吸除多聚赖氨酸（图 1B）。
  4. 吸除培养皿中 HN4 细胞的培养基，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶以消化细胞。6 分钟后，加入 2 mL 培养基中和胰蛋白酶。用移液器轻轻吹打细胞 5 次，混匀后将 2 - 6 × 104 个细胞接种至圆形盖玻片上。置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养（图 1C）。
  5. 培养 8 小时后，在 37 °C 条件下用 2 µmol/L Rh123 孵育 HN4 细胞 40 分钟。轻轻上下吹打培养基数次，确保 Rh123 在培养基中分布均匀（图 1D）。
  6. 配制足量的正常生理盐水溶液（NPSS）；NPSS 配方（单位：mmol/L）：140 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、1 CaCl2、10 葡萄糖和 5 HEPES，pH 7.4。在水浴中预热至 37 °C。
  7. 用镊子取出盖玻片，通过将盖玻片短暂浸入预热的 NPSS 缓冲液中以洗去残留液体（图 1E）。
  8. 将盖玻片置于 500 µL 不锈钢腔室（见材料表）底部，该腔室底部为可更换的 25 mm 玻璃盖玻片，并由 O 形圈密封固定。通过拧紧腔室盖子将其固定（图 1E）。
  9. 向组装好的腔室中加入 450 µL 预热的 NPSS 缓冲液，并将腔室置于荧光显微镜或共聚焦激光扫描荧光显微镜的视野下（图 1E）。

3. MMP 的检测

  1. 普通荧光显微镜
    1. 按照制造商的说明开启荧光显微镜。
      注：本实验所用普通荧光显微镜配备汞灯光纤光源，使用FITC滤光片组检测Rh123（激发滤光片480/40，二向色镜505 LP，发射滤光片535/40），室温下进行活细胞成像，物镜为20X 。
    2. 打开成像系统软件，从命令栏中选择"新建"按钮以开始新实验（图2A）。
    3. 调节视野和焦距，在明场光下找到细胞位置。
    4. 关闭明场光源，按下按钮关闭白光。点击命令栏中的"对焦"按钮，并选择"开始对焦"以开启荧光。通过显微镜使用507 nm激发波长和529 nm长通发射波长（实验前已设定）再次定位细胞。如有需要，再次调整视野和焦距（图2B）。
    5. 选择一个仅包含20至30个分离良好的HN4细胞的视野。每个细胞内荧光信号的变化将被准确记录。
    6. 当获得清晰视野后，点击对焦栏中的"关闭对焦"。点击命令栏中的"单次采集"以获取一组图像。点击命令栏中的"区域"，然后点击"确定"按钮以编辑测量区域。
      注：在“编辑区域”栏中，可根据研究需求选择不同的区域形状。
    7. 为适应不同形状的单个细胞，选择"轨迹区域"工具，围绕单个细胞画出区域，完成后双击。重复此操作直至所有细胞均被圈出（图2C）。点击"完成"，并选择"保存图像"以查找保存位置。
    8. 点击"归零计时"，并迅速按下F4键以开始监测荧光强度变化。每5秒记录一次荧光强度的实时变化，持续5分钟（图2D）。
    9. 当基线趋于稳定时，使用移液器向样品室加入50 µL NPSS与0.5 µL 100 mmol/L ATP的混合液。注意不要触碰样品室，以免视野偏移（图2E）。
      注：荧光图像将连续记录20分钟，之后可通过手动操作结束实验。通常将记录时长设为20分钟，以便观察完整的荧光变化过程。然而，若出现意外因素影响曲线稳定性，或整个过程少于20分钟，可提前手动停止采集。
  2. 共聚焦激光扫描荧光显微镜
    1. 按照制造商的说明开启共聚焦激光扫描荧光显微镜，并打开配套软件。
      注：本实验中Rh123由488 nm氩离子激光激发，发射信号通过TD488/543/633滤光片在545–700 nm范围内采集。
    2. 在"采集"菜单下点击"物镜"，选择63X/1.4 N.A.油镜。观察样品，在明场下找到清晰的视野。
    3. 按下"透射/落射照明（TL/IL）"按钮切换至荧光模式，并选择正确的荧光滤光片，通过显微镜在暗视野下定位细胞。观察完成后按下"快门（SHUTTER）"以保护样品。
    4. 在"采集"菜单下，调节合适的PMT通道，点击"应用"以激活已设定的光路（图3A）。点击"配置"菜单，选择"激光"以确定所需激光类型。本实验推荐使用"氩离子（Argon）"激光（图3B）。
    5. 点击"实时成像（Live）"获取实时图像，并确保视野中仅包含20至30个分离良好的HN4细胞。每个细胞内荧光信号的变化将被准确记录。
    6. 在"采集"菜单下的"采集模式"中选择"xyt"模式（图3C）。将时间间隔设为5秒，持续时间设为20分钟。所有参数设置完成后点击"应用"。
    7. 在"定量分析（Quantify）"菜单下，使用"绘制多段线（Draw Polyline）"工具圈定每个细胞的记录区域。选择"线轮廓（Line Profile）"并点击"开始（Start）"进行观察。记录5分钟内荧光强度的实时变化（图3D - E）。
    8. 当基线趋于稳定时，使用移液器向样品室加入50 µL NPSS与0.5 µL 100 mmol/L ATP的混合液。注意不要触碰样品室，以免视野偏移。
      注：荧光图像将连续记录20分钟，之后实验自动完成。

