检测线粒体膜电位以研究CLIC4敲低诱导的HN4细胞凋亡 体外

摘要

本文介绍了一种详细方案，应用罗丹明123检测线粒体膜电位（MMP），并研究CLIC4基因敲低诱导的HN4细胞凋亡 体外在普通荧光显微镜和共聚焦激光扫描荧光显微镜下，记录线粒体膜电位（MMP）的实时变化。

摘要

线粒体膜电位（MMP，ΔΨm）的耗竭被认为是凋亡级联反应中最早发生的事件，甚至早于细胞核的凋亡特征，如染色质浓缩和DNA断裂。一旦MMP崩溃，细胞凋亡将不可逆地启动。一系列亲脂性阳离子染料可穿透细胞膜并在线粒体基质内聚集，作为荧光标记物用于评估MMP的变化。作为Cl^- 细胞内氯离子通道（CLIC）家族成员CLIC4主要通过线粒体途径参与细胞凋亡过程。本文详细描述了一种通过监测罗丹明123（Rh123）荧光强度变化来检测线粒体膜电位（MMP）的实验方案，借此研究CLIC4基因敲低所诱导的细胞凋亡。我们详细讨论了共聚焦激光扫描显微镜与普通荧光显微镜在该方法应用中的优缺点，并与其他检测方法进行了比较。

引言

Rh123 是一种阳离子型荧光染料，可作为跨膜电位的指示剂。Rh123 能够穿透细胞膜，并根据膜内外的电位差进入线粒体基质¹。细胞凋亡会导致线粒体膜完整性的破坏，线粒体通透性转换孔（MPTP）将打开，引起线粒体膜电位（MMP）的崩溃，进而导致 Rh123 从线粒体内释放到外部。最终，在荧光显微镜下可检测到更强的绿色荧光信号。已有充分文献证实，MMP 的降低和膜通透性的升高是细胞凋亡的早期标志²。因此，Rh123 可用于检测 MMP 的变化以及细胞凋亡的发生。

头颈部癌是全球第六大常见癌，严重损害人类健康³。尽管近年来已发展出多种治疗方法，但头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的临床治疗效果仍不理想⁴。探索新的治疗手段有助于改善HNSCC的治疗效果⁵。离子通道参与多种生物学过程，在多种癌症的发生发展中发挥重要作用⁶。氯离子（Cl^-）通道的部分或完全参与与肿瘤转化的多种特性密切相关，包括活跃迁移、高增殖率和侵袭性。基于此，CLIC家族作为一种新型蛋白质家族，已被列为癌症治疗中具有前景的治疗靶点之一^6,

方案

1. 细胞培养与转染

1. 细胞培养
   注意：HN4 是一种头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞系，来源于 HNSCC 患者¹⁴。
   1. 将 HN4 细胞培养于添加 10% 胎牛血清及抗生素（100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L 葡萄糖）中。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞。
2. 细胞转染
   1. 转染前一天，将 5 × 10⁵ 个细胞接种于 6 孔板中，每孔加入 2 mL 不含抗生素的培养基。
   2. 将 100 pmol CLIC4 siRNA 或乱序 siRNA 轻柔地溶于 250 µL 低血清培养基中。将 5 µL 脂质体试剂溶于 250 µL 低血清培养基中，室温孵育 5 分钟。将稀释后的 siRNA 与稀释后的脂质体试剂混合，轻柔混匀，并在室温下孵育 20 分钟。
   3. 将混合物加入含细胞和培养基的各孔中，通过前后轻轻摇动培养板混匀。在 CO₂ 培养箱中 37 °C 孵育 24 小时后，进行后续 Rh123 标记操作。转染 4 小时后更换为正常生长培养基。

结果

在本研究中，使用Rh123检测线粒体膜电位（MMP）。首先，培养HN4细胞以进行后续荧光染色实验。用镊子将圆形盖玻片放置于6孔板底部（图1A）。盖玻片用多聚赖氨酸孵育5分钟，随后用移液器吸除多聚赖氨酸溶液（图1B）。然后将HN4细胞经胰酶消化后接种至置于6孔板底部的盖玻片上。接着加入适量Rh123并充分混匀（图1C-D）。用预热的NPSS洗涤后，将盖玻片装入观察室中，并加入适量NPSS以进行后续实验（图1E）。

Rh123染色完成后，使用普通荧光显微镜和共聚焦显微镜结合不同的步骤与软.......

讨论

已有充分文献记载，Cl⁻ 通道在维持内环境稳态中起着至关重要的作用，并在细胞增殖与凋亡过程中发挥重要功能^15,16。因此，深入理解离子通道靶向干预与细胞凋亡之间的关系，对于探索多种癌症更有效的治疗策略具有迫切需求和重要意义¹⁷。线粒体维持细胞正常的生物学状态，其功能与其膜通透性和跨膜电位密切相关。除癌症外，越来越多的神经病理学研究表明，线粒体功能异常与肌病、心血管疾病以及包括感音神经性耳聋、小脑共济失调、痴呆和癫痫在内的神经系统症状相关^18,19。上述发现推动了以线粒体为靶点的干预研究，旨在改善临床治疗效果。Rh123 是一种靶向线粒体的荧光染料，能够穿透细胞膜，作为通用荧光探针用于检测线粒体膜电位（MMP）。在细胞凋亡早期，线粒体通透性转换孔（MPTP）开放，导致线粒体膜通透性升高，Rh123 由此释放至线粒体外，最终可检测到更强的绿.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞	ATCC	CRL-3241
多聚赖氨酸	Thermo Fisher Scientific	P4981
人CLIC4特异性siRNA	Biomics	NM_013943	（登录号NM_013943；对应cDNA序列 5-GCTGAAGGAGGAGGACAAAGA-3）以及乱序siRNA（5-ACGCGUAACGCGGGAAUUU-3）由Biomics公司设计并提供
Lipofectamine 2000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000-015
Opti-MEM I 低血清培养基，含GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	51985-042
罗丹明123，FluoroPure级	Thermo Fisher Scientific	R22420
Dulbecco’s改良伊格尔培养基（DMEM，4.5 g/L葡萄糖）	Gibco	11965-084
胎牛血清，经鉴定，澳大利亚来源	Gibco	10099141
胰蛋白酶-EDTA溶液	Beyotime	C0201
抗生素-抗真菌剂，100X	Gibco	15240062
激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems GmbH	LEICA.SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300 倒置显微镜	Nikon	N/A
Metaflour，V7.5.0.0	Universal Imaging Corporation	N/A
Leica 应用套件，v2.6.0.7266	Leica Microsystems GmbH	N/A
Microsoft Office Excel 2007	Microsoft	N/A
Sigma Plot 12.5	Systat Software	N/A
Attofluor 细胞培养腔室	Thermo Fisher Scientific	A7816