4. 统计分析

  1. 普通荧光显微镜
    1. 按照操作手册常规开启荧光显微镜。打开成像系统软件，从命令栏中选择"打开"按钮以载入已保存的实验。点击“命令栏”中的"区域"，然后点击"确定"按钮以编辑测量区域。
    2. 选择"轨迹区域"工具，圈选单个细胞的区域，完成后双击。重复此操作直至所有细胞均被圈选。点击"完成"，然后选择"F4：前进"按钮以获得显示荧光强度变化的轨迹。
    3. 完成后，点击图形右下角的向下箭头按钮，然后点击"显示图表数据"（图2F）。连续点击"确定"两次，选择"记录数据"按钮以打开数据处理软件界面。再次点击"记录数据"，即可在电子表格中看到实时荧光强度波动的记录。
      注：对于每个细胞，线粒体膜电位（MMP）的变化以施加ATP或TG前后的荧光强度比值（F1/F0）表示。每个荧光强度数据均为20–30个细胞的平均值。Rh123的数据以均值±标准误（SE）表示。两组间结果采用双尾独立样本t检验进行比较，P值<0.05被认为具有统计学显著性。本实验使用统计分析软件进行数据分析。
  2. 共聚焦激光扫描荧光显微镜
    1. 开启共聚焦激光显微镜，并根据制造商说明登录配套软件。
    2. 选择"启动"以打开已记录的实验。
    3. 在"定量"菜单下选择"层析轮廓"工具，在"按通道和感兴趣区域排序图表"中选择"全部合并"。
    4. 使用"绘制多边形"工具圈选出用于观察的细胞区域。
    5. 选择"图表"菜单，右键单击并选择"导出至Excel"，将荧光强度数值添加到电子表格中。后续分析与普通荧光显微镜一致（图3F）。

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结果

在本研究中，使用Rh123检测线粒体膜电位（MMP）。首先，培养HN4细胞以进行后续荧光染色实验。用镊子将圆形盖玻片放置于6孔板底部（图1A）。盖玻片用多聚赖氨酸孵育5分钟，随后用移液器吸除多聚赖氨酸溶液（图1B）。然后将HN4细胞经胰酶消化后接种至置于6孔板底部的盖玻片上。接着加入适量Rh123并充分混匀（图1C-D）。用预热的NPSS洗涤后，将盖玻片装配至观察室中，并加入适量NPSS以进行后续实验（图1E）。

罗丹明123（Rh123）染色后，使用普通荧光显微镜和共聚焦显微镜结合...

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讨论

已有充分文献记载，Cl− 通道在维持内环境稳态中起着至关重要的作用，并在细胞增殖与凋亡过程中发挥重要功能15,16。因此，深入理解离子通道靶向干预与细胞凋亡之间的关系，对于探索多种癌症更有效的治疗策略具有迫切需求和重要意义17。线粒体维持细胞正常的生物学状态，其功能与其膜通透性和跨膜电位密切相关。除癌症外，越来越多的神经病理学研究表明，线粒体功能异常与肌病、心血管疾病以及包括感音神经性耳聋、小脑共济失调、痴呆和癫痫在内的神经系统症状相关18,19。上述发现推动了以线粒体为靶点的干预研究，旨在改善临床治疗效果。Rh123 是一种靶向线粒体的荧光染料，能够穿透细胞膜，作为通用荧光探针用于检测线粒体膜电位（MMP）。在细胞凋亡早期，线粒体通透性转换孔（MPTP）开放，导致线粒体膜通透性升高，Rh123 由此释放至线粒体外，最终可检测到更强的绿...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们谨向房超先生致以诚挚的谢意，感谢其在细胞培养方面提供的帮助。本研究工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号：81570403，81371284）、安徽省自然科学基金（项目编号：1408085MH158）、安徽医科大学杰出青年基金以及安徽省高校优秀青年人才支持计划项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞ATCCCRL-3241
多聚赖氨酸Thermo Fisher ScientificP4981
人CLIC4特异性siRNABiomicsNM_013943（登录号NM_013943；对应cDNA序列
5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3）以及乱序siRNA（5-ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3）由Biomics公司设计并提供
Lipofectamine 2000 转染试剂 Thermo Fisher ScientificL3000-015
Opti-MEM I 低血清培养基，含GlutaMAXThermo Fisher Scientific51985-042
罗丹明123，FluoroPure级Thermo Fisher ScientificR22420
Dulbecco’s改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L葡萄糖）Gibco11965-084
胎牛血清，经鉴定，澳大利亚来源Gibco10099141
胰蛋白酶-EDTA溶液BeyotimeC0201
抗生素-抗真菌剂，100XGibco15240062
激光扫描共聚焦显微镜Leica Microsystems GmbHLEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 倒置显微镜NikonN/A
Metaflour，V7.5.0.0Universal Imaging CorporationN/A
Leica 应用套件，v2.6.0.7266Leica Microsystems GmbHN/A
Microsoft Office Excel 2007MicrosoftN/A
Sigma Plot 12.5Systat SoftwareN/A
Attofluor 细胞培养腔室Thermo Fisher ScientificA7816

参考文献

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